Protocol
Hayvan kullanım protokolleri Alberta Üniversitesi Sağlık Bilimleri Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.
Instruments, Hayvanlar ve Operatif Kur'un 1. Hazırlık
- Işlemden önce tüm katı gıda 24 saat bir yeni, temiz bir kafes Evde olmayan hayvanları aktarın. Bu işlemin zamanına kadar su serbest verilmiş ve sıvı diyeti ile ad lib olabilir.
- Prosedür için gerekli tüm enstrümanları otoklavlayın. Temiz çalışma yüzeyi ve% 70 etanol ile anestezi burun konisi.
- Ameliyatı yapan cerrahın rahat bir şekilde ameliyat mikroskobu, anestezik makine ve malzemeleri ile çalışma yüzeyi yukarı ayarlayın. Cerrahın dirsekler elleri ve ekipmanı ile engelsiz kolları, ameliyat masasında rahatça dinlenmek için izin verilmelidir. Instruments, dikişler, pamuklu çubuk ve bir 10 ml şırınga işlemi sırasında kolay erişime izin veren bir konuma yerleştirilmelidir.
- Kurmakhavai ısı lambaları çalışma yüzeyi için prosedür ve ışık sırasında hayvan için sıcaklık hem sağlamak.
- % 0.9 tuzlu su ile 50 ml konik tüp, ve çalışma yüzeyine yakın vazelin ve yer ile 1.5 ml'lik bir tüp doldurun.
NOT: Tüm aletleri ve cerrahi malzemeleri sterilize edin. Bağırsak nakledilmiş olduğu için, bu prosedür kendisini steril değildir. Temiz-kontamine kabul edilir. Enfeksiyon dışsal kaynaklarının giriş önlemek için tedbirler almak.
Anastomoza 2. ileokolonik Rezeksiyon
- Hayvanlarda solunum hızı yaklaşık 30-40 solunum / dk yavaşlatır kadar izofluran buharlaştırıcı gelen burun konisi üzerinden / dak 2 L oksijen akış hızı ile% 4 izofluran verilerek anestezi neden. Prosedürünü başlatmadan önce hiç acı cevap verilmesini sağlamak için fare arka ayak orta basınç uygulayın. Bu noktada, / dak 0.5 L% 2 izofluran ve oksijen akışını kapatmak. Aralıklı olarakİşlem sırasında ağrı yanıtı kontrol ve buna göre izofluran akış hızını ayarlayın.
- Ameliyat sırasında kurumasını önlemek ve saydam bant ile sabitlenmesi uzuvları ile yatar pozisyonda fare hareketsiz gözlerine vazelin uygulayın.
- Povodine / iyot çözeltisi ile karın temizleyin ve yeni steril eldiven dönüşür.
- Fasya ve periton maruz diseksiyon makas keskin noktası kullanarak karnın üst orta hatta 1,5 cm cilt kesi olun. Periton içeriğini ortaya çıkarmak için linea alba üzerinden, benzer bir şekilde, fasyal / periton katman açın.
- İnsanlarda aksine, fare çekum tipik olarak karın sol üst çeyrekte bulunur. Tespit kez, forseps ile yavaşça çekum kavramak ve kesiden teslim. Fana nemlendirilmiş pamuklu çubuk kullanmayın yaklasik karın yüzeyi (Şekil 1A) üzerinde bol dökümlü bir steril gazlı bez üzerine çekum uzanan terminal ileum 3 cm.Maruz kalan bağırsak prosedürün tamamı boyunca% 0.9 tuzlu su ile nemli tutulur emin olun.
- İşletim mikroskop kullanılarak kolon (Şekil 1A) boyunca superior mezenterik arterin dallanma ileoçekal arter tanımlayın. , Ileoçekal arterin komşu avasküler dokuların teşrih kuşatmak ve 5-0 ipek kravat ile arteri bağlayın. Sonra, terminal ileum için bölgesel kan akımını bulmak ve ileoçekal kavşak bir transeksiyonudur nokta 1.5-2 cm proksimalinden seçin. Yukarıdaki gibi ileum bu bölüme dalları bağlayan. Mikro diseksiyon makas ile arterleri bölün.
- Nakledilmiş uçları (Şekil 1B) yeterli kan temini olduğunu sağlanması ileum ve kolon iskemik bölümlerini bölün. O daha yakından kolon eşleşecek şekilde lümen çapını artırmak için 30 derece açıyla bölerek ileuma spatula genellikle yararlıdır. Bağırsağın ileosekal kısmı çıkarıldıktan sonra, hizalamaHer mesentrik sınırlarını sağlanması, tül üzerinde ileum ve kolon transeksiyon uçları hizalanır.
- Kullanarak kolon nakledilmiş sonuna ileum nakledilmiş sonuna yaklaşan tarafından anastomoz Construct 8-0 polipropilen sütür (Şekil 1C) kesildi. Ileokolonik anastomoz su geçirmez kadar sonraki dikişler her 0,5 mm yerleştirilir ile ilk dikiş, mezenterik sınırında yer alır. Ileum ve kolon ile dikiş iğnesi geçerken, kesme kenar haddelenmiş olmadığından emin olun ve iğne ısırıkları barsak kesilmiş kenarlarından 0.5 mm. Tipik bir anastomoz 14-16 kesintiye sütür gerektirir. Anastomoz boyunca içeriğini zorlamak için ileum üzerinde distale bir pamuklu çubukla proksimalinde haddeleme tarafından tamamlanması üzerine anastomoz bütünlüğünü ve açıklığını kontrol edin. İnce bağırsak içeriği özgürce anastomoz kaçağı olmadan kolon içine geçmelidir.
- 10 ml şırınga% 0.9 tuzlu su, 3-4 ml maruz bağırsak durulayınbağırsak yüzeyinden tabure yıkayacak, ve periton boşluğuna geri bağırsak teslim etmek. % 0.9 serum fizyolojik 2 ml kullanarak periton boşluğuna yıkayın ve yanal karın duvarına hafif basınç uygulayarak bu sıvıyı boşaltın.
- 3-0 ipek çalışan sütür ile kesi kapatın ve izofluran akışını durdurma. Post-operatif ağrı kontrolü için -buprenorphine- subkutan uzun etkili opioid 0.1 mg / kg yönetmek.
- Daha sonra mobil olduğu bir sürekli ısıtılmış bir kafeste aktarabilirsiniz kadar ısı lambası altında hayvanları gözlemlemek.
3. Post-operatif Bakım ve İzleme
- Günün geri kalanı için sıkıntı belirtileri için sürekli ısıtılmış bir kafeste hayvan izleyin. Sıvı diyet ve suyla erişimi olan yeni bir steril kafesine geri hayvan bakım tesisi için hayvanları aktarın. Hayvanlar 3-4 gruplar halinde yerleştirilebilir.
- Ertesi sabah post-operatif hayvanlar üzerinde bir kontrol gerçekleştirin,hayvanlar sıkıntı görünmüyor sağlamak. Sadece sıvı diyet besleyin. Onlar rahatsız (yani, kambur duruş ya da minimal aktivite) belirirse derialtı buprenorfmin ilave bir doz yönetmek. Operasyon sonrası gün sayısının 1 öğleden sonra bir kez daha hayvanlar kontrol edin.
- Post-operatif 2 günün sabahı hayvanlar tamamen iyileşti görünmelidir. Gıda tüketimi ve dışkılama kanıtı toparlanma olumlu işaretler vardır. Şimdi hayvanlar için sağlam bir yemeği diyeti devam ettirmek.
NOT: sıkıntı belirtileri kambur duruş, kötü tımar ve minimal aktivite içerir. Distres belirtileri önemli ise hayvanlar öldürüldü olmalıdır. - Hayvanlar kadar 2 litre / dakika arasında bir O 2 akış hızında% 4 izofluran ile derin anestezi uyararak hayvanlar öldürülür ayak basıncı yanıt vermeyen. Servikal dislokasyon gerçekleştirin ve uygun euthanization belirtileri gözlemlemek.
- Kuralları, böylece göstergeleri ile ilgili kurumların önerilerine bakınız değişirve farelerde euthanization uygun yöntemleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ölüm oranları ve ağırlık değişimi post-op.
129S1 vahşi tip farelerde ICR ölüm oranlarının yaklaşık% 5 daha düşüktür. Ahlakın en sık nedeni anastomozdaki bağırsak tıkanıklığı olduğunu. Mortalitenin diğer nedenleri anastomoz kaçağı ve bağırsak obstrüksiyonu önde gelen iç fıtık bulunmaktadır.
Kilo kaybı operasyon sonrası 14 güne kadar görüldüğü gibi, ama genel olarak deforme olmayan önemli olabilir. Fareler tamamen post-operatif gün 28 (Şekil 2) ile pre-operatif kilo kazanma eğilimindedir.
Teknik aktarılabilirliği
Yeni bir yüksek lisans öğrencisi (BM) hiçbir önceki cerrahi eğitimi ile bir operatör tekniği öğrenebilirler belirlemek için ICR yordamı gerçekleştirmek için öğretildi. Eğitim 8-0 naylon sütür kullanılarak anastomoz kullanılanlara benzer tek kesintiye sütür gerçekleştirmek için öğrenme ile başladı. Dikişler bir lateks glo boyunca yapılan bir insizyon kapatmak için yapılmıştırA.Ş.. BM verimli yırtmadan eldivenle stürler başardı sonra, onlar bir denemeden önce üç tam prosedürleri gözlendi. Ilk işlem tamamlandıktan sonra, daha sonra farklı bir prosedür ile gözlendi ve iki çalıştı. Tamamlanan üç hayvandan, son iki hayatta kalmak ve gelişmek için gitti. Ilk hayvan nedeniyle anastomozdaki komplikasyonlara ötenazi edildi.
Barsak Şekil ileokolik rezeksiyon ve anastomoz 1. Aşamaları. (A) İleoçekal bölge karın dışarı teslim. Siyah oklar bağlanacaksa gemiler göstermek, kesik çizgiler kolon ve terminal ileum için transeksiyonudur noktaları gösterir. (B) kaldırıldı İleoçekal bölgesi, bağırsak kesik uçları kalan kan temini siyah oklarla gösterilmiştir hizalanır. (Cı) Tamamlanan ileokolik Anastomosis. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Mann-Whitney U testi ile saptandığı gibi, başlangıçta Şekil 2. Hayvan ağırlıkları, ameliyat sonrası 14. günde ve ameliyat sonrası 28. günde ağırlıklarında önemli bir değişiklik sonrası prosedür izlendi. ICR (ileokolonik rezeksiyon grubu), Kontrol (Non-operatif kontroller).
Özellikle bağırsak dokularındaki yoluyla sütür Şekil 3. Temsilcisi yolu. H & E ileum (sağda) ve kolon (sol) sütür KD yörüngesini göstermek için dizilmiş histolojik bölümleri boyandınoktaya kadar işlem alanına (a) 'dan başlayan dokularda (kesikli çizgi) ile Edle, (b). Düğüm noktası (c) en bağlanmalıdır. Daha az mukoza diğer dokulara göre daha anastomoz dahil olduğunu unutmayın. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Murin ICR bağırsak hastalıklarında cerrahi etkilerini incelemek için kullanılan güçlü bir modeldir. Bu makale% 95 başarı oranı ve yukarı işlem sonrası 28 gün stabil ağırlıkları tarafından yansıtıldığı gibi büyüme geriliği ile hiçbir sorunları ile farelerde ICR performans bir yöntem açıklanır. Başarılı UST için en önemli zorluklar anastomoz ve anastomoz kaçaklarının en bağırsak tıkanıklıkları kaçınarak içerir.
Tıkanıklığı önlemek için cerrahi teknik elemanlar anastomozdaki lümen çapı en üst düzeye çıkarmayı hedeflemektedir. Transeksiyonu noktada ileum spatulasyonla Şekil 1A'da gösterildiği gibi, 30 derecelik bir açıyla bağırsak bölünmesiyle lümen çapını arttırır. Dikiş iğne ile bağırsak dokusunun sokması çekerken, o bağırsağın kenarlarını yuvarlayarak yaklaşık kesim kenardan 0,5 mm iğne geçmek esastır. Aşırı doku büyük ısırıkları lümen daralır. Bir seçenek av içinanastomoz yapımında Kiernan ve ark. 15 tarafından tarif edildiği gibi sindirilebilir bir stent kullanımı kullanılmasıdır oid luminal daralması. Teknik olmayan yönleri tıkanıklık önlemek için yeterince küçük sütür 4 seçilmesi ve bir gün önce cerrahi ve cerrahi sonrası 2 gün hayvanların bir sıvı diyet beslenmesi ile büyük hacimli lümen içeriğini kaçınarak içerir.
Post-operatif mortalite ikinci en yaygın nedeni anastomoz kaçağı olduğunu. Bu komplikasyonu kaçınmak intestinal anastomoz ilkelerine sıkı sıkıya bağlı kalınmasını gerektirir. Ilk olmanın yeterli kan temini. Bağırsak bölgeye kan tedarik ligatüre edilmiştir rezeke edildikten sonra, bağırsak görsel transeksiyo- önce kontrol edilmelidir. Bağırsak iskemik segment esmer görünecektir; Bu tamamen sağlıklı kenarları bırakarak çıkarılmalıdır. Geri kalan bağırsak kesim kenarlarından kanama bir miktar görselleştirmek için önemlidir. Bir su geçirmez anastomosis sepsis giden lümen içeriğinin dökülmesini önlemek için de önemlidir. Bu, (Şekil 3), ameliyat dikiş iplikleri arasında büyük boşlukları önleyen ve bağırsakta bütün tabakaları dikiş dahil edilmesinin sağlanması ile elde edilir. Yara gücü büyük ölçüde ilk iki post-operatif gün içinde azalır, böylece düzgün yerleştirilmiş dikişler gücü 16,17 sağlamak için gereklidir. Bir potansiyel tehlike yanlışlıkla sadece mukoza nakledilmiş kolon lümeni dışında pucker gibi mukozayı de dahil olmak üzere. Bu forseps ile lümenine geri sarkması mukozasını azaltarak yavaşça serozanin kesme kenarı görselleştirme ve önlenebilir.
Sham cerrahi kontrol cerrahi stres, bağırsak manipülasyon, ve / veya ileoçekal valf kaybı potansiyel şaşırtıcı etkileri kontrol etmek için ICR modeli kullanılarak çalışmaların Deney tasarımında dikkate alınmalıdır. Birincil soruya bağlıdır sahte prosedürün seçimi soruluyorçalışma. Araştırmanın amacı ileoçekal valf kaybettikten sonra konak yanıtı değerlendirmek için ise Örneğin, o yerde ileoçekal valf bırakarak bir bağırsak anastomoz edildiği bir sham grubu dahil etmek akıllıca olacaktır. Bu genellikle rezeksiyon sonra ileokolik anastomoz 7,11 ile aynı şekilde, bir ince barsak anastomoz yapmadan ince bağırsağa bölücü tarafından yapılır. Bu araştırmacılar intestinal anastomoz etkileri kontrol ederek ileoçekal valf kaybının etkileri özellikle yorum için izin verecek. Alternatif gol ileoçekal valfin kaybında özellikle yorumda bulunmadan bağırsak rezeksiyonu ve anastomoz etkilerini incelemek için sadece eğer, o zaman bir sham laparotomi içermelidir, ve bağırsak o ICR için olduğu gibi tedavi, ama transection olmadan edilmelidir ve anastomoz. Bu cerrahi stres ve bağırsak manipülasyon için kontrol edecektir. Açıklanan tekniklerYukarıdaki protokol kolayca sahte prosedürlerin yerine getirilmesi için adapte edilebilir.
Bu protokol 1.5-2 terminal ileum cm ve çekum tamamını ortadan kaldıran bir ileokolik rezeksiyon, açıklar ve yakından bir işlem sık sık ileokolik Crohn hastalığı olan hastalarda yapılan taklit eder. - / - Farelerde Crohn hastalığı nüks 7,11 benzer ince bağırsakta spontan inflamasyon ve fibrozis gelişmiş sonra kolit modelinde benzer prosedürler IL-10 kullanılmıştır. Bu prosedürün ilkeleri de hastalığın diğer modeller için geçerli olabilir. Ileokolik anastomoz ile ince barsağın% 50 kaldırarak, fare modelleri kısa bağırsak sendromu 4-6 adaptif bağırsak büyüme yanıtını araştırmak için kullanılmıştır. Gelecekte, bu ayrıca, kolorektal kanserde cerrahi sistemik ve lokal etkilerini çalışmak için faydalı bir model olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
- Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer. European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).
- Rutgeerts, P., Geboes, K., Vantrappen, G. Natural history of recurrent Crohn's disease at the ileocolonic anastomosis after curative surgery. Gut. 25 (6), 665-672 (1984).
- Davis, D., Rivadeneira, D. Complications of colorectal anastomoses: leaks, strictures, and bleeding. The Surgical clinics of North America. 93 (1), 61-87 (2013).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Dekaney, C. M., Fong, J. J., Rigby, R. J., Lund, P. K., Henning, S. J., Helmrath, M. A. Expansion of intestinal stem cells associated with long-term adaptation following ileocecal resection in mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 293 (5), (2007).
- Speck, K. E., De Cruz, P., et al. Inflammation enhances resection-induced intestinal adaptive growth in IL-10 null mice. The Journal of surgical research. 168 (1), 62-69 (2011).
- Rigby, R. J., Hunt, M. R., et al. A new animal model of postsurgical bowel inflammation and fibrosis: the effect of commensal microflora. Gut. 58 (8), 1104-1112 (2009).
- Kostic, A. D., Xavier, R. J., Gevers, D. The Microbiome in Inflammatory Bowel Disease: Current Status and the Future Ahead. Gastroenterology. , 1-11 (2014).
- Gevers, D., Kugathasan, S., et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell host & microbe. 15 (3), 382-392 (2014).
- Ahmed, T., Rieder, F., Fiocchi, C., Achkar, J. P. Pathogenesis of postoperative recurrence in Crohn's disease. Gut. 60 (4), 553-562 (2011).
- Borowiec, A., Sydora, B., et al. Small bowel fibrosis and systemic inflammatory response after ileocolonic anastomosis in IL-10 null mice. Journal of Surgical Research. 178 (1), 147-154 (2012).
- Devine, A. A., Gonzalez, A., et al. Impact of Ileocecal Resection and Concomitant Antibiotics on the Microbiome of the Murine Jejunum and Colon. 8 (8), (2013).
- Bij, G. J., Oosterling, S. J., Beelen, R. H. J., Meijer, S., Coffey, J. C., van Egmond, M. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in patients with colorectal cancer. Annals of surgery. 249 (5), (2009).
- Scott, A. D., Uff, C., Phillips, R. K. Suppression of macrophage function by suture materials and anastomotic recurrence of Crohn's disease. The British journal of surgery. 80 (3), (1993).
- Kiernan, J. A. Intestinal anastomosis in the rat facilitated by a rapidly digested internal splint and indigestible but absorbable sutures. Journal of Surgical Research. 45, 427-431 (1988).
- Andersen, T. L., et al. Action of matrix metalloproteinases at restricted sites in colon anastomosis repair: an immunohistochemical and biochemical study. Surgery. 140 (1), 72-82 (2006).
- Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I. Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).
