Protocol
Protocolos de uso de los animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de Ciencias de la Salud de la Universidad de Alberta.
1. Preparación de Instrumentos, Animales y Configuración Operativo
- Transferencia de los animales a una nueva, ausente jaula limpia de todos los alimentos sólidos 24 h antes del procedimiento. Ellos pueden tener libre acceso al agua, y el líquido dieta ad libitum hasta el momento del procedimiento.
- Autoclave todos los instrumentos necesarios para el procedimiento. Superficie de operación Limpie y cono de la nariz anestesia con etanol al 70%.
- Configurar la superficie de funcionamiento con el microscopio operativo, máquina de anestesia y materiales de construcción de una manera que sea cómoda para el cirujano. Los codos del cirujano se debe permitir que descansar cómodamente en la mesa de operaciones, con las manos y los brazos sin obstáculos por equipos. Instrumentos, suturas, hisopos de algodón, y una jeringa de 10 ml se deben colocar en un lugar que permite un fácil acceso durante el procedimiento.
- Prepararlámparas de calor de arriba para proporcionar tanto calor para el animal durante el procedimiento y de la luz para la superficie de funcionamiento.
- Llenar un tubo cónico de 50 ml con 0.9% de solución salina, y un tubo de 1,5 ml con vaselina y el lugar cerca de la superficie de funcionamiento.
NOTA: Esterilizar todos los instrumentos y suministros quirúrgicos. Debido a que el intestino se secciona, el procedimiento en sí no es estéril. Se considera limpia-contaminada. Tome medidas para evitar la introducción de fuentes exógenas de la infección.
2. La resección ileocólica con anastomosis
- Inducir la anestesia mediante la administración de 4% de isoflurano con una tasa de flujo de oxígeno de 2 L / min a través de cono de la nariz desde el vaporizador de isoflurano hasta que la tasa respiratoria animales se desacelera a aproximadamente 30-40 respiraciones / min. Aplique una presión moderada a la pata trasera del ratón para asegurar que no haya respuesta de dolor antes de iniciar el procedimiento. En este punto, baje isoflurano al 2% y el flujo de oxígeno a 0,5 L / min. De forma intermitentecomprobar la respuesta al dolor durante el procedimiento y ajustar la velocidad de flujo de isoflurano en consecuencia.
- Aplique vaselina en los ojos para evitar que se seque durante la cirugía, e inmovilizar el ratón en la posición supina con las extremidades garantizados utilizando cinta adhesiva transparente.
- Limpie el abdomen con solución povodine / yodo, y el cambio en los nuevos guantes estériles.
- Hacer una incisión en la piel de 1,5 cm en la línea media superior del abdomen utilizando punta afilada disección tijeras para exponer la fascia y el peritoneo. Abra la capa fascial / peritoneal de una manera similar a través de la línea alba para exponer los contenidos peritoneales.
- En contraste con los seres humanos, el ciego ratón se encuentra típicamente en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. Una vez identificado, agarre suavemente el ciego con fórceps y entregarlo a través de la incisión. Use hisopos de algodón humedecidos en abanico de aproximadamente 3 cm de íleon terminal que se extiende desde el ciego sobre una gasa estéril cubierto en la superficie abdominal (Figura 1A).Asegúrese de que el intestino expuesto se mantiene húmedo con 0,9% de solución salina durante la totalidad del procedimiento.
- Identificar la arteria ileocecal ramificación de la arteria mesentérica superior lo largo del colon (Figura 1A) usando el microscopio operativo. Diseccionar los tejidos avasculares adyacentes a la arteria ileocecal, rodear y se liga la arteria con un lazo de seda 5-0. A continuación, localice el suministro de sangre regional para el íleon terminal y elegir un punto transección 1,5-2 cm proximal a la unión ileocecal. Ligar las ramas a esta sección de íleon como anteriormente. Divida las arterias con micro tijeras de disección.
- Divida las porciones isquémicas del íleon y colon asegurándose de que hay suficiente suministro de sangre a los extremos seccionados (Figura 1B). A menudo es útil para espatuladas el íleon dividiéndolo en un ángulo de 30 grados para aumentar el diámetro de la luz por lo que es más compatible con el colon. Una vez que la porción ileocecal del intestino se ha eliminado, alinee elestán alineados extremos seccionados del íleon y colon en la gasa, asegurando las fronteras mesentéricas de cada uno.
- Construir la anastomosis mediante la aproximación final seccionado de íleon hasta el final seccionado de colon usando interrumpido 8-0 suturas de polipropileno (Figura 1C). El primer punto se coloca en el borde mesentérico, con suturas posteriores colocan cada 0.5 mm hasta que la anastomosis ileocólica es hermético. Al pasar la aguja de sutura a través del íleon y colon, asegúrese de que el borde de corte no se enrolla, y picaduras de agujas son de 0,5 mm de los bordes cortados del intestino. Una anastomosis típica requerirá de 14 a 16 suturas interrumpidas. Prueba de la integridad y la permeabilidad de la anastomosis al finalizar haciendo rodar una proximal a distal hisopo de algodón sobre el íleon para forzar los contenidos a través de la anastomosis. El contenido del intestino pequeños deben pasar libremente hacia el colon sin dehiscencia de la anastomosis.
- Enjuague el intestino expuesto con 3.4 ml de solución salina al 0,9% de la jeringa de 10 mlpara lavar las heces de la superficie del intestino, del intestino y entregar de nuevo en la cavidad peritoneal. El uso de 2 ml de solución salina al 0,9% a enjuagar la cavidad peritoneal, y luego drenar este líquido mediante la aplicación de presión suave en la pared abdominal lateral.
- Cierre la incisión con una sutura continua de seda 3-0, y suspender el flujo de isoflurano. Administrar 0,1 mg / kg del opiáceo de acción prolongada -buprenorphine- por vía subcutánea para el control del dolor post-operatorio.
- Observe los animales bajo la lámpara de calor hasta que son móviles a continuación, transferirlos a una jaula continuamente calentado.
3. Cuidado post-operatorio y Monitoreo
- Observar a los animales en una jaula continuamente calentado para signos de sufrimiento para el resto del día. Transfiera los animales de vuelta al centro de cuidado de los animales en una nueva jaula estéril con el acceso a la dieta líquida y agua ad lib. Los animales pueden ser alojados en grupos de 3-4.
- Lleve a cabo un control de los animales después de la operación a la mañana siguiente,aseguran que los animales no aparecen en la angustia. Alimente sólo dieta líquida. Si aparecen incómodo (es decir, postura encorvada o actividad mínima) administrar una dosis adicional de buprenorfina subcutánea. Compruebe en los animales una vez más por la tarde en el día después de la operación 1.
- En la mañana del día después de la operación 2 los animales deben aparecer totalmente recuperado. Evidencia de consumo de alimentos y las deposiciones son signos positivos de recuperación. Ahora, reanudar una dieta de pienso sólido para los animales.
NOTA: Los signos de angustia incluyen postura encorvada, la mala preparación, y la actividad mínima. Si los signos de angustia son prominentes los animales deben ser sacrificados. - La eutanasia a los animales mediante la inducción de la anestesia profunda con 4% de isoflurano a una tasa de flujo de O 2 de 2 L / min hasta que los animales no responden a la presión del pie. Realizar dislocación cervical, y observar si hay signos de eutanasia adecuado.
- Directrices varían, por lo que se refiere a las recomendaciones de las instituciones con respecto a las indicacionesy de métodos apropiados de eutanasia en ratones.
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Representative Results
Las tasas de mortalidad y el cambio de peso después de la operación.
Las tasas de mortalidad siguientes ICR en 129S1 ratones de tipo salvaje son generalmente ~ 5%. La causa más común de la moral es la obstrucción intestinal en la anastomosis. Otras causas de la mortalidad incluyen fuga anastomótica y hernia interna que conduce a la obstrucción intestinal.
La pérdida de peso se puede ver hasta 14 días después de la operación, pero generalmente no es significativa. Los ratones tienden a recuperar completamente peso preoperatoria por post-operatorio día 28 (Figura 2).
La transferibilidad de la técnica
Un nuevo estudiante de posgrado (BM) se le enseñó a realizar el procedimiento de ICR para determinar si un operador sin formación quirúrgica previa podría aprender la técnica. Formación comenzó con el aprendizaje de cómo realizar las suturas interrumpidas simples análogos a los utilizados en la anastomosis usando sutura de nylon 8-0. Las suturas se realizaron para cerrar una incisión hecha a través de un glo látexcinco. Después BM fue capaz de colocar de manera eficiente a través de las suturas del guante sin que se rompa, observaron tres procedimientos completos antes de intentar una. Después de completarse el primer procedimiento, que luego observaron a otro procedimiento y trataron dos más. De los tres animales terminados, los dos últimos pasaron a sobrevivir y prosperar. El primer animal fue sacrificado debido a las complicaciones de la anastomosis.
Figura 1. Etapas de la resección y anastomosis ileocólica. (A) región ileocecal del intestino librado de abdomen. Las flechas negras indican los buques a ligar, líneas discontinuas indican los puntos de transección de colon y el íleon terminal. (B) la región ileocecal eliminado, extremos cortados del intestino están alineados, el suministro de sangre restante se demuestra por flechas negras. (C) Completado anas ileocólicostomosis. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 2. Los pesos de los animales al inicio del estudio, el día después de la operación 14 y post-operatorio día 28. No se observaron cambios significativos en el peso después del procedimiento según lo determinado por la prueba estadística de Mann-Whitney. ICR (grupo de resección ileocólica), de control (controles no quirúrgico).
Figura 3. Representante camino de suturas a través de los tejidos intestinales. H & E manchadas secciones histológicas del íleon (derecha) y de colon (izquierda) se alinearon para demostrar la trayectoria de la sutura neEdle través de los tejidos (línea discontinua) comenzando en el punto (a) hasta el punto (b). El nudo debe ser atado en el punto (c). Tenga en cuenta que menos de la mucosa está incluido en la anastomosis que otros tejidos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
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Discussion
El ICR murino es un modelo de gran alcance que se puede utilizar para estudiar los efectos de la cirugía en enfermedades intestinales. En este artículo se describe un método para realizar ICR en ratones con una tasa de éxito del 95% y no hay problemas con la falta de crecimiento que se refleja en los pesos estables hasta 28 días después del procedimiento. Los desafíos más importantes para el éxito de ICR incluyen evitar obstrucciones intestinales en la anastomosis y fugas anastomóticas.
Elementos técnicos de la cirugía para prevenir la obstrucción se dirigen a maximizar diámetro de la luz en la anastomosis. Espatulado del íleon en el punto de transección aumenta el diámetro del lumen dividiendo el intestino en un ángulo de 30 grados como se representa en la Figura 1A. Al tomar bocados de tejido intestinal con la aguja de sutura, es esencial para desenrollar los bordes del intestino y pasar la aguja a aproximadamente 0,5 mm desde el borde de corte. Excesivamente grandes bocados de tejido serán estrechar el lumen. Una opción para avestrechamiento luminal oid en la construcción de la anastomosis es emplear el uso de un stent digestible tal como se describe por Kiernan et al., 15. Aspectos no técnicos para evitar la obstrucción incluyen la selección de una lo suficientemente pequeña sutura 4 y evitando contenidos luminales voluminosos por la alimentación de los animales con una dieta líquida un día antes de la cirugía y 2 días después de la cirugía.
La segunda causa más común de mortalidad post-operatoria es la fuga anastomótica. Cómo evitar esta complicación requiere el cumplimiento estricto de los principios de la anastomosis intestinal. El ser el primer suministro de sangre adecuado. Después de los vasos que suministran sangre a la región del intestino se resecan se han ligado, el intestino debe ser inspeccionado visualmente antes de la transección. El segmento de intestino isquémico aparecerá oscuro; este debe ser eliminado por completo dejando bordes sanos. Es importante visualizar una pequeña cantidad de sangrado de los bordes cortados del intestino restante. Un anas herméticotomosis también es esencial para evitar el derrame del contenido luminal que conducen a la sepsis. Esto se logra al evitar grandes brechas entre las suturas, y la garantía de que todas las capas del intestino se incluyen en la puntada (Figura 3). La fuerza de la herida disminuye en gran medida en los dos primeros días después de la operación, por lo tanto suturas colocadas correctamente son esenciales para proporcionar resistencia 16,17. Un problema potencial se inadvertidamente sólo incluyendo la mucosa como la mucosa puede arrugarse fuera de la luz del colon seccionado. Esto se puede evitar mediante la visualización del borde de corte de la serosa y suavemente la reducción de mucosa prolapsada de nuevo en el lumen con fórceps.
Controles quirúrgico simulado deben ser considerados en el diseño experimental de los estudios que utilizan el modelo ICR para controlar los potenciales efectos de confusión de estrés quirúrgico, la manipulación intestinal, y / o pérdida de la válvula ileocecal. La elección del procedimiento simulado dependerá de la cuestión principal que se pidió enel estudio. Por ejemplo, si el objetivo de la investigación es evaluar la respuesta del huésped después de perder la válvula ileocecal, entonces sería prudente incluir un grupo de cirugía simulada en la que se realiza una anastomosis intestinal mientras que deja la válvula ileocecal en su lugar. Esto se realiza normalmente por transección del intestino delgado sin resección a continuación, realizar una pequeña anastomosis intestinal en la misma manera que la anastomosis ileocólica 7,11. Esto permitiría a los investigadores a comentar específicamente sobre los efectos de la pérdida de la válvula íleo-cecal mediante el control de los efectos de la anastomosis intestinal. Alternativamente, si el objetivo es sólo para estudiar los efectos de la resección intestinal y anastomosis sin comentar específicamente sobre la pérdida de la válvula ileocecal, y luego una cirugía simulada debe incluir una laparotomía, el intestino y debe ser tratada como lo haría para ICR, pero sin transección y anastomosis. Esto sería para controlar el estrés quirúrgico y la manipulación intestinal. Las técnicas descritas enel protocolo anterior se puede adaptar fácilmente para llevar a cabo los procedimientos simulados.
Este protocolo describe una resección ileocólica, que elimina 1.5-2 cm de íleon terminal y la totalidad del ciego, y imita una operación que se realiza con frecuencia en pacientes con enfermedad de Crohn ileocólica. Procedimientos similares se han utilizado en la IL-10 - modelo de colitis después de lo cual los ratones desarrolló la inflamación espontánea y fibrosis en el intestino delgado análoga a la recurrencia de la enfermedad de Crohn 7,11 - /. Los principios de este procedimiento también se pueden aplicar a otros modelos de la enfermedad. Mediante la eliminación de 50% del intestino delgado con anastomosis ileocólica, se han usado modelos de ratón para investigar la respuesta de crecimiento intestinal de adaptación en el síndrome de intestino corto 4-6. En el futuro esto también puede llegar a ser un modelo útil para el estudio de los efectos sistémicos y locales de la cirugía en el cáncer colorrectal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
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