Protocol
1. CRISPR Design
- Design sgRNAs manuellt eller med hjälp av fritt tillgängliga onlineverktyg 7. Använd dessa verktyg för att hjälpa till att identifiera styrsekvenser som minimerar identiska iska tändstickor eller nära-matcher för att minska risken för klyvning ifrån målställen (ej åsyftade effekter). Kontrollera att styr sekvenser består av en 20-mer ("protospacer sekvens") uppströms om en "NGG" sekvens ("protospacer intilliggande motiv" eller PAM) vid den genomiska igenkänningsstället.
OBS: Figur 1 beskriver möjliga strategier radering för gener och icke-kodande element. För att skapa en gen knockout, kommer två sgRNA ligger inom exoner berikar ens monoallel deletionskloner för förlust av funktion. Detta beror på den höga frekvensen av InDels bildade av icke-raderade alleler 12, som sannolikt kommer att orsaka ramskiftningsmutationer leder till nonsens medierad sönderfall av mRNA-transkriptet (Figur 1B). - Användexempel guider för den avsedda stryka Pim1 i mus (Mus musculus, Tabell 1, Figur 2A).
OBS: I det här exemplet, sgRNA-A: s protospacer sekvens och PAM råkar falla på botten (Crick) strängen medan sgRNA-B: s protospacer sekvens och PAM falla på toppen (Watson) strängen (Figur 2A). Dock kommer DSB ske oberoende av orientering protospacer sekvensen / PAM i förhållande till den övre eller nedre del. - Bestäm det omvända komplementet (rc) hos varje styrsekvens. Exempel omvänd komplementsekvenserna för Pim1 sgRNA från tabell 1 visas i tabell 2.
- Skaffa 24- eller 25-mer oligonukleotider för varje guide och dess tillhörande omvända komplement inklusive ytterligare nukleotider för kloning och uttryck ändamål.
OBS: Här diskuterar vi användningen av pSpCas9 (BB) plasmid (pX330) (Addgene plasmid-ID 42230). Denna plasmid medger samtidiguttryck av sgRNA och SpCas9, men innehåller inte markörer för val 7. Andra konstruktioner kan användas, såsom pX458 (Addgene plasmid-ID 48138) eller pX459 (Addgene plasmid-ID 48139), som omfattar GFP och puromycin som selekterbara markörer, respektive, eller konstruktioner i vilka multipla sgRNAs kan uttryckas från en enda plasmid.- Lägg "CACC" före 20-mer-styrsekvens och "AAAC" innan guidens omvända komplementet för kloning in i pX330 vektorn genom användning Bbsl restriktionsenzym (tabell 3).
- Lägg ett G nukleotid efter CACC sekvensen och före den 20-mer om den första positionen för 20-meren inte är G. sgRNA expression från U6 promotorn i pX330 vektorn förstärks genom inneslutning av en G-nukleotid efter CACC sekvensen . Lägg ett C vid 3'-änden av det omvända komplementet oligo (t.ex. sgRNA-A i tabell 4). De resulte oligos skulle vara 25-mer oligos.
- Hurnågonsin, om den första positionen för 20-mer (protospacer sekvens) är G, inte lägga till ytterligare G (t.ex. sgRNA-B i tabell 4) och inte lägga C till den slutliga positionen av den omvända komplement oligo. I detta fall skulle de resulterande oligona vara 24-mer oligos (tabell 4).
2. Design Deletion Screening Primrar
- Design en uppsättning primrar interna till den sekvens som skall raderas ("icke-deletion bandet") och en annan uppsättning primrar uppströms och nedströms av sgRNA klyvningsställena ("radering band", fig 1 - 2). I avsaknad av radering, är "raderband" ofta för stora för att på ett effektivt sätt förstärka. Vanligtvis använder primers minst 100 bp från den förutsagda klyvningsstället för att säkerställa upptäckt inte skulle påverkas av en liten Indel på sgRNA målplatsen.
- Designa ytterligare primers att analysera för ärrbildning (små InDels produceras vid sgRNA cleavage webbplats utan den avsedda text utgår). Använd ett par framåt och bakåt primers flankerar varje sgRNA målplats (inom 150-350 bp) att förstärka sgRNA målplatsen att undersöka för ärrbildning. Detta kan vara användbart för att karaktärisera de icke-raderade allelen i monoallel deletionskloner.
- För små deletioner (som "raderband" kan fortfarande förstärka), lösa amplikoner på en agarosgel för att avgöra om storleken är förenlig med närvaron eller frånvaron av radering. För detta tillvägagångssätt, kan de interna primers som beskrivs i steg 2.1 utelämnas.
3. CRISPR Kloning
- Annelera och fosforylerar oligos.
- Resuspendera oligos vid en koncentration av 100 iM i DDH 2 O.
- Förbered en 10 pl reaktionsblandning för varje guide och dess omvända komplement: 1,0 l sgRNA 24- eller 25-mer oligo (100 iM; se steg 1.4), 1,0 l sgRNA 24- eller 25-mer bakåt complement oligo (100 uM; se steg 1.4), 1,0 pl 10x T4 ligeringsbuffert, 6,5 pl DDH 2 O, och 0,5 ^ il T4-polynukleotidkinas (PNK) (10.000 U / ml).
OBS: fosforyleras oligos kan beställas istället. För detta tillvägagångssätt, är användningen av T4 PNK utelämnas. - Anneal i en termocykler under användning av följande parametrar: 37 ° C under 30 min; 95 ° C under 5 min och sedan ramp ner till 25 ° C vid 5 ° C / min.
- Späd oligos 1:10 i DDH 2 O (t.ex., 1,0 | il glödgade oligos + 9,0 | il ddHaO 2 O för att ge en koncentration av 1 | iM).
- Ligera glödgade oligos till pX330 med en Golden Gate monteringskloningsstrategi 26.
- Förbered en 50 pl reaktionsblandning: 100 ng cirkulär pX330 vektor, 1.0 l glödgade oligos (1 ^ M; se steg 3.1.4), 5,0 l restriktionsenzymbuffert (10x), 4,0 l (20 U) Bbsl restriktionsenzym (5,000 U / ml), 5,0 μl ATP (10 mM), 0,25 ^ il (5 pg) BSA (20 mg / ml), 0,375 | il (750 U) T4 DNA-ligas (2000000 U / ml) och H2O till en slutlig volym av 50 | il. Denna reaktion kan skalas ned till en mindre slutlig volym om nödvändigt.
- Kör prover i en termocykler med användning av följande parametrar: Cykler 1-20 (37 ° C under 5 min, 20 ° C under 5 min); Cykel 21 (80 ° C under 20 min). Dessa cykelförhållandena tillåter för matsmältningen och ligering för att förekomma i en reaktion (se steg 3.2).
- Omvandla 10 pl av DH5a E. coli celler med 1 l av reaktion (från 3.2.1 - 3.2.2).
- Plate på en lysogeni buljong (LB) agarplatta med 100 ug / ml ampicillin och inkubera O / N vid 37 ° C.
- Plocka 2-3 kolonier och ympa in en mini-prep kulturen.
- Utför mini-prep för varje prov och sekvensera varje koloni med hjälp av en U6 promotor framåt primer: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Detta är arepresentative sekvenseringsprimer; andra flankerande primrar kan användas.
- Välj en sekvens-verifierad koloni och ympa in en maxi-prep kulturen. Prep storlek kan skalas utifrån önskad DNA avkastningen.
- Utför maxi-prep för varje CRISPR / Cas9 konstruktion.
4. transfekterar CRISPRs i celler av intresse
OBS: Detta protokoll omfattar leverans av CRISPR / Cas9 plasmider genom elektroporering 27. Detta protokoll beskrivs i detalj för murin erytroleukemi (MEL) celler, en suspension cellinje. Odlingsmediet i alla steg består av DMEM kompletterat med 2% penicillin / streptomycin och 1% L-glutamin, vilken används för MEL-celler. Emellertid kan övergående transfektion av CRISPR / Cas9 plasmider framgångsrikt anpassas till många celltyper använder föredragna odlingsbetingelser och transfektion strategier för varje celltyp. Medan MEL celler suspensionsceller, instruktioner för vidhäftande celler have också inkluderats.
- Se till att det finns 2 x 10 6 celler per CRISPR paret. Resuspendera 2 x 10 6 celler i 100 | il av elektroporation lösning och lägg till elektroporationskyvett.
- Lägg 5 mikrogram av varje CRISPR / Cas9 konstruktion (10 ug totalt). Lägg 0,5 ug av GFP-expressionskonstruktionen.
- Electroporate celler med 250 volt för 5 ms i en 2 mm kyvett med hjälp av ett elektrosystemet.
OBS: Du kan använda en annan transfektion metod såsom katjonisk liposom baserad transfektion. Optimera transfektion villkor för varje cellinje med en reporter konstruktion för att säkerställa robust plasmid leverans innan genomet redigering. - Överför omedelbart lösningen från kyvetten i 1 ml odlingsmedia efter elektroporering. Minimera tiden mellan elektroporering och överföra lösningen i media för att öka cellernas livskraft.
- Inkubera vid 30-37 ° C för 24 - 72 timmar. 30 ° C kan öka genometredigering effektivitet, men 37 ° C är godtagbar.
5. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) av transfekterade celler
- Förbered celler för FACS genom att filtrera dem genom ett 50 pm filter till en FACS rör.
- FACS sorterar toppen ~ 3% av GFP-positiva celler i syfte att anrika celler som fick höga nivåer av CRISPR / Cas9 konstruktionerna.
- Plate sorterade celler individuellt i 96-brunnars rundbottnade plattor med användning av sorterare eller genom att använda begränsande utspädning vid 30 celler per 96-brunnars rundbottnad platta. Optimera plätering den celltyp som används till att begränsa utspädning innan du utför detta steg för att på ett tillförlitligt sätt erhålla cirka 30 celler per 96-brunnar.
- Inkludera 100 pl per brunn av cellodlingsmedia.
- För de återstående sorterade cellerna ("bulk") som inte har pläterade, frysa hälften av cellerna för framtida plätering. Plate den andra halvan för screening och primer validering (se steg 6).
OBS: Denna protocol är för suspensionsceller. Vidhäftande celler kan antingen växa som enskilda celler i 96-brunnars flatbottnad platta eller i en 10 cm skål vid låg koncentration så att enskilda encelliga härledda kloner kan plockas och flyttas till en flatbottnad 96-brunnsplatta. - Tillåt bulk cellerna att inkubera vid 37 ° C under 3-7 dagar och låta klonerna att inkubera vid 37 ° C under 7 - 14 dagar. Vary dessa tider beroende på fördubblingstiden för den använda cellinjen.
OBS: Denna inkubationstid möjliggör tillräcklig celltillväxt för screening iskt DNA (gDNA) för den avsedda raderingen genom PCR (se steg 6.1 och 7.1). De bulk cellerna har tillräckligt proliferated när koncentrationen överstiger ~ 100.000 celler / ml eller för vidhäftande celler har cellerna nått ~ 80% konfluens. Klonerna har tillräckligt frodats gång makroskopiskt synliga med ~ 2 mm diameter.
6. Primer Validering och Screening för CRISPR / Cas9-medierad radering
- Isolera gDNA från föräldra och bulk sorterade celler genom återsuspendering paren och bulk cellpelletar i 50 | il DNA-extraktionslösningen.
OBS: I allmänhet ~ 100.000 celler används för DNA-extraktion, även om ett brett spektrum av cellantal är acceptabelt. Bulk sorterade cellerna består av en polyklonal population utsätts för sgRNA-A och sgRNA-B (se steg 5). Syftet med följande PCR är att validera primrar och verifiera förekomsten av avsedd genomisk deletion. - Kör provet i termocykler och kör följande program: 65 ° C under 6 min, 98 ° C under 2 min för att extrahera gDNA. Mät DNA-koncentrationen.
OBS: Medan stegen 6,1 och 6,2 rekommenderar en effektiv metod för DNA-extraktion, kan vilken metod som helst för genomisk DNA-isolering utnyttjas för att kunna utföra PCR i steg 6,3. - Montera en 20 pl PCR med följande komponenter: 10 pl 2x PCR-blandning, 0,5 pl framåt primer (10 _6; M), 0,5 | il omvänd primer (10 | iM), 50 till 100 ng gDNA, och H 2 O upp till 20 | il. Använd primrar utformade i steg 2 ovan. Genomföra PCR för "icke-raderband" och "radering band" i separata reaktioner.
OBS: Många polymeraser kan användas för steg 6.3.- Kör prover i en termocykler med användning av följande parametrar: 95 ° C under 15 min, 35 cykler av (95 ° C under 30 sek, 60 ° C under 1 min, 72 ° C under 1 min) och 72 ° C under 10 min . Optimera PCR förutsättningar för varje primerpar utformad utifrån testa bulk sorterade cellerna.
- Kör prov på 2% agarosgel vid 10 V / cm med användning av 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert.
- Undersök prover för närvaro / frånvaro av icke-deletion och borttagning band (Figur 2). Betrakta multiplexering den "radering" och "icke-radering" PCR-primerpar i en enda reaktion. Optimera multiplexeringi en polyklonal population (dvs, bulk sorterade celler) innan screening individuella kloner. Det är viktigt att de radering och icke-radering amplikoner lösas enkelt på en agarosgel för multiplexering.
7. Screening CRISPR / Cas9 kloner för Strykningar och Clone Selection
- För suspensionsceller, överföra alla kloner till en enda 96-brunnsplatta som redan innehåller 50 | il cellodlingsmedia per brunn för en slutlig volym av 150 | il. Detta underlättar screening genom att tillåta en flerkanalspipett som skall användas för återstoden av stegen i steg 7.
- Överför 50 ul från varje brunn (vilket lämnar 100 pl i varje brunn) till en 96-brunnars PCR-platta med användning av en flerkanalspipett.
- Centrifugera PCR-platta vid 400 xg under 5 min och avlägsna supernatanten genom att ställa PCR-plattan över en vask. Lägg 50 pl DNA extraktionslösning per brunn och resuspendera. Fortsätt till steg 7,3 för suspensionsceller.
- För anhängare celler, aspirera media. Lägg 20 pl av 0,05% trypsin-EDTA till varje brunn med en klon närvarande.
- Resuspendera cellerna i 200 | il medium. Pipett blanda för att lösgöra celler.
- Plate 100 il vardera i två separata 96-brunnars flatbottnade plattor. Håll en platta för att möjliggöra kloner att växa och använda den andra plattan för att screena varje klon för strykningar.
- Tillsätt ytterligare 100 | il till varje brunn för en total volym av 200 | il. Vänta 24-72 tim för att låta cellerna växa.
- Aspirera media. Lägg 50 pl DNA extraktionslösning per brunn, resuspendera och transfer till 96-håls PCR-platta. Fortsätt till steg 7.3.
- Extrahera gDNA från kloner. Kör provet i termocykler: 65 ° C under 6 min och 98 ° C under 2 min för att extrahera gDNA.
- Screen varje klon med användning av samma PCR-primrar och reaktionsbetingelser som är optimerade på bulk- celler (se steg 6).
- Välj kloner idenfierades med önskad radering och flytta till större platta eller kolv för tillväxt.
8. Validering av biallelisk deletionskloner
- För att karakterisera erhållna kloner och validera en framgångsrik knockout, utvärdera kloner på DNA samt RNA och / eller proteinnivåer.
- För att utvärdera DNA amplifiera radering band från bialleliska deletionskloner med en korrekturläsning polymeras och klona amplikonema (t.ex., med en PCR-kloningskit) i en plasmidvektor. Omvandla plasmiden i DH5a E. coli-celler och platta på LB-agarplattor med det relevanta antibiotikumet. Markera flera kolonier, mini-prep var och en, och låta varje klon till Sanger-sekvense att karaktärisera varje radering allel 28-30. Upprepning PCR-testet för radering efter den inledande skärmen säkerställer att rätt klonen valdes och reproducerbarhet av resultaten.
- För att utvärdera RNA, utföra RT-qPCR för gene uttryck av den relevanta genen 30,31.
- För att utvärdera proteinet, utför en immunoblot med användning av en antikropp mot det relevanta proteinet 33.
Representative Results
Målet med detta experiment var att stryka Pim1 i MEL celler. Användning av flera icke-överlapp sgRNA paren (dvs oberoende protospacer sekvenser) kan hjälpa till att kontrollera för off-mål effekter (Figur 1A). En konsekvent fenotyp skulle vara mer sannolikt att resultera från en on-target effekt i motsats till en gemensam off-target effekt som delas av flera oberoende protospacer sekvenser. Varje par skulle leda till produktion av en unik radering brytpunkt. Om nära tillsammans (dvs., n mindre än ~ 150 bp), kan samma screenings primrar användas för att detektera deletioner som produceras av varje uppsättning av sgRNAs. Genomiska deletioner kan störa gener genom användning sgRNA par på olika platser i förhållande till genen (Figur 1B). Till exempel kan den sgRNA paret flankera en gen för deletion av hela genen kroppen; paret kunde lokaliseras inom två exoner, med potential att skapa frame InDels även om en eller båda allelenes inte bort; eller paret kan flankera en specifik exon att tillåta avbrott i en viss isoform.
Strykningen strategi som används för Pim1 var att designa flankerar sgRNAs att radera hela genen kroppen, en 8 kb deletion (Figur 2). Denna strategi valdes delvis på grund av den relativt lilla storlek Pim1 genen. Detta exempel visar en PAM (grön) på ovansidan (Watson) strängen och en PAM på botten (Crick) strängen; dock DSB oberoende av PAM sekvens lokalisering till toppen eller botten strängen. sgRNA paren kan ha båda PAM sekvenser på toppsträngen, både på den undre strängen, eller en av varje. Med användning av ovan beskrivna protokollet, har två sgRNA utformade, klonad in i pX330 expressionsvektom, och levereras till MEL-celler genom elektroporering tillsammans med en GFP reporter (Figur 2A). Toppen 3% av GFP + celler sorterades två dagar efter elektroporation och ströks klonalt vid begränsande utspädning. Screening primrar utformades såsom beskrivs i steg 2 och såsom visas i figur 2. PCR-betingelser optimerades med användning gDNA isolerats från paren MEL-celler och från "bulk" sorterade celler.
10 dagar efter plätering, var gDNA isolerad från alla kloner och screenas för radering via PCR, som identifierade icke-radering, monoallel och bialleliska deletionskloner enligt mönster av icke-deletion (ND) och radering (D) amplikoner (Figur 3) . Icke-deletionskloner identifierades som har närvaron av den icke-deletionen amplikon och frånvaron av deletionen amplicon. Monoallel kloner identifierades som att ha närvaro av både den icke-deletion och radering amplikoner. Bialleliska kloner identifierades som att ha frånvaro av den icke-deletionen amplikon och närvaron av deletionen amplicon. För denna strykning, ades 400 kloner screen som identifierades 126 monoallel deletionskloner och 32 biallelisk Delet ion kloner (det är viktigt att notera att radering frekvens varierar med radering storlek 12). Bialleliska deletionskloner valdes ut och flyttade till kolvar med 8 ml av media. Efter att ha låtit fem dagar för expansion genomfördes varje klon testas på nytt med PCR av gDNA att bekräfta bialleliska radering och radering amplikoner utsattes för Sanger-sekvense att identifiera den exakta deletionen (Figur 2B). Heterogenitet inom radering amplikonema speglar ofullkomliga Indel bildande NHEJ reparation. Sekvensering av den icke-deletionsallel i monoallelelic deletionskloner avslöjats InDels i de flesta fall, vilket visar att även den icke-raderade allel ofta redigerad av CRISPR / Cas9, vilket kan vara viktigt för tillämpningar där det krävs både monoallel och bialleliska deletionskloner . RNA isolerades från bialleliska deletionskloner och analyserades med RT-qPCR att bekräfta förlust av Pim1 expression (Figur 4).
sätt ">
Figur 1. Schematisk bild av tänkbara strategier radering. (A) Två exempel sgRNA par för iska deletioner (visas i svart och orange, respektive). De blå pilarna visar primers för att upptäcka icke-rader amplicon och röda pilarna visar primers att upptäcka rader amplicon. sgRNA positionerna 17 och 18 är markerade i rött och blått på sgRNA-webbplatser-A 1 / A 2 och är markerade med lila och orange vid 1 / B 2 B sgRNA-webbplatser-med en röd linje som indikerar det förutspådda Cas9 klyvningen mellan positionerna 17 och 18. (B) CRISPR styrd klyvningar visas som vertikala svarta linjer. De blå pilarna visar primers för att upptäcka icke-rader amplicon och röda pilarna visar primers att upptäcka rader amplicon. Klicka här för att seen större version av denna siffra.
Figur 2. Strategi för att producera och upptäcka radering av Pim1, inklusive sekvense radering och icke-radering alleler. (A) Schematisk av PCR baserad screening strategi att identifiera Pim1 deletionskloner. Ett primerpar ligger internt till radering (blå pilar) och ett primerpar är lokaliserad utanför rader (röda pilar). sgRNA sekvenser (protospacer sekvenser) visas i lila. De vertikala röda linjerna indikerar den förutsagda Cas9 klyvning mellan positionerna 17 och 18 av den sgRNA sekvensen. (B) Sånger sekvense avslöjar Indel bildning vid sgRNA igenkänningsstället. sgRNA sekvenser visas i lila och PAM sekvenser i grönt. Borttagande händelser är shegen genom ett motsvarande antal streck märken och infogningar är markerade med blått. Vertikala röda linjer indikerar förutspått klyvningsställe, mellan positionerna 17 och 18 i sgRNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representant gel identifiera icke-radering, monoallel och bialleliska kloner. För varje klon, representerar det vänstra körfältet den icke-rader amplikon ("ND" i blått) och den högra körfältet representerar rader amplikonen ("D" i rött ). Individuella kloner separeras genom streckade linjer. De tre monoallel deletionskloner är kloner 5, 6, och 2. De tre bialleliska deletionskloner är kloner 15, 17, och 13. Såsom framgår av sekvensdata, strykningen bandet för c lone 13 har en mindre storlek på grund av större strykningar vid radering korsningen.
Figur 4. Förlust av Pim1 uttryck i bialleliska deletionskloner. Pim1 uttryck beräknades för två bialleliska deletionskloner av RT-qPCR. Data normaliserades till GAPDH använder 2 - ΔCt-metoden.
| Protospacer Sequence | |
| sgRNA-A | 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' |
| sgRNA-B | 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' |
Tabell 1. 20-mer protospacer sekvenser för två sgRNA för att stryka Pim1.
543 ">Tabell 2. omvända komplementet till de protospacer sekvenserna för två sgRNA från tabell 1.
| Sekvenser | |
| sgRNA-A | 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' |
| sgRNA-A-rc | 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' |
| sgRNA-B | 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' |
| sgRNA-B-rc | 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' |
Tabell 3. Protospacer sekvenser och deras omvända kompletterar med "CACC" och "AAAC" tillade för kloning i pX330 vektorn med hjälp Bbsl restriktionsenzym.
| Sekvenser | |
| sgRNA-A | 5'- CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' |
| sgRNA-A-rc | 5'- AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 ' |
| sgRNA-B | 5'- CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' |
| sgRNA-B-rc | 5'- AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' |
Tabell 4. sgRNA expression från U6 promotorn i pX330 vektorn förstärks genom tillsats av en G-nukleotid efter CACC sekvensen och före20-mer. Tillsatsen av en extra G nukleotid kräver tillsats av en C-nukleotid vid 3'-änden av den omvända komplementet oligo (t.ex. sgRNA-A). Men om den första positionen för 20-mer (protospacer sekvens) är redan en G nukleotid, finns det ingen anledning att lägga till ytterligare G (t.ex. sgRNA-B) och inget behov av att lägga C till den slutliga positionen av den omvända komplementet oligo.
Discussion
Den CRISPR / Cas9 system kan användas för att generera iska deletioner av olika storlekar. Även om vi har observerat att frekvensen av radering varierar omvänt med avseende på avsedd radering storlek, har vi kunnat återhämta strykningar på upp till 1 Mb, och strykningar upp till 100 kb rutinmässigt ger flera bialleliska bort kloner. Vi har observerat någon förlust i effektivitet sekventiellt införande deletioner i en cellinje. Denna strategi kan användas för skapande av kombinato deletion av ett stort antal gener och element. Processen för att erhålla bialleliska deletionskloner kan påskyndas genom att uppskatta det minsta antalet kloner behövde screenas utifrån radering storlek för att få önskat antal kloner med biallelisk radering 12.
Förmågan att få monoallel radering med frånvaron av biallelisk radering på sannolikhetsfördelning kan tyda cell dödlighet i samband med total förlust av funktion. Låg FRequency eller frånvarande deletioner kan återspegla ett antal scenarier inklusive dålig transfektion, ineffektiva sgRNAs eller ineffektiva PCR screening primers (pga brist på en positiv kontroll för att validera PCR-primers till skärmen för radering). GFP + celler kan användas som ett surrogat för transfektionseffektivitet (se steg 5.2), så en minskning av GFP + celler återspeglar sannolikt dålig transfektion och en resulterande minskad deletion effektivitet. Med hjälp av två olika sgRNA par med oberoende screening primers kan hjälpa till att kontrollera för ineffektiv sgRNA och screening PCR-primers och maximera chanserna att få bialleliska deletionskloner. Cellsortering för GFP + celler berikar för radering alleler. Även detta steg kan utelämnas, kommer utelämnande sannolikt nödvändiggör screening fler kloner för att identifiera dem med monoallel eller bialleliska strykningar. Till den grad att transfektionseffektiviteten kan optimeras, skulle vi förvänta oss genomet redigering effektiviteten förbättras.
(figur 2B). Ofta är dessa alleler verkar vara resultatet av microhomology baserade reparations 34,35. Det bör noteras att PCR-baserad detektionsstrategi beskriver vi inte kommer att identifiera större eller mer komplicerade insertioner, deletioner, inversioner eller omlagringar. Även om dessa händelser är mindre vanliga, har vi observerat kloner där varken deletion eller non-radering amplikoner kunde detekteras, och vid ytterligare undersökning återspeglar dessa mer komplexa utfall.
Vi har observerat omfattande CRISPR / Cas9-förmedlad "ärrbildning" av icke-deletion alleler från monoallel och icke-deletionskloner (se figur 2B). Dessa "ärr" består avsmå InDels produceras vid sgRNA klyvningsstället utan det avsedda radering (dvs, strykning av den mellanliggande segmentet mellan sgRNAs A och B). Dessa ärr avbryter ofta måligenkännande av sgRNA. Vi vill därför uppmana försiktighet retargeting alleler i celler som tidigare exponerats för sgRNAs med samma sgRNAs. En mer framgångsrik retargeting strategi skulle utnyttja unika sgRNA sekvenser skiljer sig från tidigare "ärrade" igenkänningsställen. I de fall när ett par sgRNAs erkänner exonic sekvenser (Figur 1B, botten), kan frame alleler produceras även i avsaknad av radering. Därför kan monoallel deletionskloner anrikas för förlorad funktion på grund av den höga frekvensen av ramskiftningsmutationer på den icke-raderade allel 12.
Ett bekymmer med CRISPR / Cas9 systemet är off-target effekter, dvs genomisk modifiering vid oavsiktliga platser 36-38. Recent rapporter har antytt att kortare styr RNA med 17-19 nukleotider kan minska frekvensen av CRISPR / Cas9-baserade ej åsyftade effekter 39. Dessutom kan en dubbel nicking strategi med två guider per målplatsen med en nickase användas för att skapa DSBs samtidigt minimera ej åsyftade effekter 7. Alternativt analogt med strategier som används för RNAi, föreslår vi att olika par av sgRNAs med icke-överlappande protospacer sekvenser användas för att visa att den observerade fenotypen är ett resultat av den on-målet CRISPR / Cas9 modifiering i motsats till en potential off-target effekt. En praktisk lösning skulle vara att utforma minst två närliggande men icke överlappande sgRNA paren så att en enda uppsättning av screening primers (se steg 2) kan användas för flera sgRNA par (Figur 1A). Dessutom kan komplettera en strykning cellinje genom att återinföra den saknade sekvensen och / eller störd gen bygga ett orsakssamband mellanen given genomisk deletion och fenotyp.
För biologer som arbetar med cellulära modellsystem har RNAi representerat ett kraftfullt verktyg för funktionsgenomik. Dock har begränsningar av denna strategi ingår ofullständig minskning målet mRNA-transkript nivåer, heterogenitet effekten av oberoende reagenser riktar samma gen, och kända ej åsyftade effekter inklusive utsäde baserade och icke-utsäde effekter 40-42. Genome redigering strategier lovar att ta itu med många av dessa problem och utgör en spännande, kompletterande strategi för blivande genetisk störning 8,36,37. Dessutom möjliggör genomet redigering för studier av icke-kodande genetiska element på ett sätt som inte är möjligt med RNAi och utmanande med konventionell inriktning närmar 25. Vi uppmuntrar generation iska strykningar med CRISPR / Cas9 som en robust och specifik metod för att producera och karakterisera förlust-of-funktionen alleler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 DNA ligase (with associated ligation buffer) | New England Biolabs | M0202T | |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| BSA, molecular biology grade | New England Biolabs | B9000S | |
| BbsI restriction enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) | New England Biolabs | R0539S | |
| pSpCas9(BB) (pX330) | Addgene | 42230 | |
| S.O.C. medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| BTX ECM 830 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| BTX solution and 2 mm cuvettes | Harvard Apparatus | 45-0803 | |
| pmaxGFP plasmid | Lonza | VPA-1003 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Epicentre | QE09050 | |
| HotStarTaq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 203443 | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Life Technologies | K2700-20 | |
| Plasmid |  Addgene |
42230 |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. Z. F. N., TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709-1712 (2007).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nature Protocols. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Canver, M. C., et al. Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by CRISPR/Cas9 in Mammalian Cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).
- Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Research. 41 (14), e141 (2013).
- Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9 mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. , (2014).
- Wang, T., et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Niu, Y., et al. Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Xie, K., Yang, Y. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. Molecular Plant. 6 (6), 1975-1983 (2013).
- Waaijers, S., et al.
- Bassett, A. R., Liu, J. L. CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila. Journal of Genetics and Genomics. 41 (1), 7-19 (2014).
- Schwank, G., et al. Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in Intestinal Stem Cell Organoids of Cystic Fibrosis Patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Wu, Y., et al. Correction of a Genetic Disease in Mouse via Use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 13 (6), 659-662 (2013).
- Lappalainen, T. M., et al. Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans. Nature. 501 (7468), 506-511 (2013).
- Bauer, D. E., et al. An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level. Science. 342 (6155), 253-257 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS One. 3, e3647 (2008).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177, 437-447 (2003).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Finney, M., Nisson, P. E., Rashtchian, A.
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR). J. Vis. Exp. (63), e3874 (2012).
- Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas. J. Vis. Exp. (89), e51093 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- McVey, M., Lee, S. E. MMEJ repair of double-strand breaks (director’s cut): deleted sequences and alternative endings. Trends in Genetics. 24 (11), 529-538 (2008).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
- Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnology. , (2014).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32, 279-284 (2014).
- Alemán, L. M., Doench, J., Sharp, P. a Comparison of siRNA-induced off-target RNA and protein effects. RNA. 13 (3), 385-395 (2007).
- Anderson, E. M., et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA. 14, 853-861 (2008).
- Marine, S., et al. Common seed analysis to identify off-target effects in siRNA screens. Journal of Biomolecular Screening. 17 (3), 370-378 (2012).
