Protocol
동물 사용 프로토콜은 알버타 대학의 건강 과학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
악기, 동물, 수술 설치 1. 준비
- 절차 이전에 모든 고체 음식 24 시간의 새로운, 깨끗한 케이지 결석에 동물을 전송합니다. 그들은 절차의 시간 동안 물에 자유롭게 접근하고, 액체 다이어트 적량을 가질 수있다.
- 절차에 필요한 모든 악기를 압력솥. 클린 운영면과 70 % 에탄올로 마취 코 콘.
- 운영 외과 의사를위한 편안한 방식으로 운영 현미경, 마취 기계 및 소모품과 운영면을 설정합니다. 외과 의사의 팔꿈치는 손과 장비에 의해 방해받지 팔, 운영 테이블에 편안하게 휴식을 허용해야합니다. 악기, 봉합, 면봉, 그리고 10 ML의 주사기는 절차를 수행하는 동안 쉽게 액세스를 허용하는 위치에 배치해야합니다.
- 설정열 헤드 램프는 조작면에 대한 절차와 빛이 동안 동물 용 온기를 모두 제공한다.
- 0.9 % 식염수 50 ML 원뿔 튜브 및 운영 표면 근처 석유 젤리 및 장소 1.5 ML 튜브를 입력합니다.
참고 : 모든 악기와 수술 용품을 소독. 소장이 가로로되어 있기 때문에, 절차 자체 멸균 아니다. 그것은 깨끗하고 오염 된 것으로 간주됩니다. 감염의 외생 소스의 도입을 방지 할 수있는 조치를 취하십시오.
문합 2. Ileocolic 절제술
- 동물의 호흡 속도가 약 30 내지 40 호흡 / 분까지 저하 이소 플루 란 기화기로부터 노즈콘을 통해 / 분 2 L의 산소 유량을 갖는 4 % 이소 플루 란을 투여하여 마취를 유도한다. 절차를 시작하기 전에 고통의 응답이없는 보장하기 위해 마우스의 뒷발에 적당한 압력을 적용합니다. 이 시점에서, / 분으로 0.5 L로 2 % 이소 플루 란과 산소 흐름을 거절. 간헐적으로절차 동안 통증 반응을 확인하고 그에 따라 이소 플루 유량을 조정한다.
- 수술 중 건조를 방지하고, 투명 테이프를 사용하여 보호 사지와 부정사 위치에 마우스를 고정하기 위해 눈에 바셀린을 적용합니다.
- povodine / 요오드 용액으로 복부를 청소하고, 새로운 멸균 장갑으로 변경합니다.
- 근막과 복막을 노출 가위를 해부 날카로운 포인트를 사용하여 복부의 상단 중간 선에서 1.5 cm의 피부 절개를합니다. 복막 내용을 노출하는 원격 교육의 알바를 통해 비슷한 방식으로 근막 / 복막 계층을 엽니 다.
- 인간 대조적으로, 마우스는 일반적으로 맹장 복부 좌상 사분면에 발견된다. 확인되면, 부드럽게 집게로 맹장을 잡고 절개를 통해 제공합니다. 팬에 적신 면봉을 사용하여 밖으로 약 복부 표면 (그림 1A)에 드리 워진 멸균 거즈를 통해 맹장에서 연장 회장 말단의 3cm.노출 된 창자가 절차의 전체 중 0.9 % 식염수와 습기가 유지되어 있는지 확인합니다.
- 운영 현미경을 사용하여 콜론 (그림 1A)를 따라 상 장간막 동맥 떨어져 분기 회맹 동맥을 확인합니다. , 회맹 동맥에 인접한 무 혈관 조직을 해부 둘러싸고 5-0 실크 넥타이와 동맥을 결찰. 다음으로, 회장 말단에 지역 혈액 공급을 찾아 회맹 접합에 절개 포인트 1.5 형상 관리 근위을 선택합니다. 위와 회장의이 부분에 가지를 결찰. 마이크로 가위를 해부와 동맥을 나눈다.
- 가로로 끝 (그림 1B)에 충분한 혈액 공급이 보장 회장과 대장의 허혈성 부분을 나눈다. 그것은 더 밀접하게 일치하도록 결장 내강의 직경을 증가시키기 위해 30도 각도로 분할하여 회장을 주걱 것이 종종 도움이된다. 창자 회맹 부분이 제거 된 후, 정렬각각의 장간막 국경을 보장 거즈에 회장과 대장의 가로로 끝이 정렬됩니다.
- 사용 대장의 가로로 마지막에 회장의 가로로 끝을 근사하여 문합 구축은 8-0 폴리 프로필렌 봉합사 (그림 1C)를 중단. Ileocolic 문합은 방수가 될 때까지 이후의 봉합은 모든 0.5 mm를 배치와 함께 첫 번째 스티치, 장간막 국경에 배치됩니다. 회장과 대장을 통해 봉합 바늘을 통과하는 경우, 절단 된 모서리가 롤백되지 않도록하고, 바늘 물린 대장의 절단면에서 0.5 mm입니다. 전형적인 문합은 14-16 중단 봉합이 필요합니다. 문합을 통해 내용을 강제로 회장을 통해 원위 면봉 근위 롤링에 의해 완료시 문 합부의 무결성과 개통을 테스트합니다. 소장의 내용은 자유롭게 문 합부 누출없이 대장에 전달해야합니다.
- 10 ML의 주사기에서 0.9 % 식염수 3-4 mL를 노출 창자를 씻어대장의 표면에서 대변을 씻어하고, 복강에 다시 장을 제공합니다. 0.9 % 식염수 2 ㎖를 사용하여 복강 씻은 다음 횡 복벽에 약간 힘을인가하여 유체를 배수.
- 3-0 실크 실행 봉합과 절개를 닫고, 이소 플루 란의 흐름을 중단. 수술 후 통증 조절을 위해 -buprenorphine- 피하 긴 작용하는 아편의 0.1 ㎎ / ㎏을 관리합니다.
- 그들은 다음 이동성 지속적으로 따뜻하게 케이지로 전송 될 때까지 가열 램프 아래에있는 동물을 관찰한다.
3. 수술 후 관리 및 모니터링
- 하루의 나머지 부분에 대한 고민의 흔적이 지속적으로 따뜻하게 새장에 동물을 모니터링합니다. 액체 다이어트와 물 적량에 액세스 할 수있는 새로운 멸균 케이지 다시 동물 보호 시설에 동물을 전송합니다. 동물은 3-4 그룹에 수납 할 수있다.
- 다음날 아침 수술 후 동물 검사를 수행,동물이 고통에 표시되지 않도록. 만 액체 음식을 공급. 그들이 불편 (즉, 웅크 자세 또는 최소한의 활동을) 표시되면 피하 부 프레 노르 핀의 추가 용량을 관리 할 수 있습니다. 수술 후 1 일에 오후에 한 번 더 동물에 확인합니다.
- 수술 후 2 일째의 아침에 동물이 완전히 회복 나타납니다. 음식 소비와 stooling의 증거는 회복의 긍정적 인 신호이다. 자, 동물 용 고체 차우 다이어트를 다시 시작합니다.
참고 : 고통의 징후가 웅크 자세, 가난한 정리, 최소한의 활동을 포함한다. 고통의 흔적이 눈에 띄는 경우 동물은 안락사되어야한다. - 동물까지 2 L / 분의 O 2 유량 4 % 이소 플루 란 깊은 마취를 유도함으로써 동물을 안락사는 족압에 응답한다. 경추 탈구를 수행하고 적절한 euthanization의 흔적을 관찰합니다.
- 가이드 라인은, 그래서 표시에 관한 기관의 권고 사항을 참조 달라및 마우스에 euthanization의 적절한 방법.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
사망률과 체중 변화 수술 후.
129S1 야생형 생쥐에서 ICR을 다음과 사망률 ~ 5 % 일반적이다. 도덕의 가장 일반적인 원인은 문합에서 장폐색입니다. 사망의 다른 원인은 문 합부 누출과 폐쇄를 창자로 이어지는 내부 탈장을 포함한다.
체중 감소는 수술 후 최대 14 일까지 볼 수 있지만, 일반적으로 비 중요하다 할 수있다. 마우스는 완전히 수술 후 28 일째 (그림 2)에 의해 수술 전 체중을 회복하는 경향이있다.
기술의 양도
새로운 대학원생 (BM)이없는 이전의 수술 교육을 운영자가 기술을 배울 수 있는지 확인하기 위해 ICR 절차를 수행 할 수 배웠습니다. 교육은 8-0 나일론 봉합사를 사용하여 문합에 사용 된 것과 유사한 단일 중단 봉합을 수행하는 방법을 학습 시작했다. 봉합은 라텍스 GLO에서 만든 절개를 닫 실시 하였다했습니다. BM 효율적으로 찢어지지 않도록 장갑을 통해 봉합을 배치 할 수있었습니다, 그들은 하나를 시도하기 전에 세 전체 과정을 관찰했다. 첫 번째 절차 종료 후, 그들은 다음 다른 절차를 관찰하고 두 가지 이상을 시도했다. 완성 된 세 동물 중 마지막 두 생존과 번영에 갔다. 제 동물 인해 문합에서 합병증을 안락사시켰다.
대장의 그림 ileocolic 절제 및 문합술의 1 단계. (A) 회 맹부는 복부에서 전달했다. 검은 색 화살표가 결찰 할 혈관을 표시, 점선은 콜론과 터미널 회장에 대한 절개 포인트를 나타냅니다. (B) 제거 맹부는 대장의 절단 끝이 남아있는 혈액 공급은 검은 색 화살표에 의해 입증되어 정렬됩니다. (C) 완료 ileocolic 아나tomosis는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
맨 - 휘트니 U 통계 테스트에 의해 결정되는 기준에 그림 2. 동물의 무게는 수술 후 14 일 수술 후 하루 (28)는 무게에 큰 변화는 시술 후를 관찰되지 않았다. ICR (Ileocolic 절제술 그룹), 제어 (비 수술 컨트롤).
장 조직을 통해 봉합 그림 3. 대표 경로. H & E는 회장 (오른쪽)과 콜론 (왼쪽) 봉합 NE의 궤적을 보여 줄 지어있다의 조직 학적 섹션 스테인드점까지 점 (a)에서 시작 조직 (점선)을 통해 edle (b). 매듭 점 (C)에 연결해야합니다. 적은 점막이 다른 조직보다 문합에 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
뮤린 ICR는 장 질환 수술의 효과를 연구하기 위해 사용될 수있는 강력한 모델이다. 이 기사는 95 %의 성공률과 업 시술 후 이십팔일 안정 가중치 반영된 번창 부전 문제없이 ICR 마우스에서 수행 방법을 설명한다. 성공적인 ICR에 가장 중요한 과제는 문합과 문 합부 누출에 장 장애물을 피하는 등이 있습니다.
폐색을 방지하기위한 수술 기술 요소는 문합에 내강 직경을 최대화위한 것이다. 절개 지점에서 회장의 Spatulation는도 1a에 도시 된 바와 같이 30도 각도로 분할하여 창자 내강 직경을 증가시킨다. 봉합 바늘 장 조직의 물기를 촬영할 때는 창자의 가장자리를 풀다 약 절단 에지로부터 0.5 mm를 바늘을 통과하는 것이 필수적이다. 지나치게 조직의 큰 물린 내강을 좁히는 것입니다. 옵션은 AV로문합을 구성하는 키어 등. (15)에 의해 기술 된 바와 같이 소화 스텐트의 사용을 사용하는 것이다 OID 내강 좁아. 비 기술적 측면 방해를 방지하기 위해 충분히 작은 봉합 4를 선택하고 일일 수술 전 및 수술 후 이일 동물에게 유동식을 공급함으로써 부피가 큰 내강 내용을 피하는 등이 있습니다.
수술 후 사망률의 두 번째 가장 흔한 원인은 문 합부 누출입니다. 이 합병증을 피하면 장 문합의 원칙을 엄격하게 준수해야합니다. 첫 번째되는 충분한 혈액 공급. 대장의 부위에 혈액을 공급하는 혈관 결찰 된 절제 한 후, 창자 시각적 절개 전에 검사되어야한다. 대장의 허혈성 세그먼트는 어스레 나타납니다; 이 완전히 건강한 가장자리를 떠나 제거해야합니다. 그것은 나머지 부위의 절단면 출혈 소량을 시각화하는 것이 중요하다. 물 꽉 아나tomosis 패혈증으로 이어지는 내강 내용의 유출을 방지하는 것이 필수적이다. 이는 (도 3) 사이의 봉합 큰 갭을 회피하고, 소장의 모든 층이 스티치에 포함되는 것을 보장함으로써 달성된다. 상처 강도가 크게 처음 두 수술 후 일 감소되고, 따라서 적절하게 배치 봉합 강도 16, 17을 제공하는 것이 필수적이다. 잠재적 함정 실수 만 점막 가로로 결장의 루멘에서에게 키스 수 점막을 포함한다. 이것은 집게 루멘에 다시 탈항 점막 저감 부드럽게 장막의 절단 모서리를 시각화에 의해 회피 될 수있다.
위장 수술 컨트롤 외과 응력, 장 조작 및 / 또는 회맹 판 손실의 잠재적 혼동 효과 제어 ICR 모델을 사용하여 연구 실험 설계에서 고려되어야한다. 기본 문제에 따라 달라집니다 가짜 절차의 선택은에서 요청을 받고연구. 연구 목적 회맹 판을 잃기 호스트 응답을 평가하는 경우, 예를 들어, 다음 장소에 회맹 판을 남기고 장내 문합이 수행되는 가짜 수술 군을 포함하는 것이 현명 할 것이다. 이것은 일반적으로 절제 후 ileocolic 문합 7,11와 동일한 방식으로 소장 문합을 수행하지 않고 소장에 병행하여 수행된다. 이 연구자들은 장 문합술의 효과를 제어하여 회맹 판 손실의 영향에 특별히 언급 할 수있다. 다른 목표는 회맹 판의 손실에 특별히 코멘트하지 않고 장 절제 및 문합술의 효과를 연구하기 위해 전용의 경우, 다음 가짜 수술은 개복술을 포함해야하고, 창자는 ICR을 위해하고자로 취급하지만, 절개없이해야 문합. 이 수술 스트레스와 장 조작에 대한 제어합니다. 에 기재된 기술프로토콜은 상술 한 쉽게 가짜 절차를 수행하도록 구성 될 수있다.
이 프로토콜은 단말 회장의 1.5-2 cm 및 맹장의 전체를 제거 ileocolic 절제술을 설명하고, 밀접하게 조작 자주 ileocolic 크론 병 환자에서 수행 모방. - / - 마우스는 크론 병의 재발 7,11 유사 소장에서 자발적으로 염증과 섬유화를 개발 한 후, 대장염 모델 비슷한 절차는 IL-10에 사용되었습니다. 이 절차의 원칙은 또한 질병의 다른 모델에 적용 할 수 있습니다. ileocolic 문합과 소장의 50 %를 제거하여, 마우스 모델은 짧은 창자 증후군 4-6 적응 장내 성장 반응을 조사하기 위해 사용되어왔다. 앞으로이 또한 대장 암 수술의 전신 및 지역 효과 연구를위한 유용한 모델이 될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
- Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer. European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).
- Rutgeerts, P., Geboes, K., Vantrappen, G. Natural history of recurrent Crohn's disease at the ileocolonic anastomosis after curative surgery. Gut. 25 (6), 665-672 (1984).
- Davis, D., Rivadeneira, D. Complications of colorectal anastomoses: leaks, strictures, and bleeding. The Surgical clinics of North America. 93 (1), 61-87 (2013).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Dekaney, C. M., Fong, J. J., Rigby, R. J., Lund, P. K., Henning, S. J., Helmrath, M. A. Expansion of intestinal stem cells associated with long-term adaptation following ileocecal resection in mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 293 (5), (2007).
- Speck, K. E., De Cruz, P., et al. Inflammation enhances resection-induced intestinal adaptive growth in IL-10 null mice. The Journal of surgical research. 168 (1), 62-69 (2011).
- Rigby, R. J., Hunt, M. R., et al. A new animal model of postsurgical bowel inflammation and fibrosis: the effect of commensal microflora. Gut. 58 (8), 1104-1112 (2009).
- Kostic, A. D., Xavier, R. J., Gevers, D. The Microbiome in Inflammatory Bowel Disease: Current Status and the Future Ahead. Gastroenterology. , 1-11 (2014).
- Gevers, D., Kugathasan, S., et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell host & microbe. 15 (3), 382-392 (2014).
- Ahmed, T., Rieder, F., Fiocchi, C., Achkar, J. P. Pathogenesis of postoperative recurrence in Crohn's disease. Gut. 60 (4), 553-562 (2011).
- Borowiec, A., Sydora, B., et al. Small bowel fibrosis and systemic inflammatory response after ileocolonic anastomosis in IL-10 null mice. Journal of Surgical Research. 178 (1), 147-154 (2012).
- Devine, A. A., Gonzalez, A., et al. Impact of Ileocecal Resection and Concomitant Antibiotics on the Microbiome of the Murine Jejunum and Colon. 8 (8), (2013).
- Bij, G. J., Oosterling, S. J., Beelen, R. H. J., Meijer, S., Coffey, J. C., van Egmond, M. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in patients with colorectal cancer. Annals of surgery. 249 (5), (2009).
- Scott, A. D., Uff, C., Phillips, R. K. Suppression of macrophage function by suture materials and anastomotic recurrence of Crohn's disease. The British journal of surgery. 80 (3), (1993).
- Kiernan, J. A. Intestinal anastomosis in the rat facilitated by a rapidly digested internal splint and indigestible but absorbable sutures. Journal of Surgical Research. 45, 427-431 (1988).
- Andersen, T. L., et al. Action of matrix metalloproteinases at restricted sites in colon anastomosis repair: an immunohistochemical and biochemical study. Surgery. 140 (1), 72-82 (2006).
- Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I. Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).
