Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

Published: January 3, 2015 doi: 10.3791/52118
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1,2,3,4
1Harvard Medical School, 2Division of Hematology/Oncology, Boston Children's Hospital, 3Department of Pediatric Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, 4Howard Hughes Medical Institute
* These authors contributed equally

Protocol

עיצוב 1. CRISPR

  1. sgRNAs עיצוב ידני או באמצעות כלים זמינים באינטרנט באופן חופשי 7. השתמש בכלים אלה כדי לסייע בזיהוי רצפי מדריך שלמזער משחקים הגנומי זהים או קרובה התאמות כדי להפחית את הסיכון של מחשוף מיעד אתרים (השפעות חוץ-היעד). ודא שרצפי המדריך מורכבים מ20-mer ("רצף protospacer") במעלה הזרם של רצף "NGG" ("מוטיב protospacer הסמוך" או PAM) באתר ההכרה הגנומי.
    הערה: איור 1 מתאר אסטרטגיות מחיקה אפשריות עבור גנים ואלמנטי קידוד שאינו. ליצירת נוקאאוט גן, שתי sgRNA ממוקם בתוך אקסונים יעשיר שיבוטים מחיקה אפילו monoallelic לאובדן התפקוד. זאת בשל התדירות הגבוהה של indels נוצר על אללים-נמחק לא 12, שעלול לגרום למוטציות frameshift המובילות לריקבון שטויות בתיווך של תעתיק mRNA (איור 1).
  2. השתמש בדוגמא מנחה למחיקה המיועדת של Pim1 בעכבר (Mus musculus; טבלת 1, איור 2 א).
    הערה: בדוגמא זו, רצף protospacer של sgRNA-וPAM לקרות ליפול על הגדיל התחתון (קריק), בעוד רצף protospacer של sgRNA-B וPAM נופלים על הגדיל (איור 2 א) העליון (ווטסון). עם זאת, DSB יתרחש עצמאי של אורינטציה של protospacer רצף / PAM ביחס לגדיל העליון או תחתון.
  3. לקבוע את ההשלמה ההפוכה (RC) של כל רצף מדריך. דוגמא הפוכה רצפים משלימים של sgRNA Pim1 מהטבלה 1 נמצאות בטבלה 2.
  4. השג של 24 או 25-mer oligos לכל מדריך ומשלימים הפוכים הקשורים אליו כולל נוקלאוטידים נוספים למטרות שיבוט וביטוי.
    הערה: כאן אנו דנים את השימוש של פלסמיד pSpCas9 (BB) (pX330) (ID פלסמיד Addgene 42,230). פלסמיד זה מאפשר בו זמניתביטוי של sgRNA וSpCas9, אך אינו מכיל סמנים לבחירה 7. מבנים אחרים עשויים להיות מנוצלים, כגון pX458 (ID פלסמיד Addgene 48,138) או pX459 (ID פלסמיד Addgene 48,139), הכולל GFP וpuromycin סמנים לבחירה כ, בהתאמה, או בונה שבעלול לבוא לידי ביטוי sgRNAs מרובה מפלסמיד בודד.
    1. הוסף "CACC" לפני רצף 20-mer המדריך ו" AAAC "לפני ההשלמה ההפוכה של המדריך לשיבוט לתוך וקטור pX330 באמצעות אנזים BbsI הגבלה (לוח 3).
    2. הוסף נוקלאוטיד G לאחר רצף CACC ולפני 20-mer אם העמדה הראשונה של 20-mer הוא לא ביטוי ג sgRNA מאמרגן U6 של וקטור pX330 המוגבר על ידי ההכללה של נוקלאוטיד G לאחר רצף CACC . הוסף C בסוף '3 ​​של אוליגו המשלים ההפוך (למשל, sgRNA-בטבלה 4). Oligos התוצאה תהיה oligos 25-mer.
    3. איךאי פעם, אם המיקום הראשון של 20-mer (רצף protospacer) הוא G, לא להוסיף עוד G (למשל, sgRNA-B בטבלה 4) ולא להוסיף ג 'לעמדתו הסופית של אוליגו המשלים ההפוך. במקרה זה, oligos התוצאה תהיה oligos 24 mer (לוח 4).

2. Primers הקרנת מחיקת העיצוב

  1. סט עיצוב אחד פריימרים פנימיים לרצף למחיקה ("להקה הלא-מחיקה") וקבוצה נוספת של פריימרים מעלה או במורד של אתרי מחשוף sgRNA ("להקת מחיקה"; איורים 1-2). בהיעדר המחיקה, "להקת המחיקה" היא לעתים קרובות מדי גדולה כדי להגביר יעילות. בדרך כלל משתמש בפריימרים לפחות 100 נ"ב מאתר מחשוף חזה כדי להבטיח זיהוי לא להיות מושפע מindel קטן באתר היעד sgRNA.
    1. לתכנן פריימרים נוספים כדי לנתח להצטלקות (indels הקטן המיוצר בג sgRNAאתר leavage ללא מחיקה המיועדת). השתמש זוג קדימה לאחור פריימרים איגוף כל אתר יעד sgRNA (בתוך 150-350 נקודות בסיס) כדי להגביר את אתר יעד sgRNA לבחון להצטלקות. זה עשוי להיות שימושי כדי לאפיין את אלל-נמחק לא בשיבוטי מחיקת monoallelic.
  2. למחיקות קטנות (כמו "להקת המחיקה" עדיין עשויה להגביר), לפתור amplicons על ג'ל agarose כדי לקבוע אם הגודל עולה בקנה אחד עם הנוכחות או עדר של מחיקה. לגישה זו, פריימרים הפנימיים המתוארים בשלב 2.1 עשויים להיות מושמטים.

שיבוט 3. CRISPR

  1. לחשל וphosphorylate oligos.
    1. oligos Resuspend בריכוז של 100 מיקרומטר DDH 2 O.
    2. להכין תערובת 10 μl תגובה לכל מדריך והשלמתה ההפוכה: 1.0 sgRNA μl של 24 או 25 אוליגו-mer (100 מיקרומטר; ראה שלב 1.4), sgRNA 1.0 מיקרוליטר של 24 או 25-mer הפוך complemenאוליגו t (100 מיקרומטר; ראה שלב 1.4), 1.0 מיקרוליטר 10x T4 קשירת מאגר, 6.5 μl DDH 2 O, ו 0.5 μl T4 polynucleotide קינאז (PNK) (10,000 U / ml).
      הערה: oligos פוספורילציה ניתן להזמין במקום. לגישה זו, השימוש בT4 PNK מושמט.
    3. לחשל בthermocycler באמצעות הפרמטרים הבאים: 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות; 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן כבש עד 25 מעלות צלזיוס ב 5 מעלות צלזיוס / min.
    4. לדלל oligos 1:10 ב DDH 2 O (למשל, 1.0 מיקרוליטר מרותק oligos + 9.0 μl DDH 2 O להניב ריכוז של 1 מיקרומטר).
  2. oligos לקשור מרותקת לpX330 משתמש באסטרטגית שיבוט הרכבה שער זהב 26.
    1. להכין תערובת תגובה 50 μl: 100 וקטור ng המעגלי pX330, 1.0 מיקרוליטר oligos מורפה (1 מיקרומטר; ראה שלב 3.1.4), חיץ 5.0 μl אנזים הגבלה (10x), 4.0 μl (20 U) אנזים BbsI הגבלה (5000 U / מיליליטר), 5.0 μATP l (10 מ"מ), 0.25 μl (5 מיקרוגרם) BSA (20 מ"ג / מיליליטר), 0.375 μl (750 U) האנזים DNA T4 (2,000,000 U / ml), ו- H 2 O לנפח סופי של 50 μl. תגובה זו עלולה להיות מדורגת עד נפח סופי קטן יותר במידת צורך.
    2. דגימות לרוץ בthermocycler באמצעות הפרמטרים הבאים: מחזורים 1-20 (37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות); מחזור 21 (80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות). תנאי רכיבה על אופניים אלו מאפשרים לעיכול וקשירה להתרחש בתגובה אחת (ראה שלב 3.2).
    3. להפוך 10 μl של DH5α E. תאי coli עם 1 μl של תגובה (מ3.2.1 - 3.2.2).
    4. צלחת על צלחת אגר מרק lysogeny (LB) עם 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. בחר 2-3 מושבות ולחסן לתוך תרבות מיני-הכנה.
    1. לבצע מיני-הכנה עבור כל דגימה ורצף כל מושבה באמצעות פריימר קדימה אמרגן U6: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. זה arפריימר רצף epresentative; פריימרים איגוף אחרים עשויים להיות מנוצלים.
  4. בחר מושבה-מאומת רצף ולחסן לתרבות maxi-הכנה. גודל Prep ניתן לשנותם על בסיס תשואת DNA הנדרשת.
  5. בצע maxi-הכנה לכל מבנה / Cas9 CRISPR.

4. transfecting CRISPRs לתאים של ריבית

הערה: פרוטוקול זה כרוך באספקה ​​של CRISPR פלסמידים / Cas9 ידי electroporation 27. פרוטוקול זה מתואר בפירוט לerythroleukemia העכברי תאים (MEL), קו תא השעיה. מדיום התרבות בכל הצעדים מורכב DMEM בתוספת 2% פניצילין / סטרפטומיצין ו 1% L- גלוטמין, המשמש לתאי MEL. עם זאת, transfection החולף של CRISPR / פלסמידים Cas9 עשוי להיות מותאם בהצלחה לסוגים רבים של תאים באמצעות תנאי תרבות מועדפות ואסטרטגיות transfection לכל סוג תא. בעוד תאי MEL הם תאי השעיה, הוראות לh תאים חסידave נכלל גם.

  1. ודא שיש 2 x 10 6 תאים לכל זוג CRISPR. Resuspend 2 x 10 6 תאים בפתרון של electroporation 100 μl ולהוסיף לקובט electroporation.
    1. הוסף 5 מיקרוגרם של כל CRISPR / מבנה Cas9 (10 מיקרוגרם סך הכל). הוסף 0.5 מיקרוגרם של מבנה ביטוי GFP.
  2. תאי electroporate עם 250 וולט עבור 5 אלפית שניים בקובט 2 מ"מ באמצעות מערכת electroporation.
    הערה: לחלופין להשתמש בשיטת transfection אחרת כגון transfection מבוסס liposome קטיוני. לייעל את תנאי transfection לקו כל תא עם כתב לבנות כדי להבטיח אספקת פלסמיד חזקה לפני שתנסה עריכת הגנום.
  3. מייד להעביר פתרון מקובט לתוך 1 מיליליטר של תקשורת בתרבות לאחר electroporation. לצמצם את הזמן בין electroporation והעברת הפתרון לתקשורת כדי לשפר את כדאיות תא.
  4. לדגור על 30-37 מעלות צלזיוס במשך 24-72 שעות. 30 מעלות צלזיוס עשויה לשפר את הגנוםעריכה יעילות, אך 37 ° C מקובל.

Cell הופעל 5. הקרינה מיון (FACS) של תאי transfected

  1. הכן תאים לFACS ידי סינונם דרך מסנן 50 מיקרומטר לתוך צינור FACS.
  2. FACS למיין% העליונים ~ 3 תאים חיוביים GFP כדי להעשיר לתאים שקיבלו רמות גבוהות של CRISPR / Cas9 בונה.
  3. פלייט תאים ממוינים בנפרד לתוך צלחות מסביב לתחתית 96-היטב באמצעות סדרן או באמצעות דילול מגביל ליום 30 בתאים לכל 96 היטב מסביב לתחתית צלחת. לייעל ציפוי סוג התא בשימוש בהגבלת דילול לפני ביצוע צעד זה כדי לקבל באופן מהימן כ 30 תאים לכל צלחת 96-היטב.
  4. כולל לכל גם של תקשורת בתרבות תא 100 μl.
  5. לתאים הנותרים מסודרים ("בתפזורת") שלא מצופים, להקפיא מחצית מתאי ציפוי עתיד. פלייט את החצי השני להקרנה ואימות פריימר (ראה שלב 6).
    הערה: p זהrotocol הוא לתאי השעיה. תאים חסיד באפשרות לגדול תאים בודדים כמו בצלחת תחתונה 96-גם שטוחה או בצלחת 10 סנטימטר בריכוז נמוך, כך שיכולים להיות הרים שיבוטים נגזרים מתא בודד בודד ועברו לצלחת 96-היטב תחתית שטוחה.
  6. אפשר התאים בתפזורת כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-7 ימים ולאפשר השיבוטים כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 7-14 ימים. להשתנות פעמים אלה תלוי בזמן ההכפלה של קו התא בשימוש.
    הערה: זמן דגירה זה מאפשר להתפשטות תאים מספיקה לסינון הדנ"א הגנומי (gDNA) למחיקה התכוונה PCR (ראה שלבים 6.1 ו -7.1). התאים בצובר מספיק התרבו כאשר הריכוז עולה ~ 100,000 תאים / מיליליטר או לתאים חסיד, התאים הגיעו ~ מפגש 80%. השיבוטים התרבו פעם macroscopically גלוי עם קוטר ~ 2 מ"מ מספיק.

6. פריימר אישור ומחיקת הקרנה לCRISPR / תיווך Cas9

  1. לבודד gDNA מהתאים ממוינים הורים וכמויות גדולים על ידי resuspending כדורי תא הוריים ותפזורת ב -50 μl של פתרון מיצוי DNA.
    הערה: בדרך כלל ~ 100,000 תאים משמשים להפקת DNA, למרות מגוון רחב של מספרים סלולריים מקובל. התאים בתפזורת מסודרים מורכבים מאוכלוסיית polyclonal נחשפה לsgRNA-וsgRNA-B (ראה שלב 5). המטרה של PCR הבא היא כדי לאמת פריימרים ולאמת את הנוכחות של מחיקה הגנומי מיועדת.
  2. הפעל מדגם בthermocycler ולהפעיל את התכנית הבאה: 65 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות, 98 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות כדי לחלץ gDNA. מדוד את ריכוז ה- DNA.
    הערה: בעוד צעדים 6.1 ו -6.2 ממליצים שיטה יעילה להפקת DNA, שיטה כלשהי לבידוד הדנ"א הגנומי עלולה להיות מנוצלת כדי להיות מסוגל לבצע PCR בשלב 6.3.
  3. להרכיב PCR 20 μl עם הרכיבים הבאים: 10 μl תערובת 2x PCR, פריימר קדימה 0.5 μl (10 _6; M), 0.5 μl פריימר ההפוך (10 מיקרומטר), 50-100 ng gDNA, וH 2 O עד 20 μl. השתמש בפריימרים המיועדים בשלב 2 לעיל. לנהל PCR ל" להקה הלא-מחיקה "ו-" להקת מחיקה "בתגובות נפרדות.
    הערה: polymerases רב עשוי לשמש לצעד 6.3.
    1. דגימות לרוץ בthermocycler באמצעות הפרמטרים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, 35 מחזורים של (95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות), ו -72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות . לייעל את תנאי PCR עבור כל זוג פריימר תוכנן בהתבסס על בדיקת התאים בתפזורת מסודרים.
  4. הפעל דגימות על 2% agarose ג'ל ב 10 V / סנטימטר באמצעות 1x טריס-אצטט EDTA חיץ (טה).
  5. בדיקת דגימות לנוכחות / ההיעדרות של אי מחיקה ולהקות מחיקה (איור 2). שקול ריבוב "מחיקה" ו- "לא-מחיקה" זוגות פריימר PCR בתגובה אחת. לייעל ריבובבאוכלוסיית polyclonal (כלומר, בתפזורת מסודרים תאים) לפני הקרנת שיבוטים בודדים. זה קריטי, כי amplicons המחיקה ולא מחיקה להיפתר בקלות על ג'ל agarose לריבוב.

7. CRISPR הקרנה / Cas9 משובט למחיקות וClone בחירה

  1. עבור תאי השעיה, להעביר את כל השיבוטים לצלחת 96-היטב יחידה שכבר מכילה 50 μl תקשורת תרבית תאים לכל גם עבור נפח סופי של 150 μl. זה מקל על הקרנה כך שהוא מאפשר פיפטה רבה שתשמש להמשך הצעדים בשלב 7.
    1. ההעברה 50 μl מכל טוב (שעזב בכל טוב 100 μl) לצלחת 96-היטב PCR בעזרת פיפטה רבה.
    2. צלחת PCR צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ולהסיר supernatant ידי מצליף צלחת PCR מעל כיור. הוסף 50 μl של פתרון מיצוי DNA בכל טוב וגלול. המשך לשלב 7.3 לתאי השעיה.
    3. לתאים חסיד, תקשורת לשאוב. הוסף 20 μl של 0.05% טריפסין-EDTA היטב כל אחד עם הווה שיבוט.
      1. תאי Resuspend ב -200 μl של תקשורת. פיפטה לערבב לנתק תאים.
      2. צלחת 100 μl כל לשתי 96-גם צלחות שטוחות תחתונה נפרדות. שמור צלחת אחת, כדי לאפשר לשיבוטים לגדול ולהשתמש בצלחת אחרת למסך כל שיבוט למחיקות.
      3. להוסיף 100 μl נוסף לכל גם להיקף כולל של 200 μl. חכה 24-72 שעות כדי לאפשר לתאים לגדול.
      4. תקשורת לשאוב. הוסף 50 פתרון מיצוי DNA μl לכל גם, resuspend והעברה ל96-גם צלחת PCR. המשך לשלב 7.3.
    4. חלץ את gDNA משיבוטים. הפעל מדגם בthermocycler: 65 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות ו- 98 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות כדי לחלץ gDNA.
    5. מסך כל שיבוט באמצעות פריימרים PCR ותנאי תגובה מותאמים על התאים בתפזורת זהה (ראה שלב 6).
    6. בחר את iDEN השיבוטיםtified עם המחיקה הרצויה ולעבור לצלחת גדולה או בקבוק לצמיחה.

    8. אישור של המשובטים מחיקת Biallelic

    1. כדי לאפיין שיבוטים שהושגו ולאמת נוקאאוט מוצלח, להעריך שיבוטים בDNA כמו גם רמות RNA ו / או חלבון.
      1. כדי להעריך את ה- DNA, להגביר להקות מחיקה משיבוטי מחיקת biallelic עם פולימראז הגהה ולשכפל את amplicons (למשל, עם ערכת שיבוט PCR) לוקטור פלסמיד. להפוך את הפלסמיד לתוך DH5α E. תאי coli וצלחת על צלחות אגר LB עם האנטיביוטיקה הרלוונטית. בחר מושבות מרובות, מיני-prep כל אחד, ולהכפיף את כל שיבוט לסנגר רצף לאפיין כל מחיקה אלל 28-30. לחזור על בדיקת PCR למחיקה לאחר המסך הראשוני מבטיח כי השיבוט הנכון נבחר ושחזור של תוצאות.
      2. כדי להעריך את RNA, לבצע RT-qPCR לgenביטוי דואר של הגן הרלוונטי 30,31.
      3. כדי להעריך את החלבון, לבצע immunoblot באמצעות נוגדן נגד החלבון הרלוונטי 33.

Representative Results

מטרת ניסוי זה הייתה המחיקה של Pim1 בתאי MEL. שימוש בזוגות רבים שאינו חופף sgRNA (כלומר, רצפי protospacer עצמאיים) עשויים לעזור לשלוט על השפעות חוץ-יעד (איור 1 א). פנוטיפ עקבי יהיה סביר יותר כתוצאה מהשפעה על היעד בניגוד להשפעה מחוץ יעד משותפת של רצפי protospacer עצמאיים מרובים. כל זוג היה להוביל לייצור של נקודת עצירה מחיקה ייחודית. אם קרוב זה לזה (כלומר, n פחות מ ~ 150 נ"ב), יכולים לשמש באותה פריימרים הקרנה לזהות מחיקות המיוצרות על ידי כל קבוצה של sgRNAs. מחיקות הגנומי עלולות לשבש גנים באמצעות זוגות sgRNA במקומות שונים ביחס לגן (איור 1). לדוגמא, זוג sgRNA יכול לאגף גן למחיקה של גוף הגן כולו; הזוג יכול להיות ממוקם בתוך שני אקסונים, עם הפוטנציאל ליצירת indels frameshift גם אם allel אחד או שניהםes לא נמחקו; או הזוג עשוי לאגף אקסון ספציפי כדי לאפשר שיבוש איזופורם מסוים.

אסטרטגית המחיקה משמשת לPim1 הייתה לתכנן איגוף sgRNAs למחוק את כל גוף הגן, מחיקת 8 kb (איור 2). אסטרטגיה זו נבחרה בין שאר בשל גודלו הקטן יחסית של גן Pim1. דוגמא זו מראה PAM אחד (ירוק) בחלק העליון (ווטסון) הגדיל וPAM אחד בתחתית הגדיל (קריק); עם זאת, DSB הוא עצמאי של לוקליזציה רצף PAM לגדיל העליון או תחתון. זוגות sgRNA יכולים לקבל את שניהם רצפי PAM על הגדיל העליון, הן על הגדיל התחתון, או אחד מכל אחד. תוך שימוש בפרוטוקול שתואר לעיל, שתי sgRNA נועדו, משובטים לתוך וקטור ביטוי pX330, ונמסר לתאי MEL על ידי electroporation יחד עם כתב ה- GFP (איור 2 א). 3% העליונים של תאי GFP + מוינו יומיים לאחר electroporation ומצופים clonally בהגבלת דילול. מסךפריימרים ing תוכננו כמתואר בשלב 2 וכפי שמוצג באיור 2. תנאי PCR היו מותאמים באמצעות gDNA מבודד מתאי MEL הורים ומתאים "בתפזורת" מסודרים.

10 ימים לאחר הציפוי, gDNA היה מבודד מכל השיבוטים והוקרן למחיקה באמצעות PCR, שזיהה שאינו מחיקה, monoallelic ושיבוטי מחיקת biallelic פי הדפוסים של אי-מחיקה (ND) ומחיקה (D) amplicons (איור 3) . שיבוטים ללא מחיקה זוהו כבעלי הנוכחות של amplicon שאינו המחיקה והעדר amplicon המחיקה. שיבוטים Monoallelic זוהו כבעלי הנוכחות של שני הלא-המחיקה וamplicons מחיקה. שיבוטים Biallelic זוהו כבעלי העדר amplicon הלא המחיקה ואת הנוכחות של amplicon המחיקה. למחיקה זו, 400 שיבוטים הוקרנו אשר זיהה 126 שיבוטים מחיקת monoallelic ו -32 delet biallelic שיבוטים יון (חשוב לשים לב כי תדירות מחיקה משתנה עם גודל מחיקה 12). שיבוטים מחיקת Biallelic נבחרו ועברו לצנצנות עם 8 מיליליטר של תקשורת. לאחר 5 ימים ומאפשרים להרחבה, כל שיבוט היה הערכה מחדש על ידי PCR של gDNA כדי לאשר amplicons מחיקה ומחיקת biallelic היו נתונים לסנגרו רצף לזהות את המחיקה המדויקת (איור 2). ההטרוגניות בתוך amplicons המחיקה משקפת תיקון NHEJ יוצרי indel מושלם. רצף של אלל הלא המחיקה בשיבוטי מחיקת monoallelelic חשפו indels ברוב המכריע של המקרים, הוכחה כי אפילו אלל-נמחק לא נערך לעתים קרובות על ידי CRISPR / Cas9, אשר עשוי להיות חשוב עבור יישומים בהם שני שיבוטים מחיקת monoallelic וbiallelic נדרשים . RNA היה מבודד משיבוטי מחיקת biallelic ונותח על ידי RT-qPCR כדי לאשר אובדן ביטוי Pim1 (איור 4).

דרכים "> איור 1
איור 1. סכמטי של אסטרטגיות מחיקה אפשריות. () זוגות sgRNA שתי דוגמא למחיקות הגנומי (מוצג בשחור וכתום, בהתאמה). החיצים הכחולים מצביעים על פריימרים לזהות amplicon הלא המחיקה וחצים אדומים מצביעים על פריימרים לזהות amplicon המחיקה. sgRNA ממקם 17 ו -18 מודגשים באדום וכחול בsgRNA-אתרים-1/2 ומודגשים בסגול וכתום בsgRNA-אתרים-B 1 / B 2 עם קו אדום מציין את מחשוף Cas9 חזה בין עמדות 17 ו18. שסעים (B) מכוון CRISPR מוצגים כקווים שחורים אנכיים. החיצים הכחולים מצביעים על פריימרים לזהות amplicon הלא המחיקה וחצים אדומים מצביעים על פריימרים לזהות amplicon המחיקה. אנא לחצו כאן לצפייהגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. אסטרטגיה לייצר ולזהות מחיקה של Pim1, כוללים מחיקת רצף ואללים שאינם מחיקות. () סכמטי של אסטרטגית ההקרנה מבוססת PCR לזהות שיבוטים מחיקת Pim1. זוג פריימר אחד ממוקם פנימי למחיקה (חיצים כחולים) וזוג פריימר אחד הוא מקומי חיצוני למחיקה (חצים אדומים). רצפי sgRNA (רצפי protospacer) מוצגים בסגול. הקווים האדומים האנכיים מצביעים על מחשוף Cas9 חזה בין עמדות 17 ו -18 של רצף sgRNA. סנגר רצף (B) מגלה היווצרות indel באתר הכרת sgRNA. רצפי sgRNA מוצגים ברצפים סגולים וPAM בירוק. אירועי מחיקה הם shשלו על ידי מספר דומה של סימני מקף והוספות מודגשים בכחול. קווים אדומים אנכיים מצביעים חזו אתר מחשוף, בין עמדות 17 ו -18 של sgRNA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. ג'ל נציג זיהוי שאינו מחיקה, monoallelic, ושיבוטים biallelic. עבור כל שיבוט, הנתיב השמאלי מייצג את amplicon הלא המחיקה ("ND" בכחול) והנתיב הימני מייצג את amplicon המחיקה ("D" באדום ). שיבוטים בודדים מופרדים על ידי קווים מקווקווים. שלושה השיבוטים מחיקת monoallelic הם שיבוטים 5, 6, ו -2 שלושה השיבוטים מחיקת biallelic הם שיבוטים 15, 17, 13. וכפי שניתן לראות בנתונים הרצף, להקת המחיקה לג יש בודד 13 גודל קטן יותר בשל מחיקות גדולות יותר בצומת המחיקה.

איור 4
הפסד איור 4. ביטוי Pim1 בשיבוטי מחיקת biallelic. ביטוי Pim1 חושב לשני שיבוטים מחיקת biallelic על ידי RT-qPCR. הנתונים מנורמלים לGAPDH באמצעות 2 - שיטת ΔCt.

Protospacer רצף
sgRNA- 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 "
sgRNA-B 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 "

טבלה 1. רצפי protospacer 20-mer לשתי sgRNA למחיקה של Pim1.

543 "> משלים הפוך של רצף Protospacer sgRNA-A-rc 5'-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 " sgRNA-B-rc 5'-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 "

טבלת 2. השלמה היפוך של רצפי protospacer לsgRNA שתי מטבלת 1.

רצפים
sgRNA- 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 "
sgRNA-A-rc 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 "
sgRNA-B 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 "
sgRNA-B-rc 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 "

טבלת 3. רצפי Protospacer וההפוך שלהם משלים עם "CACC" ו- "AAAC", הוסיפו לשיבוט לתוך וקטור pX330 באמצעות אנזים הגבלת BbsI.

רצפים
sgRNA- 5'- CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 "
sgRNA-A-rc 5'- AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 "
sgRNA-B 5'- CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 "
sgRNA-B-rc 5'- AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 "

שולחן ביטוי 4. sgRNA מאמרגן U6 של וקטור pX330 מוגבר על ידי התוספת של נוקלאוטיד G לאחר רצף CACC ולפני20-mer. התוספת של נוקלאוטיד G נוסף דורשת תוספת של נוקלאוטיד C בסוף '3 ​​של אוליגו המשלים ההפוך (למשל, sgRNA-A). עם זאת, אם המיקום הראשון של 20-mer (רצף protospacer) הוא כבר נוקלאוטיד G, אין צורך להוסיף G אחר (לדוגמא, sgRNA-B) ואין צורך להוסיף ג 'לעמדתו הסופית של ההשלמה ההפוכה אוליגו.

Discussion

CRISPR / מערכת Cas9 ניתן להשתמש כדי ליצור מחיקות הגנומי של מגוון רחב של גדלים. למרות שראינו כי שכיחותה של מחיקה משתנה ביחס הפוך ביחס לגודל מחיקה נועד, הצלחנו להתאושש מחיקות של עד 1 מגה, ומחיקות של עד 100 kb להניב באופן שגרתי שיבוטים biallelic נמחק מרובים. יש לנו לא הבחנתי בהפסד ביעילות של מחיקות ברצף מציגים לקו תא. אסטרטגיה זו יכולה לשמש ליצירת מחיקה קומבינטורית של גנים רבים ואלמנטים. תהליך קבלת שיבוטים מחיקת biallelic יכול להיות מזורז על ידי הערכת המספר המינימאלי של שיבוטים שצריכים לסרוק על בסיס גודל מחיקה כדי לקבל את המספר הרצוי של שיבוטים עם מחיקת biallelic 12.

היכולת להשיג מחיקת monoallelic עם היעדר מחיקת biallelic בהפצה הסתברותי יכולה להצביע קטלני תא הקשורים לאובדן תפקוד מלא. fr הנמוך equency או השמטות נעדרו יכול לשקף מספר התרחישים כוללים transfection העני, sgRNAs לא יעיל או לא יעילים פריימרים PCR הקרנה (בשל חוסר שליטה חיובית כדי לאמת פריימרים PCR למסך למחיקה). תאי GFP + יכולים לשמש כתחליף ליעילות transfection (ראה שלב 5.2), כך לירידה בGFP + תאים סביר משקפת transfection העני ותוצאה כך ירדו יעילות מחיקה. שימוש בשני זוגות sgRNA שונים עם פריימרים הקרנה עצמאיים יכול לעזור שליטה לsgRNA לא יעיל והקרנת פריימרים PCR ומקסם את סיכויי קבלת שיבוטים מחיקת biallelic. מיון התא לGFP + תאים מעשיר לאללים מחיקה. בעוד שניתן להשמיט את הצעד הזה, השמטה צפויה מחייבת הקרנה יותר שיבוטים לזהות אלו עם מחיקות monoallelic או biallelic. במידה שיעילות transfection עשויה להיות מותאמת, היינו מצפה יעילות עריכת הגנום להיות משופרת.

= "Jove_content" ילדה> אירועי NHEJ העומדים בבסיס מחיקות ותוצאת תיקון מקומי בסדרה של אללים עם מגוון רחב של indels באתרי היעד. התוצאה העיקרית היא ~ 1 קטנה - 10 הוספות נ"ב או יותר נפוצה מחיקות באתר של מחשוף מכוון sgRNA (איור 2). לעתים קרובות אללים אלה מופיעים להיות התוצאה של 34,35 תיקון מבוסס microhomology. יש לציין כי אסטרטגית זיהוי מבוססת PCR אנו מתארים לא תזהה את הוספות גדולות יותר או מורכבות יותר, מחיקות, תנוחות הפוכות, או ארגון מחדש. למרות שהאירועים אלה הם פחות נפוצים, שראינו בו לא שיבוטים מחיקה ולא amplicons הלא המחיקה ניתן הייתה לזהות, ועל חקירה נוספת משקפים תוצאות אלה מורכבות יותר.

אנו צפינו בCRISPR הנרחב / התיווך Cas9 "צלקות" של אללים שאינם מחיקה משיבוטי monoallelic ולא מחיקה (ראה איור 2). "צלקות" אלה כוללותindels הקטן המיוצר באתר מחשוף sgRNA ללא מחיקה המיועדת (כלומר, מחיקה של המגזר להתערב בין sgRNAs A ו- B). צלקות אלה לעתים קרובות להפריע הכרת מטרה על ידי sgRNA. לכן היינו ממליץ על זהירות בretargeting אללים בתאים שנחשפו בעבר לsgRNAs תוך שימוש באותה sgRNAs. אסטרטגית מיקוד מחדש מוצלחת יותר היה לנצל sgRNA ייחודי רצפים שונים מהעבר "מצולק" אתרי הכרה. במקרים שבם זוג sgRNAs מכיר רצפי exonic (איור 1, למטה), אללים frameshift עשוי להיות מיוצר גם בהיעדרו של מחיקה. לכן, יכולים להיות מועשרים שיבוטים מחיקת monoallelic לאובדן של פונקציה בשל התדירות הגבוהה של מוטציות frameshift על שאינם נמחק אלל 12.

דאגה אחת עם CRISPR / מערכת Cas9 היא השפעות חוץ-היעד, כלומר, שינוי הגנומי באתרים לא רצויים 36-38. Rדיווחי ecent הציעו כי RNAs מדריך קצר עם 17-19 נוקלאוטידים יכול להפחית את התדירות של CRISPR / Cas9 מבוסס השפעות חוץ-יעד 39. בנוסף, אסטרטגיה כפול nicking באמצעות שני מדריכים לכל אתר יעד עם nickase יכולה לשמש כדי ליצור DSBs תוך מזעור השפעות חוץ-יעד 7. לחלופין, מקביל לאסטרטגיות המשמשות לRNAi, אנו מציעים שזוגות שונים של sgRNAs עם רצפי protospacer שאינו חופפים לשמש כדי להוכיח כי הפנוטיפ שנצפה היא התוצאה של CRISPR / השינוי Cas9 על-היעד בניגוד לפוטנציאל מחוץ היעד אפקט. גישה נוחה תהיה לתכנן לפחות שני זוגות sgRNA סמוכים אך אינם חופף, כך שקבוצה אחת של פריימרים הקרנה (ראה שלב 2) יכולה לשמש לזוגות רבים sgRNA (איור 1 א). יתר על כן, משלים קו תא מחיקה על ידי reintroducing הרצף החסר ו / או גן שיבש יכול לבסס קשר סיבתי ביןמחיקה נתון הגנומי ופנוטיפ.

לביולוגים עבודה עם מערכות מודל סלולארי, RNAi ייצג כלי רב עוצמה לגנומיקה פונקציונלית. עם זאת, מגבלות של גישה זו כללו הפחתה חלקית ברמות תעתיק mRNA היעד, ההטרוגניות של השפעה של חומרים כימיים עצמאיים מיקוד אותו הגן, וידועות השפעות חוץ-היעד כוללים אפקטים מבוססי זרע ולא זרע 40-42. אסטרטגיות עריכת הגנום מבטיחות לטפל ברבים מחששות אלה ומייצגים גישה מרגשת, משלימה להפרעות גנטיות פוטנציאליים 8,36,37. יתר על כן, עריכת הגנום מאפשרת לחקר ללא קידוד אלמנטים גנטיים בדרך לא ניתן על ידי RNAi ומאתגרת על ידי מיקוד קונבנציונלי גישות 25. אנו מעודדים את הדור של מחיקות הגנומי ידי CRISPR / Cas9 כשיטת חזקה וספציפית כדי לייצר ולאפיין אללים פסד של פונקציה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T4 DNA ligase (with associated ligation buffer) New England Biolabs M0202T
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
BSA, molecular biology grade New England Biolabs B9000S
BbsI restriction enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) New England Biolabs R0539S
pSpCas9(BB) (pX330) Addgene 42230
S.O.C. medium Life Technologies 15544-034
BTX ECM 830 Harvard Apparatus 45-0052
BTX solution and 2 mm cuvettes Harvard Apparatus 45-0803
pmaxGFP plasmid Lonza VPA-1003
QuickExtract DNA Extraction Solution Epicentre QE09050
HotStarTaq PCR Master Mix Kit Qiagen 203443
Zero Blunt PCR Cloning Kit Life Technologies K2700-20
Plasmid Addgene 42230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. Z. F. N., TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709-1712 (2007).
  6. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  7. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  8. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  9. Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nature Protocols. 8 (11), 2180-2196 (2013).
  10. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  11. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  12. Canver, M. C., et al. Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by CRISPR/Cas9 in Mammalian Cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  13. Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Research. 41 (14), e141 (2013).
  14. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9 mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. , (2014).
  15. Wang, T., et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Niu, Y., et al. Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
  18. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
  19. Xie, K., Yang, Y. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. Molecular Plant. 6 (6), 1975-1983 (2013).
  20. Waaijers, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 195 (3), 1187-1191 (2013).
  21. Bassett, A. R., Liu, J. L. CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila. Journal of Genetics and Genomics. 41 (1), 7-19 (2014).
  22. Schwank, G., et al. Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in Intestinal Stem Cell Organoids of Cystic Fibrosis Patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  23. Wu, Y., et al. Correction of a Genetic Disease in Mouse via Use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 13 (6), 659-662 (2013).
  24. Lappalainen, T. M., et al. Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans. Nature. 501 (7468), 506-511 (2013).
  25. Bauer, D. E., et al. An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level. Science. 342 (6155), 253-257 (2013).
  26. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS One. 3, e3647 (2008).
  27. Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177, 437-447 (2003).
  28. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
  29. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  30. Finney, M., Nisson, P. E., Rashtchian, A. Molecular cloning of PCR products. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 15. (Unit 15.4), (2001).
  31. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR). J. Vis. Exp. (63), e3874 (2012).
  32. Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas. J. Vis. Exp. (89), e51093 (2014).
  33. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  34. McVey, M., Lee, S. E. MMEJ repair of double-strand breaks (director’s cut): deleted sequences and alternative endings. Trends in Genetics. 24 (11), 529-538 (2008).
  35. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  36. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  37. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnology. , (2014).
  38. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  39. Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32, 279-284 (2014).
  40. Alemán, L. M., Doench, J., Sharp, P. a Comparison of siRNA-induced off-target RNA and protein effects. RNA. 13 (3), 385-395 (2007).
  41. Anderson, E. M., et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA. 14, 853-861 (2008).
  42. Marine, S., et al. Common seed analysis to identify off-target effects in siRNA screens. Journal of Biomolecular Screening. 17 (3), 370-378 (2012).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 83 CRISPR Cas9 הגנום הנדסה ג'ין Knockout הגנום מחיקה ויסות גנים
דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin,… More

Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118, doi:10.3791/52118 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter