Protocol
Протоколы использования животных были утверждены уходу и использованию животных комитета науки здоровья в Университете Альберты.
1. Подготовка инструментов, животных и оперативной установки
- Перевести животных на новую, чистую клетку отсутствующего всех твердых продуктов питания 24 часов до процедуры. Они могут иметь свободный доступ к воде, и жидкость диета экспромтом до времени процедуры.
- Автоклав все инструменты, необходимые для процедуры. Чистый операционный поверхность и анестетик носовой конус с 70% -ным этанолом.
- Настройте операционную поверхность с операционным микроскопом, наркозно-дыхательного аппарата и расходных материалов в порядке, который удобен для оперирующего хирурга. Локти хирурга должно быть разрешено отдыхать с комфортом на операционном столе, с рук и кистей беспрепятственным оборудованием. Инструменты, швы, ватные тампоны, и 10 мл шприц должен быть помещен в месте, которое позволяет легко добраться во время процедуры.
- Установитьнакладные инфракрасные лампы, чтобы обеспечить как тепло для животного во время процедуры и света на рабочей поверхности.
- Наполните 50 мл коническую трубку с 0,9% физиологического раствора, и 1,5 мл пробирку с вазелином и места вблизи рабочей поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизовать все инструменты и хирургические принадлежности. Поскольку кишечник перерезают, сама процедура не является стерильной. Считается чистый загрязненных. Примите меры, чтобы избежать введения экзогенных источников инфекции.
2. Ileocolic резекция с анастомоза
- Анестезии путем введения 4% изофлуран с расходом кислорода 2 л / мин через носовой конус от изофлурана испарителя, пока частота дыхания животных не замедляется до примерно 30-40 вдохов / мин. Применить умеренное давление на задней ноги мыши, чтобы гарантировать, что нет никакой боли ответ до начала процедуры. В этот момент, выключают изофлуран до 2% и поток кислорода до 0,5 л / мин. С перерывамипроверить болевой ответ во время процедуры и настроить ИФ расход соответственно.
- Применить вазелин для глаз, чтобы предотвратить высыхание во время операции, и иммобилизации мышь в положении лежа на спине с конечностями, обеспеченных используя прозрачную ленту.
- Очистите живота с решением povodine / йода, и изменить в новые стерильные перчатки.
- Сделайте 1,5 см разрез кожи в верхней средней линии живота с использованием острие рассекает ножницы, чтобы разоблачить фасции и брюшины. Откройте слой фасциальную / перитонеальный подобным способом через белой линии, чтобы выставить брюшины содержимое.
- В отличие от человека, слепой кишки мыши, как правило, находится в левом верхнем квадранте брюшной полости. После того, как определены, мягко понять слепую кишку с пинцетом и доставить его через разрез. Используйте смоченные ватные тампоны веером примерно 3 см терминального отдела подвздошной кишки, проходящей от слепой кишки в течение стерильной марли драпированные на брюшной поверхности (рис 1А).Обеспечить подвергается кишечника влажной с 0,9% физиологического раствора в течение всей полноте процедуры.
- Определить илеоцекальный артерии ответвляется от верхней брыжеечной артерии вдоль толстой кишки (рис 1А) с помощью операционного микроскопа. Рассеките из бессосудистой тканей, прилегающих к илеоцекального артерии, окружить и перевязывать артерию с 5-0 шелковый галстук. Затем найдите регионального кровоснабжения терминального отдела подвздошной кишки и выбрать рассечение точку 1,5-2 см проксимальнее илеоцекального перехода. Перевязывать ветви на этом участке подвздошной кишки, что и выше. Разделите артерии с микро рассекает ножницы.
- Разделите ишемические участки подвздошной и толстой кишки, обеспечивая есть достаточный запас крови на перерезанных концов (рис 1b). Это часто бывает полезно лопатчатые подвздошной кишки, разделив его на 30 градусов, чтобы увеличить диаметр просвета, так что более точно соответствует толстой кишки. После того, как илеоцекального часть кишечника была удалена, выравниванияперерезана концы подвздошной и толстой кишки на марлю, обеспечивая брыжеечной границы друг выравниваются.
- Построить анастомоза путем аппроксимации перерезана конец подвздошной кишки в пересечённого конце толстой кишки с помощью прервал 8-0 полипропиленовые швов (рис 1в). Первый стежок помещается в брыжеечной границе, с последующими швы размещены каждые 0,5 мм до анастомоз Ileocolic не водонепроницаем. При прохождении хирургической иглы через подвздошной и толстой кишки, убедитесь, что отрезанный край не скручивается, и игла укусы 0,5 мм из разрезанных краев кишки. Типичный анастомоза потребует от 14 до 16 узловыми швами. Проверьте целостность и проходимость анастомоза после завершения прокатки ватный тампон проксимальнее дистальной над подвздошной кишки, чтобы заставить содержимого через анастомоз. Небольшие содержание кишечника должны свободно проходить в кишечник без утечки анастомоза.
- Промыть открытую кишку с 3-4 мл 0,9% физиологического раствора из шприца 10 млчтобы смыть стул с поверхности кишечника, и доставить кишечника обратно в брюшную полость. Использование 2 мл 0,9% физиологического раствора смыть в брюшную полость, а затем слить эту жидкость, слегка надавливая на брюшную стенку с боков.
- Закрыть разрез с 3-0 шелковой проточной шва, и прекратить поток ИФ. Администрирование 0,1 мг / кг длительного действия опиатов -buprenorphine- подкожно для послеоперационного обезболивания.
- Соблюдайте животных под инфракрасной лампой, пока они не мобильны затем передать их в постоянно подогреваемой клетке.
3. Послеоперационный уход и контроль
- Монитор животных в постоянно подогреваемой клетку для признаков неблагополучия на оставшуюся часть дня. Перевести животных обратно на объекте по уходу за животными в новом стерильном клетку с доступом к жидкой диете и воды экспромтом. Животные могут быть размещены в группах по 3-4.
- Выполните проверку на послеоперационных животных на следующее утро,обеспечить животные не появляются в бедственном положении. Поток только жидкую диету. Если они появляются неприятное (то есть, выгибание спины или минимальную активность) администрировать дополнительную дозу подкожно бупренорфина. Проверьте на животных еще раз во второй половине дня на день после операции 1.
- Утром послеоперационного дня 2 животные должны появиться полностью восстановился. Свидетельство потребления продуктов питания и стеблевания положительные признаки восстановления. Теперь, возобновить твердую чау диету для животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Признаки бедствия включают выгибание спины, плохой уход, и минимальную активность. Если признаки дистресса занимают видное животные должны быть умерщвлены. - Усыпить животных, вызывая глубокую анестезию с 4% изофлуран при скорости потока O 2 2 л / мин до животных не реагируют на давление стопы. Выполните шейки дислокации, и наблюдать за признаками правильного euthanization.
- Руководство варьироваться, поэтому следует обратиться к учреждениям рекомендаций по показаниямдля и соответствующие методы euthanization на мышах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Уровень смертности и изменение веса после операции.
Показатели смертности следующие ICR в 129S1 мышей дикого типа, как правило, ~ 5%. Наиболее распространенной причиной морали является кишечная непроходимость в анастомоза. Другие причины смертности включают анастомоза утечки и внутренней грыжи, ведущий к Кишечная непроходимость.
Потеря веса может рассматриваться до 14 дней после операции, но, как правило, не значимая. Мыши, как правило, полностью восстановить дооперационную вес послеоперационный день 28 (рисунок 2).
Возможность передачи техники
Новый аспирант (BM) учили выполнять процедуру ICR, чтобы определить, является ли оператор без предыдущего хирургического обучения может овладеть техникой. Обучение началось с обучения, как для выполнения одиночных узловыми швами, аналогичные тем, которые используются в анастомоза с использованием 8-0 нейлоновый шов. Швы были выполнены, чтобы закрыть разрез, сделанный по латексной Gloве. После BM смог эффективно разместить швов через перчатку, не разрывая, они наблюдали три полных процедур до попытки один. После первой процедуры были завершены, они затем наблюдается другую процедуру и попытался еще два. Из трех животных завершенных, последние два пошли на, чтобы выжить и процветать. Первое животное было умерщвлено в связи с осложнениями в анастомоза.
Рисунок 1. Этапы ileocolic резекции и анастомоза. (А) илеоцекального область кишечника доставлен из живота. Черные стрелки указывают судам быть лигирована, пунктирные линии указывают перерезки очки для толстой кишки и подвздошной кишки. (B) илеоцекального область удалены, срезанные концы кишки выровнены, оставаясь кровоснабжение демонстрируется черными стрелками. (C) Завершено ileocolic НАНАtomosis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. животных весов исходно, послеоперационный день 14 и послеоперационный день 28. Никаких существенных изменений в весе не наблюдалось после процедуры, как определено с помощью тестов Манна-Уитни U. ICR (Ileocolic резекция группа), управления (Non-оперативные органы управления).
Рисунок 3. Представитель путь швов через кишечных тканей. H & E окрашенных гистологических разделы подвздошной кишки (справа) и толстой кишки (слева) выстроились, чтобы продемонстрировать траекторию шва пеEdle через ткани (пунктирная линия), начиная с точки (а) до точки (б). Узел должен быть привязаны в точке (с). Обратите внимание, что меньше слизистая входит в анастомоза, чем другие ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мышиный ICR является мощная модель, которая может быть использована для изучения влияния хирургического вмешательства при заболеваниях кишечника. В этой статье описывается способ выполнения ICR мышей с вероятностью успеха 95% и без каких-либо проблем с задержки развития, как это отражается стабильных весом до 28 дней после процедуры. Наиболее значительные проблемы для успешного МЦР включают избегая препятствий кишечника в анастомоза и анастомоза утечки.
Технические элементы к хирургии для предотвращения обструкции направлены на максимизацию диаметра просвета в анастомоза. Spatulation из подвздошной кишки в точке рассечение увеличивает диаметр просвета путем деления кишечника под углом 30 градусов, как показано на фиг.1А. При принятии укусов кишечной ткани с хирургической иглы, важно, чтобы развернуть края кишки и передать иглу примерно 0,5 мм от обрезной кромки. Слишком большие укусы ткани сузит просвет. Возможность А.В.OID сужение просвета при построении анастомоза является использование использование перевариваемого стента, как описано Kiernan соавт. 15. Номера технические аспекты, чтобы избежать обструкции включают выбор достаточно малый шов 4 и избежать громоздких просвета содержимое по кормлению животных жидкую диету за день до операции и 2 дня после операции.
Второй наиболее распространенной причиной послеоперационной смертности является утечка анастомоза. Как избежать этого осложнения требует строгого соблюдения принципов кишечного анастомоза. Первое, являющееся адекватного кровоснабжения. После суда, поставляющие кровь к области кишечника будучи резекции были лигирована, кишечника должны быть визуально проверены до перерезки. Ишемическая сегмент кишки появится сумрачно; это должно быть полностью удалены оставляя здоровые края. Важно, чтобы визуализировать небольшое количество кровотечения из срезанных краев оставшейся кишки. Водонепроницаемой НАНАtomosis также имеет важное значение, чтобы избежать разлива просвета содержания ведущих к сепсису. Это достигается путем устранения большие промежутки между швами, и обеспечение того, чтобы все слои кишечника включены в стежка (рисунок 3). Сила ран значительно уменьшается в течение первых двух послеоперационных дней, таким образом, правильно размещенные швы необходимы для обеспечения прочности 16,17. Потенциальная ловушка непреднамеренно только в том числе слизистой оболочки, как слизистая оболочка может Pucker из просвета пересечённого толстой кишки. Этого можно избежать путем визуализации обрезанный край серозной и осторожно уменьшая выпадение слизистой оболочки обратно в просвет щипцами.
Шам хирургические управления следует рассматривать в опытно-конструкторских работ с использованием модели ICR для контроля потенциальных вмешивающихся эффектов хирургического стресса, кишечной манипуляции, и / или потери илеоцекального клапана. Выбор процедуры мнимого будет зависеть от первичной нами вопроса визучение. Например, если цель исследования заключается в оценке ответа хоста после потери илеоцекального клапана, то было бы целесообразно включить обман хирургии группу, в которой кишечного анастомоза выполняется, оставляя илеоцекального клапана на месте. Обычно это делается путем пересекающих тонкую кишку без резекции затем выполнения небольшой анастомоз кишечника таким же образом, как ileocolic анастомоза 7,11. Это позволит исследователям конкретно прокомментировать последствий илеоцекального потери клапана, контролируя по воздействию кишечного анастомоза. С другой стороны, если целью является только для изучения влияния кишечной резекции и анастомоза не комментируя конкретно на потери илеоцекального клапана, то обман хирургия должна включать лапаротомия, и кишечника следует относиться как это было бы для МЦР, но без рассечения и анастомоз. Это будет управлять для хирургического стресса и кишечника манипуляции. Методы, описанные вПротокол выше, могут быть легко адаптированы для выполнения процедуры обман.
Этот протокол описывает ileocolic резекцию, который удаляет 1,5-2 см от терминального отдела подвздошной кишки и полноту слепой кишки, и точно имитирует операция часто проводится у пациентов с болезнью ileocolic Крона. Аналогичные процедуры были использованы в IL-10 - / - колит модели мышей после чего развитой спонтанное воспаление и фиброз в тонкой кишке, аналогичной рецидива болезни Крона 7,11. Принципы этой процедуры могут также применяться к другим моделям болезни. Удалив 50% тонкой кишки с ileocolic анастомоза, мышиные модели были использованы для изучения адаптивной кишечную реакцию роста в короткой кишки синдром 4-6. В будущем это может стать полезной моделью для изучения системных и локальных эффектов хирургии в колоректального рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
- Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer. European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).
- Rutgeerts, P., Geboes, K., Vantrappen, G. Natural history of recurrent Crohn's disease at the ileocolonic anastomosis after curative surgery. Gut. 25 (6), 665-672 (1984).
- Davis, D., Rivadeneira, D. Complications of colorectal anastomoses: leaks, strictures, and bleeding. The Surgical clinics of North America. 93 (1), 61-87 (2013).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Dekaney, C. M., Fong, J. J., Rigby, R. J., Lund, P. K., Henning, S. J., Helmrath, M. A. Expansion of intestinal stem cells associated with long-term adaptation following ileocecal resection in mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 293 (5), (2007).
- Speck, K. E., De Cruz, P., et al. Inflammation enhances resection-induced intestinal adaptive growth in IL-10 null mice. The Journal of surgical research. 168 (1), 62-69 (2011).
- Rigby, R. J., Hunt, M. R., et al. A new animal model of postsurgical bowel inflammation and fibrosis: the effect of commensal microflora. Gut. 58 (8), 1104-1112 (2009).
- Kostic, A. D., Xavier, R. J., Gevers, D. The Microbiome in Inflammatory Bowel Disease: Current Status and the Future Ahead. Gastroenterology. , 1-11 (2014).
- Gevers, D., Kugathasan, S., et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell host & microbe. 15 (3), 382-392 (2014).
- Ahmed, T., Rieder, F., Fiocchi, C., Achkar, J. P. Pathogenesis of postoperative recurrence in Crohn's disease. Gut. 60 (4), 553-562 (2011).
- Borowiec, A., Sydora, B., et al. Small bowel fibrosis and systemic inflammatory response after ileocolonic anastomosis in IL-10 null mice. Journal of Surgical Research. 178 (1), 147-154 (2012).
- Devine, A. A., Gonzalez, A., et al. Impact of Ileocecal Resection and Concomitant Antibiotics on the Microbiome of the Murine Jejunum and Colon. 8 (8), (2013).
- Bij, G. J., Oosterling, S. J., Beelen, R. H. J., Meijer, S., Coffey, J. C., van Egmond, M. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in patients with colorectal cancer. Annals of surgery. 249 (5), (2009).
- Scott, A. D., Uff, C., Phillips, R. K. Suppression of macrophage function by suture materials and anastomotic recurrence of Crohn's disease. The British journal of surgery. 80 (3), (1993).
- Kiernan, J. A. Intestinal anastomosis in the rat facilitated by a rapidly digested internal splint and indigestible but absorbable sutures. Journal of Surgical Research. 45, 427-431 (1988).
- Andersen, T. L., et al. Action of matrix metalloproteinases at restricted sites in colon anastomosis repair: an immunohistochemical and biochemical study. Surgery. 140 (1), 72-82 (2006).
- Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I. Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).
