Protocol
Djur använda protokoll godkändes av Animal Care och användning kommittén hälsovetenskap vid University of Alberta.
1. Beredning av Instrument, Djur och Operative Setup
- Överför djur till en ny, ren bur frånvarande av all fast föda 24 timmar före ingreppet. De kan ha fri tillgång till vatten, och flytande diet ad lib tills tiden för förfarandet.
- Autoklav alla instrument som behövs för förfarandet. Rengör manöverytan och narkos noskon med 70% etanol.
- Ställ in driftsytan med operationsmikroskop, anestesiapparaten och förnödenheter på ett sätt som är bekvämt för opererande kirurgen. Armbågarna av kirurgen bör tillåtas att vila bekvämt på operationsbordet, med händer och armar fri från utrustning. Instrument, suturer, bomullspinnar och en 10 ml spruta ska placeras på en plats som medger enkel åtkomst under förfarandet.
- Konfigureraoverhead värmelampor att ge både värme för djuret under förfarandet och ljuset för verksamhetsytan.
- Fyll en 50 ml koniska rör med 0,9% saltlösning, och ett 1,5 ml rör med vaselin och ställe nära operationsytan.
OBS: Sterilisera alla instrument och kirurgiska förnödenheter. Eftersom tarmen transected är inte steril själva förfarandet. Det anses rena förorenad. Vidta åtgärder för att undvika införandet av exogena smittkällor.
2. Ileocolic resektion med anastomos
- Inducera anestesi genom administrering av 4% isofluran med en syreflödeshastighet av 2 l / min via noskonen från isofluran förångare tills djuren andningshastigheten saktar till cirka 30 till 40 andetag / min. Applicera måttligt tryck på bakfoten på musen för att se till att det finns ingen smärta svar innan inleda förfarandet. Vid denna punkt, dra ner isofluran till 2% och syre flödet till 0,5 l / min. IntermittentKontrollera smärtsvar under förfarandet och justera isofluran flöde därefter.
- Applicera vaselin på ögonen för att förhindra uttorkning under operation, och immobilisera musen i ryggläge med lemmar säkrade med hjälp av genomskinlig tejp.
- Rengör buken med povodine / jodlösning, och byta till nya sterila handskar.
- Gör en 1,5 cm hud snitt i övre mittlinjen av buken med hjälp av vass spets dissekera sax för att exponera fascia och bukhinnan. Öppna fascian / peritoneal skiktet på ett liknande sätt genom linea alba att exponera de peritoneala innehållet.
- I motsats till människor, är musen blindtarmen normalt återfinns i den övre vänstra kvadranten av buken. När detta har skett, försiktigt tag i blindtarmen med pincett och leverera den genom snittet. Använd fuktad bomullstopp för fan ut ca 3 cm av terminala ileum som sträcker sig från blindtarmen över en steril gasbinda draperad på buken ytan (Figur 1A).Säkerställa den exponerade tarm hålls fuktig med 0,9% koksaltlösning under helheten av förfarandet.
- Identifiera ileocecal artär som viker av mesenterica superior längs kolon (Figur 1A) med hjälp av operationsmikroskop. Dissekera ut avaskulära vävnaderna intill ileocecal artären, omringa och ligera artären med en 5-0 sidenslips. Därefter letar du upp regionala blodtillförseln till terminala ileum och välj en transection punkt 1.5-2 cm proximalt ileocecal korsningen. Ligate grenarna till denna del av ileum som ovan. Dela upp artärerna med mikro dissekera sax.
- Dela upp ischemiska delarna av ileum och kolon att det skall finnas tillräcklig blodtillförsel till de avskurna ändarna (figur 1B). Det är ofta praktiskt att spatelformade ileum genom att dividera den vid en 30 graders vinkel för att öka diametern för hålrummet så att det i högre grad överensstämmer med kolon. När ileocecal delen av tarmen har avlägsnats, rikta inavskurna ändarna av ileum och colon på gasväv, garanterar mesenteriala gränser varje är i linje.
- Konstruera anastomosen genom att approximera transected änden av ileum till transected slutet av tjocktarmen med hjälp av avbruten 8-0 polypropylen suturer (Figur 1C). Den första stygnet placeras vid mesenteriska gränsen, med efterföljande suturer placeras var 0,5 mm tills Ileocolic anastomos är vattentät. Vid passage suturnålen genom ileum och kolon, se till att den skurna kanten inte rullas, och nål biter är 0,5 mm från de skurna kanterna av tarmen. En typisk anastomos kommer att kräva 14 till 16 avbrutna suturer. Testa integriteten och öppenheten hos anastomosen efter avslutad genom att rulla en bomullspinne proximalt distalt över ileum att tvinga innehållet genom anastomosen. Små tarminnehåll bör fritt passera in i tjocktarmen utan anastomotisk läckage.
- Skölj det exponerade tarm med 3-4 ml 0,9% saltlösning från 10 ml sprutanatt tvätta bort avföring från ytan av tarmen, och leverera tarm tillbaka in i bukhålan. Med 2 ml av 0,9% saltlösning spola bukhålan, och sedan dränera denna vätska genom ett lätt tryck på bukväggen sidled.
- Stäng snitt med en 3-0 silke kör sutur, och avbryta flödet av isofluran. Administrera 0,1 mg / kg av den långtidsverkande opiat -buprenorphine- subkutant för postoperativ smärtkontroll.
- Observera djuren under värmelampa tills de är mobila sedan överföra dem till en ständigt uppvärmd bur.
3. Postoperativ vård och övervakning
- Övervaka djur i en kontinuerligt värmas bur för tecken på stress under resten av dagen. Överför djur tillbaka till djursjukvårdsinrättning i en ny steril bur med tillgång till flytande diet och vatten ad lib. Djuren kan inhysas i grupper om 3-4.
- Utför en kontroll av postoperativa djur följande morgon,se till att djuren inte visas i nöd. Mata bara flytande kost. Om de verkar obekväma (dvs krökt kroppshållning eller minimal aktivitet) administrera en ytterligare dos av subkutant buprenorfin. Kolla på djuren en gång till på eftermiddagen på postoperativ dag 1.
- På morgonen den postoperativa dag 2 djuren ska visas återhämtat sig helt. Bevis på konsumtion och stooling mat är positiva tecken på återhämtning. Nu, återuppta en solid chow dieten för djuren.
OBS: Tecken på stress inkluderar krökt kroppshållning, dålig grooming, och minimal aktivitet. Om tecken på stress är framträdande djuren bör avlivas. - Avliva djuren genom att inducera djup anestesi med 4% isofluran vid en O 2 flödeshastighet av 2 l / min tills djuren är okänslig för fottryck. Utför cervikal dislokation, och observera tecken på riktig eutanasi.
- Riktlinjer varierar, så hänvisa till institutionernas rekommendationer om indikationerför och lämpliga metoder för eutanasi hos möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dödligheten och viktförändring efter op.
Dödligheten efter ICR i 129S1 vildtyp möss är vanligtvis ~ 5%. Den vanligaste orsaken till moral är tarmvred på anastomosen. Andra orsaker till dödlighet inkluderar anastomotic läcka och interna bråck som leder till tarmvred.
Viktminskning kan ses upp till 14 dagar efter operation, men är i allmänhet icke-signifikanta. Möss tenderar att fullständigt återfå preoperativ vikt genom post-operativ dag 28 (Figur 2).
Överlåtelse av teknik
En ny doktorand (BM) fick lära mig att utföra ICR förfarandet för att fastställa om en operatör utan tidigare kirurgisk träning kan lära sig tekniken. Utbildningen började med att lära sig att utföra de enskilda avbrutna suturer analoga med de som används i anastomosen med hjälp av 8-0 nylon sutur. Suturer utfördes för att stänga ett snitt över en latex glove. Efter BM kunde effektivt placera suturer genom handsken utan att riva, observerade de tre kompletta rutiner innan du försöker en. Efter det första förfarandet avslutades, sedan observerade de ett annat förfarande och försökte två till. Av de tre djuren förda, de två sista gick på att överleva och frodas. Det första djuret avlivades på grund av komplikationer vid anastomos.
Figur 1. Stadier av ileocolic resektion och anastomos. (A) ileocecal region i tarmen som levereras ut från buken. Svarta pilar anger fartyg som skall ligeras, streckade linjer visar tran poäng för kolon och terminala ileum. (B) ileocecal region avlägsnas, skärs ändarna av tarmen linje, återstående blodtillförsel demonstreras av svarta pilar. (C) Genomförd ileocolic anastomosis. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Djurvikter vid studiens början, post-operativ dag 14 och postoperativ dag 28. Inga signifikanta förändringar i vikter observerades efter förfarandet som bestäms med den Mann-Whitney U statistiskt test. ICR (Ileocolic resektion grupp), kontroll (icke-operativa kontroller).
Figur 3. Representant väg suturer genom tarmvävnader. H & E färgade histologiska snitt av ileum (höger) och kolon (till vänster) är uppradade för att visa banan för suturen neEdle genom vävnaderna (streckad linje) som startar vid punkt (a) genom att punkt (b). Knuten bör knytas vid punkt (c). Observera att mindre slemhinna ingår i anastomosen än andra vävnader. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den murina ICR är en kraftfull modell som kan användas för att studera effekterna av kirurgi i tarmsjukdomar. Den här artikeln beskriver en metod för att utföra ICR i möss med en framgång på 95% och inga problem med bristande frodas vilket avspeglas i stabila vikter upp till 28 dagar efter ingreppet. De mest betydande utmaningar för framgångsrik ICR inkluderar undvika tarm hinder på anastomosen och anastomotiska läckor.
Tekniska aspekter till operationen för att förhindra obstruktion syftar till att maximera lumendiameter på anastomosen. Spatel av ileum vid transektion punkt ökar lumendiametern genom att dividera tarmen vid en 30 graders vinkel, såsom visas i Figur 1A. När man tar inslag av tarmvävnad med suturens nål, är det viktigt att rulla kanterna av tarmen och passera nålen cirka 0,5 mm från den skurna kanten. Alltför stora inslag av vävnad kommer att minska lumen. Ett alternativ till AVoid luminal förträngning vid konstruerandet anastomosen är att utnyttja användningen av ett smältbart stent såsom beskrivits av Kiernan et al., 15. Icke-tekniska aspekter för att undvika hinder innefattar att välja en tillräckligt liten sutur 4 och undvika skrymmande luminala innehållet genom att mata djuren en flytande diet en dag före operation och 2 dagar efter operation.
Den näst vanligaste orsaken till postoperativ mortalitet är anastomotisk läcka. Undvika denna komplikation kräver strikt följa principerna för intestinal anastomos. Den första är tillräcklig blodtillförsel. Efter kärlen som försörjer blod till regionen av tarmen som opererande har ligeras bör tarmen inspekteras visuellt före transektion. Den ischemiska segment av tarmen visas dunkel; Detta bör tas bort helt lämnar friska kanter. Det är viktigt att visualisera en liten blödning från de skurna kanterna av den återstående tarmen. Ett vattentätt anastomosis är också viktigt för att undvika spill av luminala innehåll som leder till sepsis. Detta uppnås genom att undvika stora skillnader mellan suturer, och se till att alla lager i tarmen ingår i sömmen (Figur 3). Sår Styrkan är kraftigt minskat under de två första postoperativa dagarna, alltså riktigt placerade suturer är nödvändiga för att ge styrka 16,17. En potentiell fallgrop oavsiktligt endast inklusive slemhinnan som slemhinnan kan rynkas ur lumen i transected kolon. Detta kan undvikas genom att visualisera den skurna kanten av slemhinnorna och försiktigt minska prolapsed slemhinna tillbaka in i lumen med pincett.
Sham kirurgiska kontroller bör beaktas i den experimentella designen av studier med ICR-modellen för att kontrollera för de potentiella felkällor effekter av kirurgisk stress, tarm manipulation och / eller förlust av Ileocekalklaff. Valet av skenförfarande kommer att bero på den primära frågan som ställs istudien. Till exempel, om forskningsuppgiften är att utvärdera värdsvaret efter att ha förlorat Ileocekalklaff, då skulle det vara klokt att ta med en simulerad operation grupp där en tarm anastomos utförs medan ileocecal ventilen på plats. Detta görs vanligtvis genom att transecting tunntarmen utan resektion sedan utföra en tunntarms anastomos på samma sätt som den ileocolic anastomos 7,11. Detta skulle göra det möjligt för utredarna att särskilt kommentera effekterna av Ileocekalklaff förlust genom att kontrollera för effekterna av intestinal anastomos. Alternativt, om målet är bara att studera effekterna av intestinal resektion och anastomos utan att kommentera specifikt på förlust av Ileocekalklaff, då en skenoperation bör innehålla en laparotomi, och tarmen bör behandlas som det skulle för ICR, men utan tran och anastomos. Detta skulle kontrollera för kirurgisk stress och tarm manipulation. De tekniker som beskrivs iprotokollet ovan kan lätt anpassas för utförande av sken förfaranden.
Detta protokoll beskriver en ileocolic resektion, som tar bort 1,5-2 cm terminal ileum och helheten av blindtarmen, och nära efterliknar en operation som ofta utförs på patienter med ileocolic Crohns sjukdom. Liknande förfaranden har använts i det IL-10 - / - kolit modellen efter vilket mössen utvecklade spontan inflammation och fibros i tunntarmen som är analogt med Crohns sjukdom återfall 7,11. Principerna i detta förfarande kan även gälla för andra modeller av sjukdom. Genom att ta bort 50% av tunntarmen med ileocolic anastomos har musmodeller använts för att undersöka det adaptiva tarmtillväxtsvar på kort tarm syndromet 4-6. I framtiden kan det också bli en användbar modell för att studera de systemiska och lokala effekter av kirurgi vid kolorektalcancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
- Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer. European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).
- Rutgeerts, P., Geboes, K., Vantrappen, G. Natural history of recurrent Crohn's disease at the ileocolonic anastomosis after curative surgery. Gut. 25 (6), 665-672 (1984).
- Davis, D., Rivadeneira, D. Complications of colorectal anastomoses: leaks, strictures, and bleeding. The Surgical clinics of North America. 93 (1), 61-87 (2013).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Dekaney, C. M., Fong, J. J., Rigby, R. J., Lund, P. K., Henning, S. J., Helmrath, M. A. Expansion of intestinal stem cells associated with long-term adaptation following ileocecal resection in mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 293 (5), (2007).
- Speck, K. E., De Cruz, P., et al. Inflammation enhances resection-induced intestinal adaptive growth in IL-10 null mice. The Journal of surgical research. 168 (1), 62-69 (2011).
- Rigby, R. J., Hunt, M. R., et al. A new animal model of postsurgical bowel inflammation and fibrosis: the effect of commensal microflora. Gut. 58 (8), 1104-1112 (2009).
- Kostic, A. D., Xavier, R. J., Gevers, D. The Microbiome in Inflammatory Bowel Disease: Current Status and the Future Ahead. Gastroenterology. , 1-11 (2014).
- Gevers, D., Kugathasan, S., et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell host & microbe. 15 (3), 382-392 (2014).
- Ahmed, T., Rieder, F., Fiocchi, C., Achkar, J. P. Pathogenesis of postoperative recurrence in Crohn's disease. Gut. 60 (4), 553-562 (2011).
- Borowiec, A., Sydora, B., et al. Small bowel fibrosis and systemic inflammatory response after ileocolonic anastomosis in IL-10 null mice. Journal of Surgical Research. 178 (1), 147-154 (2012).
- Devine, A. A., Gonzalez, A., et al. Impact of Ileocecal Resection and Concomitant Antibiotics on the Microbiome of the Murine Jejunum and Colon. 8 (8), (2013).
- Bij, G. J., Oosterling, S. J., Beelen, R. H. J., Meijer, S., Coffey, J. C., van Egmond, M. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in patients with colorectal cancer. Annals of surgery. 249 (5), (2009).
- Scott, A. D., Uff, C., Phillips, R. K. Suppression of macrophage function by suture materials and anastomotic recurrence of Crohn's disease. The British journal of surgery. 80 (3), (1993).
- Kiernan, J. A. Intestinal anastomosis in the rat facilitated by a rapidly digested internal splint and indigestible but absorbable sutures. Journal of Surgical Research. 45, 427-431 (1988).
- Andersen, T. L., et al. Action of matrix metalloproteinases at restricted sites in colon anastomosis repair: an immunohistochemical and biochemical study. Surgery. 140 (1), 72-82 (2006).
- Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I. Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).
