Protocol
Protocolos de uso de animais foram aprovados pelo Animal Care and Use comissão de Ciência da Saúde da Universidade de Alberta.
1. Preparação de Instrumentos, Animais e Setup operativo
- Transferir os animais para uma nova, ausente gaiola limpa de todos os materiais sólidos de comida 24 horas antes do procedimento. Eles podem ter livre acesso à água e dieta líquida ad lib até o momento do procedimento.
- Autoclave todos os instrumentos necessários para o procedimento. Superfície operacional limpo e cone do nariz anestésico com etanol 70%.
- Defina-se a superfície de operação com microscópio cirúrgico, anestésico e material de máquina de uma maneira que é confortável para o cirurgião. Os cotovelos do cirurgião deve ser autorizado a descansar confortavelmente na mesa de operação, com as mãos e os braços desobstruídas por equipamento. Instruments, suturas, cotonetes, e uma seringa de 10 ml deve ser colocado num local que permite fácil acesso durante o procedimento.
- Estabelecerlâmpadas de calor gerais para proporcionar tanto calor para o animal durante o procedimento e luz para a superfície operacional.
- Encher um tubo de 50 ml com 0,9% de soro fisiológico, e um tubo de 1,5 ml com geleia de petróleo e lugar perto da superfície do operacional.
NOTA: Esterilizar todos os instrumentos e materiais cirúrgicos. Uma vez que o intestino é seccionado, o próprio procedimento não é estéril. É considerada limpa-contaminada. Tomar medidas para evitar a introdução de fontes exógenas de infecção.
2. ileocolic ressecção com anastomose
- Induzir a anestesia pela administração de 4% de isoflurano com uma taxa de fluxo de oxigênio de 2 L / min através de nariz cone do vaporizador de isoflurano até o animais freqüência respiratória diminui para cerca de 30-40 ciclos / min. Aplique pressão moderada para a pata traseira do rato para garantir que não haja resposta da dor antes de iniciar o procedimento. Neste ponto, desligue o isoflurano a 2% e fluxo de oxigênio para 0,5 L / min. Intermitentementeverificar a resposta à dor durante o procedimento e ajustar a taxa de fluxo de isoflurano em conformidade.
- Aplique vaselina para os olhos para evitar o ressecamento durante a cirurgia, e imobilizar o mouse na posição supina, com membros garantidos usando fita adesiva transparente.
- Limpe o abdômen com solução povodine / iodo, e transformar-se em novas luvas estéreis.
- Faça uma incisão na pele 1,5 centímetros na linha média superior do abdómen, utilizando ponta afiada dissecando tesoura para expor a fáscia e peritônio. Abra a camada da membrana fibrosa / peritoneal, de uma forma similar através da linha alba para expor o conteúdo peritoneal.
- Em contraste com os seres humanos, o ceco do rato é tipicamente encontrado no quadrante superior esquerdo do abdómen. Uma vez identificados, compreender o ceco suavemente com uma pinça e entregá-lo através da incisão. Use cotonetes de algodão humedecido para fora do ventilador de aproximadamente 3 cm do íleo terminal que se projecta a partir do ceco ao longo de um gaze estéril envolto sobre a superfície abdominal (Figura 1A).Assegurar o intestino expostos é mantida húmida com 0,9% de soro fisiológico durante a totalidade do procedimento.
- Identificar a artéria ileocecal ramificando-se a artéria mesentérica superior ao longo do cólon (Figura 1A) usando o microscópio de operação. Dissecar os tecidos avasculares adjacentes à artéria ileocecal, cercar e ligar a artéria com um laço de seda 5-0. Em seguida, localize o suprimento de sangue regional para o íleo terminal e escolher um ponto transection 1,5-2 cm proximal à junção ileocecal. Ligadura dos ramos para esta seção do íleo como acima. Divida as artérias com micro dissecando tesoura.
- Divida as porções isquêmicas de íleo eo cólon garantir que haja fornecimento de sangue adequado para os fins transeccionados (Figura 1B). Muitas vezes, é útil para spatulate o íleo, dividindo-o em um ângulo de 30 graus para aumentar o diâmetro do lúmen de modo que corresponda mais estreitamente do cólon. Uma vez que a porção de ileocecal do intestino foi removido, a alinhartranseccionados extremidades do íleo e do cólon na gaze, garantindo as fronteiras de cada mesentéricos estão alinhados.
- Confecção da anastomose, através da aproximação do fim seccionado do íleo para o final seccionado de cólon usando interrompido 8-0 suturas de polipropileno (Figura 1C). O primeiro ponto é colocado na borda mesentérica, com suturas posteriores colocados a cada 0,5 milímetros até a anastomose íleo-colônica é estanque. Ao passar a agulha de sutura através do íleo eo cólon, garantir que a borda do corte não é enrolado, e picadas de agulhas são 0,5 milímetros a partir das bordas do corte do intestino. A anastomose típico vai exigir 14-16 suturas interrompidas. Teste a integridade ea desobstrução da anastomose após a conclusão rolando uma proximal para distal cotonete sobre o íleo para forçar o conteúdo através da anastomose. Conteúdo do intestino delgado deve passar livremente para o cólon sem deiscência de anastomose.
- Lavar o intestino expostos com 3-4 ml de solução salina a 0,9% a partir da seringa de 10 mlpara lavar fezes a partir da superfície do intestino, e entregar do intestino de volta para dentro da cavidade peritoneal. Usando 2 ml de solução salina a 0,9% lavar a cavidade peritoneal, e, em seguida, este fluido escorra através da aplicação de uma pressão suave para a parede abdominal lateralmente.
- Feche a incisão com uma corrida de seda 3-0, e interromper o fluxo de isoflurano. Administrar 0,1 mg / kg de ópio longa ação -buprenorphine- por via subcutânea para controle da dor pós-operatória.
- Observe os animais sob a lâmpada de calor até que eles são móveis, em seguida, transferi-los para uma gaiola continuamente aquecido.
Cuidado 3. pós-operatória e Monitoramento
- Monitorizar os animais em uma gaiola aquecida continuamente para detectar sinais de desconforto para o resto do dia. Transferir os animais de volta para a facilidade de cuidado animal em uma nova gaiola estéril com acesso a dieta líquida e água ad lib. Os animais podem ser alojados em grupos de 3-4.
- Execute uma verificação sobre os animais no pós-operatório, na manhã seguinte,garantir que os animais não aparecem em perigo. Alimente apenas dieta líquida. Se eles parecem desconfortáveis (ou seja, a postura curvada ou atividade mínima) administrar uma dose adicional de buprenorfina subcutânea. Confira os animais mais uma vez à tarde em dia de pós-operatório 1.
- Na manhã do dia pós-operatório 2 os animais deve aparecer totalmente recuperado. Provas do consumo de alimentos e stooling são sinais positivos de recuperação. Agora, retomar uma dieta de comida sólida para os animais.
NOTA: Sinais de perigo incluem postura arqueada, má higiene e atividade mínima. Se os sinais de perigo são proeminentes os animais devem ser sacrificados. - Eutanásia dos animais através da indução de anestesia profunda com 4% de isoflurano a uma taxa de fluxo de O2, de 2 L / min até que os animais não respondem à pressão do pé. Realizar deslocamento cervical, e observar se há sinais de eutanásia adequada.
- Orientações variam, por isso consulte as recomendações das instituições quanto às suas indicaçõespara os métodos adequados de eutanásia em camundongos.
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Representative Results
As taxas de mortalidade e alteração de peso no pós-operatório.
As taxas de mortalidade seguintes ICR em 129S1 camundongos selvagens são geralmente ~ 5%. A causa mais comum da moralidade é obstrução intestinal na anastomose. Outras causas de mortalidade incluem fístula e hérnia interna que leva à obstrução intestinal.
A perda de peso pode ser visto até 14 dias de pós-operatório, mas é geralmente não-significativo. Ratos tendem a recuperar completamente peso pré-operatório pelo pós-operatório dia 28 (Figura 2).
Possibilidade de transferência de técnica
Um novo estudante de pós-graduação (BM) foi ensinado a realizar o procedimento ICR para determinar se um operador sem treinamento cirúrgico anterior poderia aprender a técnica. O treinamento começou com a aprendizagem de como realizar as únicas suturas interrompidas análogos aos utilizados na anastomose utilizando 8-0 nylon sutura. As suturas foram realizadas para fechar uma incisão feita através de um glo látexve. Depois BM conseguiu colocar de forma eficiente através de suturas a luva sem rasgar, observaram três procedimentos completos antes de tentar um. Após o primeiro procedimento foi concluído, eles então observado um outro procedimento e tentou mais duas. Dos três animais terminados, os dois últimos passaram a sobreviver e prosperar. O primeiro animal foi sacrificado devido a complicações na anastomose.
Figura 1. Estágios de ressecção ileocolic e anastomose. (A) região Ileocecal do intestino entregue fora do abdômen. Setas pretas indicam navios a serem ligados, linhas tracejadas indicam pontos transecção de cólon e do íleo terminal. (B) a região ileocecal removido, as extremidades cortadas do intestino estão alinhados, mantendo-se o fornecimento de sangue é demonstrada pelas setas pretas. (C) Concluído anas ileocólicastomosis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Os pesos dos animais no início do estudo, o dia de pós-operatório e 14 de pós-operatório dia 28. Não houve alterações significativas nos pesos foram observados pós-procedimento, conforme determinado pelo teste estatístico de Mann-Whitney. ICR (grupo ressecção ileocolic), controle (controles não-operatório).
Figura 3. Representante caminho de suturas através dos tecidos intestinais. H & E manchada cortes histológicos de íleo (à direita) e cólon (à esquerda) estão alinhados para demonstrar a trajetória da ne suturaedle através dos tecidos (linha a tracejado) a partir do ponto (a) através do ponto (b). O nó deve ser amarrado no ponto (c). Note-se que menos mucosa está incluído na anastomose do que outros tecidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O murino ICR é um poderoso modelo que pode ser usado para estudar os efeitos da cirurgia em doenças intestinais. Este artigo descreve um método de realizar ICR em camundongos com uma taxa de sucesso de 95% e sem problemas com déficit de crescimento que se reflete por pesos estáveis até 28 dias após o procedimento. Os desafios mais significativos para o sucesso ICR incluem evitar obstruções intestinais da anastomose e fístulas.
Elementos técnicos para a cirurgia para prevenir a obstrução visam maximizar diâmetro do lúmen na anastomose. Espatulação do íleo no ponto transecção aumenta o diâmetro do lúmen do intestino, dividindo o em um ângulo de 30 graus como representado na Figura 1A. Ao tomar picadas de tecido intestinal com a agulha de sutura, é essencial para desenrolar as bordas do intestino e passar a agulha de aproximadamente 0,5 mm a partir da borda de corte. Excessivamente grandes bocados de tecido vai diminuir o lúmen. Uma opção para avestreitamento luminal oid ao construir a anastomose é empregar o uso de um stent digerível tal como descrito por Kiernan et al. 15. Aspectos não-técnicos para evitar a obstrução incluem a seleção de uma suficientemente pequena sutura 4 e evitando conteúdos luminais volumosos, alimentando os animais uma dieta líquida um dia antes da cirurgia e dois dias após a cirurgia.
A segunda causa mais comum de mortalidade pós-operatória é fístula. Evitar esta complicação exige estrita adesão aos princípios da anastomose intestinal. O primeiro é o fornecimento de sangue adequado. Depois os vasos que fornecem sangue para a região do intestino sendo ressecado foram ligados, o intestino deve ser inspeccionada visualmente antes da transecção. O segmento de isquemia do intestino aparecerá escuro; esta deve ser completamente removida, deixando arestas saudáveis. É importante visualizar uma pequena quantidade de hemorragia a partir das bordas cortadas do restante do intestino. A anas água apertadotomosis também é essencial para evitar o derramamento do conteúdo luminal levando a sepse. Isto é conseguido evitando grandes lacunas entre suturas, e assegurando que todas as camadas do intestino estão incluídos no ponto (Figura 3). Força da ferida é muito reduzido nos dois primeiros dias de pós-operatório, suturas, assim, colocados corretamente são essenciais para fornecer a força 16,17. Uma armadilha potencial for inadvertidamente apenas incluindo a mucosa, como a mucosa pode franzir para fora do lúmen do cólon seccionado. Isto pode ser evitado através da visualização da orla de corte da serosa e da mucosa prolapsada suavemente a redução de volta para dentro do lúmen com uma pinça.
Controles cirúrgicos Sham deve ser considerada no projeto experimental de estudos utilizando o modelo ICR para controlar os potenciais efeitos de confusão do estresse cirúrgico, manipulação intestinal, e / ou perda da válvula ileocecal. A escolha do procedimento simulado vai depender da questão principal a ser respondidao estudo. Por exemplo, se o objetivo da pesquisa é avaliar a resposta do hospedeiro, depois de perder a válvula ileocecal, então seria prudente incluir um grupo de cirurgia simulada em que uma anastomose intestinal é realizada, deixando a válvula ileocecal no lugar. Isto é tipicamente feito por transecting o intestino delgado sem ressecção, em seguida, executar uma anastomose do intestino pequeno da mesma forma como a anastomose ileocólica 7,11. Isto iria permitir que os investigadores a comentar especificamente sobre os efeitos da perda de válvula ileocecal por controlar os efeitos de anastomose intestinal. Alternativamente, se o objectivo é apenas para estudar os efeitos da ressecção intestinal e anastomose sem comentar especificamente sobre a perda da válvula ileocecal, em seguida, uma cirurgia simulada deve incluir uma laparotomia e o intestino deve ser tratado como o faria para ICR, mas sem transecção e anastomose. Isso controlar estresse cirúrgico e manipulação intestinal. As técnicas descritaso protocolo acima pode ser facilmente adaptado para a execução de procedimentos sham.
Este protocolo descreve uma resseção ileocólica, que remove 1,5-2 cm do íleo terminal e a totalidade do ceco, e imita uma operação frequentemente realizada em pacientes com doença de Crohn ileocólica. Procedimentos semelhantes têm sido utilizados na IL-10 - modelo de colite após o qual os ratinhos desenvolveram inflamação espontânea e fibrose no intestino delgado análoga à recidiva da doença de Crohn 7,11 - /. Os princípios deste procedimento também pode se aplicar a outros modelos de doença. Através da remoção de 50% do intestino delgado com anastomose ileocólica, modelos de ratos têm sido utilizados para investigar a resposta de crescimento intestinal adaptativo na síndrome do intestino curto 4-6. No futuro, esta também pode se tornar um modelo útil para estudar os efeitos sistêmicos e locais de cirurgia no câncer colorretal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
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