Protocol
動物使用プロトコルはアルバータ大学の健康科学動物管理使用委員会によって承認された。
楽器、動物および手術のセットアップの調製
- 手続きの前に、すべての固形食24 hrの新しい、クリーンなケージ不在に動物を転送します。彼らは、手続きの時間になるまで水に自由にアクセスし、液体ダイエットアドリブを持っている場合があります。
- 手続きに必要なすべての楽器をオートクレーブ。クリーン操作面、70％エタノールで麻酔ノーズコーン。
- 執刀医のための快適な方法で手術用顕微鏡、麻酔器や電源で操作面を設定します。外科医の肘、手と用具を遮るもののない腕で、手術台の上で快適休ませなければならない。楽器、縫合糸、綿棒、および10ミリリットルの注射器は、手順の間に簡単にアクセスを許可した場所に配置する必要があります。
- セットアップオーバーヘッド加熱ランプは、操作面の手順と光の間の動物のための暖かさの両方を提供する。
- 0.9％食塩水で50ml円錐管、および操作面の近くにワセリンと場所との1.5mlチューブを埋める。
注：すべての楽器や外科用品を滅菌する。腸が離断されているので、手続き自体は無菌ではありません。これは、クリーンで汚染されたと考えられている。感染の外因性源の導入を回避するための措置をとる。
吻合2.回結腸切除術
- 動物の呼吸数が約30〜40回/分に減速するまで、イソフルラン気化器からノーズコーンを介して、2リットル/分の酸素流量で4％イソフルランを投与することにより麻酔を誘導する。手順を開始する前に、痛みの応答がないことを確認するには、マウスの後肢足に適度な圧力を適用します。この時点で、0.5L /分に2％イソフルランと酸素の流れを下げてください。断続的に処置中に痛みの応答を確認し、それに応じて、イソフルラン流量を調節。
- 手術中の乾燥を防止し、透明テープを用いて固定手足と仰臥位でマウスを固定化するために眼にワセリンを適用する。
- povodine /ヨウ素溶液で腹部をきれいにし、新しい滅菌手袋に着替える。
- 筋膜と腹膜を露出するためにハサミを解剖鋭いポイントを使用して腹部の上部正中1.5センチの皮膚切開を行います。腹膜内容を公開する白線を通して同様の方法で筋膜/腹膜層を開きます。
- ヒトとは対照的に、マウスの盲腸は、典型的には、腹部の左上腹部に見られる。特定されたら、優しく鉗子で盲腸を把握し、切開を通してそれを実現します。腹部の表面にドレープ滅菌ガーゼ（ 図1A）上で盲腸から延びるファンアウトに回腸末端の約3cmを湿らせた綿棒を使用してください。暴露腸がプロシージャの全体の間に0.9％生理食塩水で湿った保たれていることを確認。
- 手術用顕微鏡を用いて、コロン（ 図1A）に沿って上腸間膜動脈から分岐回盲動脈を識別します。回盲動脈に隣接する無血管組織を切開、5-0絹のネクタイで動脈を包囲し、連結する。次に、回腸末端に地域の血液供給を見つけ、回盲部に離断点1.5-2センチ近位の順に選択します。上記のように回腸のこのセクションに枝を結紮。はさみを解剖ミクロと動脈を分割します。
- 離断終了する（ 図1B）に十分な血液供給があるの確保回腸および結腸の虚血性部分を分ける。それはより密接にコロンと一致するように内腔の直径を増加させるために30度の角度で分割して回腸をへらすることがしばしば有用である。腸の回盲部が除去されて、一度、整列各腸間膜の国境を確保ガーゼ上の回腸および結腸の離断端は、整列している。
- 8-0ポリプロピレン縫合糸（ 図1C）を使用して中断し、コロンの離断最後に回腸の離断終わりを近似することにより吻合を構築します。最初のステッチは、回結腸吻合水密になるまで、すべての0.5ミリメートルを置いその後の縫合糸で、腸間膜の国境に配置されます。回腸および結腸を通して縫合針を渡すとき、切り口がロールバックされていないことを確認し、針に刺されは、腸の切断端から0.5ミリメートルである。典型的な吻合は14から16に中断縫合が必要になります。吻合を通じて内容を強制的に回腸遠位の上、綿棒の近位を圧延することにより完了時に吻合の整合性と開存性をテストします。小腸の内容は自由に吻合漏れなく結腸に渡す必要があります。
- 10ミリリットルの注射器から0.9％食塩水3〜4 mlの暴露腸をすすぐ腸の表面から糞便を洗い流し、および腹腔内に戻って腸を提供します。 0.9％生理食塩水2 mlを用いて、腹膜腔を洗浄し、次いで横方向に腹壁に穏やかな圧力を適用することによって、この流体を排出する。
- 3-0絹ランニング縫合糸で切開を閉じ、イソフルランの流れを中止してください。術後疼痛管理のために-buprenorphine-皮下に長時間作用性アヘン剤の0.1 mg / kgをを管理します。
- 彼らがモバイルになるまで継続的に温めてケージに転送した後、熱ランプの下で動物を観察します。
3.術後ケアとモニタリング
- その日の残りのための苦痛の徴候のために継続的に温めケージに動物を監視します。背中流動食と水アドリブへのアクセス権を持つ新たな無菌ケージ内の動物飼育施設に動物を転送します。動物は3-4の群で収容することができる。
- 翌朝術後動物のチェックを実行し、動物は苦痛には表示されないように。唯一の流動食を供給。彼らは不快に表示された場合（ すなわち、猫背の姿勢、または最小活性）皮下ブプレノルフィンの追加の用量を投与。術後1日目の午後に一回より多くの動物に確認してください。
- 術後2日目の朝に動物が完全に回復し表示されるはずです。食料消費とstoolingの証拠は回復の明るい兆しである。さて、動物用固形飼料食を再開します。
注：苦痛の徴候は猫背の姿勢、貧しいグルーミング、および最小限のアクティビティが含まれます。苦痛の徴候が顕著である場合には、動物を安楽死させなければならない。 - 動物が足圧に反応しないようになるまで2 L / minのO 2流量で4％イソフルランで深く麻酔を誘発することによって動物を安楽死させる。頸椎脱臼を行い、適切な安楽死の兆候を観察する。
- ガイドラインは異なりますので、適応症に関する機関の勧告を参照してください。用とマウスでの安楽死の適切な方法。
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Representative Results
死亡率と体重変化術後。
129S1野生型マウスをICRに続く死亡率は〜5％、一般的である。道徳の最も一般的な原因は、吻合で腸閉塞である。死亡率の他の原因は、吻合部の漏れや閉塞を腸につながる内部ヘルニアが含まれています。
体重減少は術後14日まで見られるが、一般的に非有意であることができます。マウスが完全に術後28日目（ 図2）によって術前体重を回復する傾向がある。
技術の転写
新しい大学院生（BM）は、以前の外科的訓練を受けたオペレータはテクニックを学ぶことができるかどうかを判断するためのICR手順を実行するために教えられた。訓練は、8-0ナイロン縫合糸を使用して吻合に使用されるものと類似の単一結節縫合を実行する方法を学ぶことから始まりました。縫合糸は、ラテックスGLOまたがっ切開を閉じるために行われたVEの。 BMは効率的に裂けることなく手袋を通して縫合糸を配置することができた後、彼らはいずれかを試みる前に、3つの完全な手順を観察した。最初の手順が完了した後、それらは、別の手順を観察し、さらに2つを試みた。完成した3匹の動物のうち、最後の二つは生き残り、繁栄するようになった。最初の動物に起因吻合での合併症に安楽死させた。
回結腸切除術および吻合図1.ステージ。腹部の外に配信腸の（A）回盲部。黒い矢印は、破線はコロンと回腸末端のために離断点を示し、ライゲートさせるべき血管を示している。 （B）を除去回盲部は、腸の切断端部は、残りの血液供給は、黒の矢印によって示される、整列される。 （C）完了回結腸アナスtomosis。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マン·ホイットニーU統計的検定によって決定されるように、ベースラインで、図2動物の体重は、手術後14日目および術後28日目に体重の有意な変化は、後手順を認められなかった。 ICR（回結腸切除群）、コントロール（非動作制御）する。
腸組織を通して縫合糸の図3.代表パス。H＆Eは、回腸（右）とコロン（左）縫合NEの軌跡を実証するために並んでいるの組織切片を染色組織を通してedle（破線）の点（b）にまで（a）の時点で開始する。結び目は、（c）の時点で接続しなければなりません。あまり粘膜が他の組織よりも吻合に含まれていることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ICRマウスは、腸疾患における手術の効果を研究するために使用できる強力なモデルである。この記事では、95％の成功率と28日後の手順まで安定重みによって反映されるように成長障害と問題なくマウスではICRを行う方法を説明しています。成功したICRへの最も重大な課題は、吻合と吻合リークで腸閉塞を避けることが含まれる。
閉塞を防ぐための手術への技術要素は吻合で内腔の直径の最大化を目的としている。離断点における回腸のスパチュラは、 図1Aに示すように30度の角度で腸を分割して管腔直径を増大させる。縫合針と腸組織の咬傷をとる場合には、腸の端部にアンロールし、約0.5mmの切断端から針を通過させることが不可欠である。組織の過大刺さは、内腔を狭めます。 AVするオプション吻合を構築するキールナンら 15によって記載されるように消化性ステントの使用を採用することであるoidは管腔狭窄。障害物を回避するための非技術的な側面が十分に小さい縫合糸4を選択し、手術前と手術後2日以内に1日、動物に流動食を供給することによりかさばる管腔内容を避けることが含まれる。
術後死亡率の第二の最も一般的な原因は、吻合部の漏れである。この合併症を回避することは、腸吻合の原則を厳守する必要があります。一番乗り十分な血液供給。切除された腸の領域に血液を供給する血管が結紮された後、腸を視覚的に前に離断に点検してください。腸の虚血性セグメントは薄暗い表示されます。これは完全に健康的なエッジを残して除去されるべきである。これは、残りの腸の切断端から少量の出血を可視化することが重要である。水タイトアナスtomosisは、敗血症に至る管腔内容物の流出を避けるためにも不可欠である。これは、縫合糸の間に大きなギャップを回避し、かつ腸のすべての層がステッチ（ 図3）に含まれていることを保証することによって達成される。巻か強度が大幅に最初の二つの術後日間で減少している、このように適切に配置縫合糸は強度16,17を提供することが不可欠です。不注意だけ粘膜などの粘膜を含めている潜在的な落とし穴は、離断大腸の内腔の外にしわができます。これは、漿膜の切り口を可視化し、静かに鉗子で管腔への脱出粘膜を低減することによって回避することができる。
偽の外科手術のコントロールは、外科的ストレス、腸の操作、および/または、回盲弁の損失の潜在的な交絡効果を制御するためのICRモデルを用いた研究の実験設計において考慮されるべきである。偽手順の選択はで求められている主要な問題に依存することになる研究。研究の目的は、回盲弁を失った後、宿主応答を評価することである場合、それは代わりに、回盲弁を残したまま腸吻合が行われる偽手術群を含むことが賢明であろう。これは、典型的切除、その後回結腸吻合7,11と同じ方法で小腸の吻合を実行せずに小腸を離断することにより行われる。これは研究者は、腸吻合の影響を制御することにより、特に盲弁の損失の影響についてコメントすることを可能にする。別の方法としての目標は、回盲弁の損失に特にコメントすることなく腸切除および吻合の影響を研究するためだけであれば、その後偽手術は、開腹を含めるべきであり、腸は、ICRの場合と同じように扱われますが、離断なしべきであると吻合。これは、外科的ストレスと腸の操作のために制御する。に記載された技術プロトコルは、上記の簡単に偽の手順を実行するために適合させることができる。
このプロトコルは、回腸末端と盲腸の全体1.5-2センチ取り除き回結腸切除術を、説明し、密接に頻繁に回結腸クローン病の患者で行われた操作を模倣。 - / -マウスは、クローン病の再発7,11に類似した小腸自発炎症および線維症を開発した後の大腸炎モデルは同様の手順をIL-10で使用されてきた。この手順の原理は、疾患の他のモデルに適用される場合があります。回結腸吻合と小腸の50％を除去することにより、マウスモデルは、短腸症候群4-6適応腸の成長応答を調査するために使用されている。将来的には、これはまた、結腸直腸癌における手術の全身および局所的効果を研究するための有用なモデルになることがあります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
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