Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

جيل من الجينوم الحذف في خطوط خلايا الثدييات عبر كريسبر / Cas9

Published: January 3, 2015 doi: 10.3791/52118
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1,2,3,4
1Harvard Medical School, 2Division of Hematology/Oncology, Boston Children's Hospital, 3Department of Pediatric Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, 4Howard Hughes Medical Institute
* These authors contributed equally

Protocol

1. تصميم كريسبر

  1. sgRNAs تصميم يدويا أو باستخدام الأدوات المتاحة على الانترنت بحرية 7. استخدام هذه الأدوات للمساعدة في تحديد تسلسل دليل على أن تقليل مباريات الجينومية متطابقة أو بالقرب من المباريات للحد من خطر الانقسام بعيدا عن المواقع المستهدفة (خارج الهدف الآثار). تأكد من أن متواليات دليل تتكون من 20 مير ("تسلسل protospacer") المنبع من "NGG" التسلسل ("protospacer عزر المجاور" أو PAM) في موقع الاعتراف الجيني.
    ويصف الشكل 1 الاستراتيجيات الممكنة لحذف الجينات والعناصر غير الترميز: ملاحظة. لخلق بالضربة القاضية جين، واثنين من sgRNA تقع ضمن الإكسونات إثراء استنساخ الحذف حتى monoallelic لفقدان وظيفة. ويرجع ذلك إلى ارتفاع وتيرة indels تشكلت على الأليلات غير حذف 12، والتي من المحتمل أن تسبب الطفرات مما يؤدي إلى انزياح الإطار هراء بوساطة التسوس من النص مرنا (الشكل 1B) هذا.
  2. استخدامأدلة سبيل المثال لحذف المقصود من Pim1 في الماوس (المصحف العضلة، الجدول 1، الشكل 2A).
    ملاحظة: في هذا المثال، sgRNA-A في تسلسل protospacer وPAM يحدث أن تقع في الجزء السفلي (كريك) حبلا في حين sgRNA-B في تسلسل protospacer وPAM تقع على رأس (واتسون) حبلا (الشكل 2A). ومع ذلك، فإن جهاز تسوية المنازعات تحدث مستقلة عن التوجه للprotospacer تسلسل / PAM نسبة إلى حبلا العلوي أو السفلي.
  3. تحديد تكملة العكسي (RC) من كل تسلسل الدليل. مثال عكس تسلسل مكملا للPim1 sgRNA من الجدول رقم 1 توجد في الجدول 2.
  4. 24- الحصول على 25 أو مير oligos لكل دليل وتكملة العكس المرتبطة بها بما في ذلك النيوكليوتيدات إضافية لأغراض الاستنساخ والتعبير.
    ملاحظة: هنا نناقش استخدام للpSpCas9 (BB) بلازميد (pX330) (Addgene ID البلازميد 42230). هذا البلازميد يسمح للوقت واحدلا يحتوي تعبير عن sgRNA وSpCas9، ولكن علامات لاختيار 7. يمكن استخدام بنيات أخرى، مثل pX458 (Addgene ID البلازميد 48138) أو pX459 (Addgene ID البلازميد 48139)، والتي تشمل GFP وبوروميسين علامات اختيار كما، على التوالي، أو بنيات التي يمكن التعبير عن sgRNAs متعددة من البلازميد واحد.
    1. إضافة "CACC" قبل 20 مير تسلسل دليل و"AAAC" قبل تكملة للدليل العكسي للاستنساخ في ناقلات pX330 باستخدام BBSI تقييد انزيم (الجدول 3).
    2. إضافة النوكليوتيدات G بعد تسلسل CACC وقبل مير 20 إذا كان المركز الأول من مير 20 ليس G. sgRNA التعبير من المروج U6 من متجه pX330 تتعزز إدراج النوكليوتيدات G بعد تسلسل CACC . إضافة C في نهاية 3 'من تكملة بنسبة ضئيلة العكسي (على سبيل المثال، sgRNA-A في الجدول 4). ان oligos الناتجة يكون oligos 25-مير.
    3. كيفمن أي وقت مضى، وإذا كان المركز الأول من بين 20 مير (تسلسل protospacer) هو G، لا تضيف G آخر (على سبيل المثال، sgRNA-B في الجدول 4) وعدم إضافة C إلى الموقف النهائي للمكملا بنسبة ضئيلة العكسية. في هذه الحالة، فإن oligos الناتجة يكون oligos 24 مير (الجدول 4).

2. تصميم الحذف الاشعال الفحص

  1. تصميم مجموعة واحدة من الاشعال الداخلية إلى تسلسل ليتم حذف ("الفرقة غير الحذف") ومجموعة أخرى من الاشعال المنبع والمصب من المواقع sgRNA الانقسام ("الفرقة الحذف"، أرقام 1 - 2). في غياب الحذف، و "الفرقة الحذف" غالبا ما تكون كبيرة جدا لتضخيم بكفاءة. عادة ما تستخدم أجهزة الاشعال لا يقل عن 100 نقطة أساس من موقع انشقاق توقع لضمان لن تتأثر الكشف من قبل INDEL صغير في الموقع المستهدف sgRNA.
    1. تصميم الاشعال إضافية لتحليل لتندب (indels الصغيرة المنتجة في sgRNA جالموقع leavage دون حذف المقصود). استخدام زوج من الأمام وعكس الاشعال المرافقة كل موقع الهدف sgRNA (داخل 150-350 بي بي) لتضخيم الموقع المستهدف sgRNA لدراسة لتندب. قد يكون هذا مفيدا لتوصيف أليل غير المحذوفة في استنساخ حذف monoallelic.
  2. لحذف صغيرة (باسم "الفرقة الحذف" ربما لا يزال تضخيم)، حل amplicons على هلام الاغاروز لتحديد ما إذا كان حجم يتسق مع وجود أو عدم وجود الحذف. لهذا النهج، قد يتم حذف الاشعال الداخلية هو موضح في الخطوة 2.1.

3. كريسبر الاستنساخ

  1. يصلب والفوسفات oligos.
    1. oligos في resuspend بتركيز 100 ميكرومتر في DDH 2 O.
    2. إعداد مزيج 10 ميكرولتر رد فعل لكل دليل ومكملا لها العكسي: 1.0 ميكرولتر sgRNA 24- أو بنسبة ضئيلة 25 مير (100 ميكرومتر؛ انظر الخطوة 1.4)، 1.0 ميكرولتر sgRNA 24- أو 25 مير عكس complemenر بنسبة ضئيلة (100 ميكرومتر، وانظر الخطوة 1.4)، 1.0 ميكرولتر 10X T4 ربط العازلة، 6.5 ميكرولتر DDH 2 O، و 0.5 ميكرولتر T4 كيناز عديد النوكليوتيد (PNK) (10،000 U / مل).
      قد يكون أمر فسفرته oligos بدلا من ذلك: ملاحظة. لهذا النهج، تم حذف استخدام T4 PNK.
    3. يصلب في thermocycler باستخدام المعلمات التالية: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. 95 ° C لمدة 5 دقائق ثم الطريق المنحدر إلى أسفل إلى 25 درجة مئوية في 5 ° C / دقيقة.
    4. تمييع oligos 01:10 في DDH 2 O (على سبيل المثال، 1.0 ميكرولتر صلب oligos + 9.0 ميكرولتر DDH 2 O لتسفر عن تركيز 1 ميكرومتر).
  2. oligos صلب Ligate إلى pX330 باستخدام استراتيجية استنساخ التجمع جولدن جيت 26.
    1. إعداد 50 ميكرولتر مزيج رد فعل: 100 نانوغرام ناقل دائري pX330، 1.0 ميكرولتر oligos صلب (1 ميكرومتر، راجع الخطوة 3.1.4)، 5.0 ميكرولتر عازلة انزيم التقييد (10X)، 4.0 ميكرولتر (20 U) BBSI تقييد انزيم (5،000 U / مل)، 5.0 μل ATP (10 ملم)، 0.25 ميكرولتر (5 ميكروغرام) BSA (20 ملغ / مل)، 0.375 ميكرولتر (750 U) يغاز DNA T4 (2،000،000 U / مل)، وH 2 O إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. يمكن تحجيم هذا التفاعل الى الحجم النهائي أصغر إذا لزم الأمر.
    2. عينات تشغيل في thermocycler باستخدام المعلمات التالية: دورات 1-20 (37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 20 ° C لمدة 5 دقائق)؛ دورة 21 (80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة). هذه الظروف الدراجات تسمح لعملية الهضم وربط تحدث في رد فعل واحد (راجع الخطوة 3.2).
    3. تحويل 10 ميكرولتر من DH5α E. خلايا القولونية مع 1 ميكرولتر من رد فعل (من 3.2.1 - 3.2.2).
    4. لوحة الصعود إلى استذابة مرق (LB) لوحة أجار مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  3. اختيار 2 - 3 في المستعمرات وتطعيم إلى ثقافة مصغرة الإعدادية.
    1. أداء مصغرة الإعدادية لكل عينة وتسلسل كل مستعمرة باستخدام التمهيدي U6 المروج إلى الأمام: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. وهذا هو عepresentative التمهيدي التسلسل. يمكن استخدام الاشعال المرافقة الأخرى.
  4. اختيار مستعمرة التحقق من تسلسل وتطعيم إلى ثقافة-ماكسي الإعدادية. يمكن تحجيم حجم الإعدادية على أساس العائد DNA المطلوب.
  5. أداء ماكسي الإعدادية لكل كريسبر / Cas9 بناء.

4. Transfecting CRISPRs إلى خلايا الاهتمام

ملاحظة: هذا البروتوكول ينطوي على تسليم كريسبر البلازميدات / Cas9 من قبل Electroporation لل27. يوصف هذا البروتوكول في التفاصيل لابيضاض الدم الاحمراري الفئران (MEL) الخلايا، خط خلية تعليق. مستنبت في جميع الخطوات يتكون من DMEM تستكمل مع 2٪ البنسلين / الستربتومايسين و 1٪ L-الجلوتامين، والذي يستخدم لخلايا MEL. ومع ذلك، ترنسفكأيشن عابرة من كريسبر / البلازميدات Cas9 يمكن تكييفها بنجاح إلى العديد من أنواع الخلايا باستخدام الظروف ثقافة فضل واستراتيجيات ترنسفكأيشن لكل نوع من الخلايا. في حين أن الخلايا هي خلايا MEL تعليق، تعليمات للخلايا ملتصقة حافي تم شملت أيضا.

  1. تأكد من عدم و2 × 10 6 خلايا لكل زوج كريسبر. و resuspend 2 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر من حل Electroporation للوإضافة إلى كفيت electroporation.
    1. إضافة 5 ميكروغرام لكل كريسبر / Cas9 بناء (10 ميكروغرام المجموع). إضافة 0.5 ميكروغرام من GFP التعبير بناء.
  2. خلايا Electroporate مع 250 فولت لمدة 5 ميللي ثانية في 2 مم كفيت باستخدام نظام Electroporation لل.
    ملاحظة: بدلا من استخدام أسلوب ترنسفكأيشن آخر مثل الموجبة ترنسفكأيشن القائم على الحويصلية. تحسين ظروف ترنسفكأيشن لكل خط الخلية مع بناء مراسل لضمان القوي تسليم البلازميد قبل محاولة تحرير الجينوم.
  3. نقل على الفور حل من كفيت في 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة بعد Electroporation لل. تقليل الوقت بين Electroporation للنقل والحل في وسائل الإعلام لتعزيز بقاء الخلية.
  4. احتضان عند 30 - 37 درجة مئوية لمدة 24-72 ساعة. 30 ° C قد تعزز الجينومتحرير الكفاءة، ولكن 37 ° C غير مقبول.

5. الإسفار المنشط خلية للفرز (FACS) من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل

  1. إعداد الخلايا لFACS من خلال تصفية لهم من خلال مرشح 50 ميكرون في أنبوب FACS.
  2. FACS فرز أعلى ~ 3٪ من خلايا إيجابية GFP من أجل إثراء للخلايا التي حصلت على مستويات عالية من كريسبر / Cas9 يبني.
  3. لوحة فرز خلايا فردية في لوحات ذهابا وأسفل 96-جيدا باستخدام فارز أو باستخدام الحد من التخفيف في 30 خلايا في 96-جيدا على مدار أسفل اللوحة. تحسين تصفيح نوع من الخلايا المستخدمة في تخفيف الحد قبل تنفيذ هذه الخطوة للحصول موثوق ما يقرب من 30 خلايا لكل لوحة 96-جيدا.
  4. تشمل 100 ميكرولتر لكل بئر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
  5. لما تبقى من خلايا مرتبة ("الجزء الأكبر") التي لم مطلي، وتجميد نصف الخلايا لمدة الطلاء في المستقبل. لوحة النصف الآخر للفحص والتحقق من صحة التمهيدي (راجع الخطوة 6).
    ملاحظة: هذه صrotocol هو لخلايا تعليق. الخلايا الملتصقة إما أن تنمو الخلايا الفردية كما هو الحال في لوحة مسطحة القاع 96-جيدا أو في طبق 10 سم على تركيز منخفض بحيث حيدة الخلية الفردية استنساخ المستمدة يمكن التقاطها وانتقل إلى أسفل لوحة 96-جيدا مسطحة.
  6. السماح للخلايا السائبة لاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3-7 أيام والسماح للاستنساخ لاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 7 - 14 أيام. تختلف هذه الأوقات اعتمادا على الوقت مضاعفة خط الخلية المستخدمة.
    ملاحظة: هذه المرة حضانة يسمح لتكاثر الخلايا كافية لفحص الحمض النووي الجيني (gDNA) لحذف المقصود من قبل PCR (انظر الخطوات 6.1 و 7.1). الخلايا السائبة تكاثرت بما فيه الكفاية عندما يتجاوز تركيز ~ 100،000 خلية / مل أو الخلايا الملتصقة، قد وصلت إلى خلايا ~ 80٪ التقاء. استنساخ تكاثرت بما فيه الكفاية مرة واحدة واضحة ظاهريا مع ~ 2 مم.

6. التمهيدي التحقق والكشف عن كريسبر / حذف Cas9 بوساطة

  1. عزل gDNA من خلايا فرز الأبوية وبالجملة من قبل إعادة التعليق الكريات الخلايا الأبوية والسائبة في 50 ميكرولتر من الحل استخراج الحمض النووي.
    ملاحظة: تستخدم عموما ~ 100،000 خلايا لاستخراج الحمض النووي، على الرغم من مجموعة واسعة من أعداد الخلايا غير مقبول. وتتكون الخلايا الأكبر مرتبة من السكان بولكلونل تتعرض لsgRNA-A وsgRNA-B (راجع الخطوة 5). الغرض من PCR التالي للتحقق من صحة الاشعال والتحقق من وجود المقصود الحذف الجيني.
  2. تشغيل نموذج في thermocycler وتشغيل البرنامج التالي: 65 درجة مئوية لمدة 6 دقائق و 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة لاستخراج gDNA. قياس تركيز الحمض النووي.
    ملاحظة: على الرغم من الخطوات 6.1 و 6.2 يوصي وسيلة فعالة لاستخراج الحمض النووي، أي طريقة لعزل الحمض النووي الجيني يمكن استخدامها لتكون قادرة على أداء PCR في الخطوة 6.3.
  3. تجميع 20 ميكرولتر PCR مع المكونات التالية: 10 ميكرولتر 2X PCR المزيج، 0.5 ميكرولتر التمهيدي إلى الأمام (10 _6؛ M)، و 0.5 ميكرولتر التمهيدي العكسي (10 ميكرومتر)، 50-100 نانوغرام gDNA، وH 2 O ما يصل إلى 20 ميكرولتر. استخدام بادئات مصممة في الخطوة 2 أعلاه. إجراء PCR ل "الفرقة غير الحذف" و "الفرقة الحذف" في تفاعلات منفصلة.
    ملاحظة: يمكن أن تستخدم بلمرة عديدة لخطوة 6.3.
    1. عينات تشغيل في thermocycler باستخدام المعلمات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، 35 دورات (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة)، و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة . تحسين ظروف PCR لكل زوج التمهيدي مصممة على أساس اختبار الخلايا الأكبر فرزها.
  4. تشغيل العينات على 2٪ agarose هلام في 10 V / سم باستخدام (تاي) عازلة 1X خلات-EDTA تريس.
  5. فحص عينات لحضور / غياب عدم الحذف والعصابات الحذف (الشكل 2). النظر المتنوعة و"الحذف" و "عدم حذف" أزواج التمهيدي PCR في رد فعل واحد. تحسين المتنوعةفي عدد السكان بولكلونل (أي خلايا فرز بالجملة) قبل فحص الحيوانات المستنسخة الفردية. ومن الأهمية بمكان أن الحذف وعدم الحذف-amplicons حلها بسهولة على هلام الاغاروز لمضاعفة.

7. فحص كريسبر / Cas9 النسخ للالحذف واستنساخ اختيار

  1. لخلايا تعليق، ونقل جميع الحيوانات المستنسخة لواحدة لوحة 96-جيدا الذي يحتوي بالفعل 50 ميكرولتر سائل الإعلام والثقافة خلية لكل بئر لالحجم النهائي من 150 ميكرولتر. وهذا يسهل فحص عن طريق السماح للماصة الأقنية لاستخدامها للفترة المتبقية من الخطوات في الخطوة 7.
    1. نقل 50 ميكرولتر من كل بئر (ترك 100 ميكرولتر في كل بئر) إلى لوحة 96-جيدا PCR باستخدام ماصة الأقنية.
    2. الطرد المركزي PCR لوحة في 400 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف بواسطة عبها لوحة PCR أكثر من بالوعة. إضافة 50 ميكرولتر من الحل استخراج الحمض النووي لكل بئر و resuspend. انتقل إلى الخطوة 7.3 لخلايا تعليق.
    3. لخلايا ملتصقة، ووسائل الإعلام نضح. إضافة 20 ميكرولتر من 0.05٪ التربسين-EDTA لكل جيدا مع استنساخ الحاضر.
      1. Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام. ماصة مزيج لفصل الخلايا.
      2. لوحة 100 ميكرولتر كل إلى قسمين منفصلين 96-جيدا لوحات مسطحة القاع. حافظ على لوحة واحدة للسماح للاستنساخ لتنمو واستخدام لوحة أخرى لفحص كل استنساخ للحذف.
      3. إضافة 100 ميكرولتر إضافية إلى كل بئر لإجمالي حجم 200 ميكرولتر. انتظر 24-72 ساعة للسماح للخلايا أن تنمو.
      4. وسائل الإعلام نضح. إضافة 50 ميكرولتر حل استخراج الحمض النووي لكل بئر، في resuspend ونقل إلى 96 جيدا PCR لوحة. انتقل إلى الخطوة 7.3.
    4. استخراج gDNA من الحيوانات المستنسخة. تشغيل نموذج في thermocycler: 65 درجة مئوية لمدة 6 دقائق و 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة لاستخراج gDNA.
    5. فحص كل استنساخ باستخدام بادئات PCR وظروف التفاعل الأمثل على الخلايا السائبة نفسه (راجع الخطوة 6).
    6. حدد الاتساع الحيوانات المستنسخةtified مع حذف المطلوب والانتقال إلى لوحة أكبر أو قارورة للنمو.

    8. التحقق من Biallelic حذف النسخ

    1. من أجل تميز الحيوانات المستنسخة التي تم الحصول عليها والتحقق من صحة بالضربة القاضية الناجح، وتقييم الحيوانات المستنسخة في DNA وكذلك مستويات RNA و / أو البروتين.
      1. لتقييم DNA، تضخيم العصابات الحذف من الحيوانات المستنسخة حذف biallelic مع البلمرة تصحيح التجارب المطبعية واستنساخ amplicons (على سبيل المثال، مع مجموعة استنساخ PCR) في ناقلات البلازميد. تحويل البلازميد إلى DH5α E. القولونية الخلايا وعلى لوحة LB لوحات أجار مع المضادات الحيوية ذات الصلة. حدد مستعمرات متعددة، ميني الإعدادية كل واحد، وإخضاع كل استنساخ لسانجر تسلسل لتحديد خصائص كل الحذف أليل 28-30. تكرار اختبار PCR للحذف بعد الشاشة الأولية يضمن أن تم اختيار استنساخ الصحيح واستنساخ النتائج.
      2. لتقييم RNA، نفذ RT-QPCR للجنرالالبريد التعبير عن الجينات ذات الصلة 30،31.
      3. لتقييم البروتين، وإجراء طخة مناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتين ذات الصلة 33.

Representative Results

وكان الهدف من هذه التجربة حذف Pim1 في الخلايا MEL. استخدام عدة أزواج غير متداخلة sgRNA (أي تسلسل protospacer المستقلة) قد يساعد في السيطرة على الآثار خارج الهدف (الشكل 1A). ومن شأن النمط الظاهري يتفق أن يكون أكثر من المرجح أن تنتج عن تأثير على الهدف بدلا من تأثير المشترك بعيدا عن الهدف تتقاسمها عدة سلاسل protospacer مستقلة. أن كل زوج أن يؤدي إلى إنتاج حذف نقطة فريدة من نوعها. إذا قريبة من بعضها البعض (أي، ن أقل من 150 ~ بي بي)، ويمكن استخدام نفس الاشعال فحص للكشف عن عمليات الحذف التي تنتجها كل مجموعة من sgRNAs. الحذف الجينومية قد يعطل الجينات باستخدام أزواج sgRNA في مواقع مختلفة فيما يتعلق الجين (الشكل 1B). على سبيل المثال، فإن الزوج قد sgRNA الجناح جين للحذف من الجسم الجين بأكمله؛ يمكن أن يكون موجودا الزوج خلال يومين الإكسونات، مع القدرة على خلق indels انزياح الإطار حتى لو واحد أو كلا علاللم يتم حذف العناوين. أو هذا الزوج قد تكتنف اكسون محدد للسماح تعطل لشكل الإسوي معين.

كانت استراتيجية الحذف تستخدم لPim1 لتصميم المرافقة sgRNAs لحذف الجسم الجين بأكمله، وهو حذف 8 كيلو بايت (الشكل 2). وقد تم اختيار هذه الاستراتيجية ويرجع ذلك جزئيا إلى الحجم الصغير نسبيا من الجين Pim1. يوضح هذا المثال PAM واحد (الأخضر) على رأس (واتسون) حبلا وPAM واحد على الجزء السفلي (كريك) حبلا. ومع ذلك، DSB مستقلة للتوطين تسلسل PAM إلى حبلا العلوي أو السفلي. يمكن أزواج sgRNA على حد سواء متواليات PAM على حبلا العلوي، سواء على حبلا أسفل، أو واحدة من كل. باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه، وقد صممت اثنين sgRNA، المستنسخة في pX330 التعبير ناقلات، وتسليمها إلى خلايا MEL التي كتبها Electroporation للجنبا إلى جنب مع مراسل GFP (الشكل 2A). تم فرز أعلى 3٪ من الخلايا GFP + يومين بعد electroporation ومطلي clonally في الحد من التخفيف. شاشةوقد صممت الاشعال جي كما هو موضح في الخطوة 2 وكما هو مبين في الشكل (2). وقد الأمثل الظروف PCR باستخدام gDNA معزولة من خلايا MEL الأبوية ومن "الأكبر" خلايا فرزها.

بعد 10 أيام والطلاء، وتم عزل gDNA من جميع الحيوانات المستنسخة وفرزهم للحذف عن طريق PCR، والتي حددت عدم الحذف، monoallelic واستنساخ حذف biallelic وفقا لأنماط من غير حذف (ND) وحذف (D) amplicons (الشكل 3) . وتم تحديد الحيوانات المستنسخة غير الحذف وجود وجود amplicon غير الحذف وغياب amplicon الحذف. تم تحديد استنساخ Monoallelic وجود وجود كل من غير حذف وamplicons الحذف. تم تحديد استنساخ Biallelic وجود غياب amplicon غير الحذف وبحضور amplicon الحذف. لهذا الحذف، تم فحص 400 الحيوانات المستنسخة والتي حددت 126 استنساخ حذف monoallelic و 32 DELET biallelic استنساخ أيون (من المهم أن نلاحظ أن التردد الحذف يختلف مع حجم حذف 12). تم اختيار الحيوانات المستنسخة حذف Biallelic وانتقل الى قوارير مع 8 مل من وسائل الإعلام. بعد السماح 5 أيام للتوسع، تم اختبارها من قبل كل استنساخ PCR من gDNA لتأكيد تعرضوا biallelic الحذف وحذف amplicons لسانجر تسلسل لتحديد حذف الدقيق (الشكل 2B). عدم التجانس داخل amplicons الحذف يعكس ناقص تشكيل INDEL NHEJ إصلاح. تسلسل أليل غير الحذف في استنساخ حذف monoallelelic كشف indels في معظم الحالات، مما يدل على أنه حتى أليل غير حذف وكثيرا ما تم بواسطة كريسبر / Cas9، والتي قد تكون مهمة للتطبيقات حيث كلاهما مطلوب monoallelic وbiallelic استنساخ الحذف . تم عزل الحمض النووي الريبي من استنساخ حذف biallelic وتحليلها بواسطة RT-QPCR لتأكيد فقدان Pim1 التعبير (الشكل 4).

طرق "> الشكل (1)
الشكل 1. تخطيطي لاستراتيجيات الحذف ممكنة. (A) اثنين من أزواج سبيل المثال sgRNA لحذف الجينومية (كما هو موضح باللون الأسود والبرتقالي، على التوالي). الأسهم الزرقاء تشير الاشعال للكشف عن amplicon غير الحذف والسهام الحمراء تشير الاشعال للكشف عن amplicon الحذف. sgRNA المواقف 17 و 18 ويسلط الضوء باللون الأحمر والأزرق في sgRNA-مواقع-A 1 / A 2 ثم يتم تمييز في اللون الأرجواني والبرتقالي في sgRNA-مواقع-B 1 / B 2 مع خط أحمر يشير إلى انشقاق Cas9 توقع بين المواقف 17 وترد 18. (B) الانشقاقات الموجهة كريسبر كخطوط سوداء العمودية. الأسهم الزرقاء تشير الاشعال للكشف عن amplicon غير الحذف والسهام الحمراء تشير الاشعال للكشف عن amplicon الحذف. الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. استراتيجية لإنتاج وكشف عن حذف Pim1، بما في ذلك حذف التسلسل والأليلات غير الحذف. (A) تخطيطي للاستراتيجية فحص PCR القائم على تحديد Pim1 استنساخ الحذف. يقع زوج واحد التمهيدي الداخلية لحذف (الأسهم الزرقاء) وزوج التمهيدي واحد المترجمة خارجي لحذف (الأسهم الحمراء). وتظهر تسلسل sgRNA (تسلسل protospacer) باللون الأرجواني. الخطوط الحمراء العمودية تشير إلى انشقاق Cas9 توقع بين المواقف 17 و 18 من تسلسل sgRNA. (B) سانجر تسلسل يكشف تشكيل INDEL في موقع الاعتراف sgRNA. وتظهر تسلسل sgRNA في تسلسل الأرجواني وPAM باللون الأخضر. أحداث الحذف هي SHالخاصة من قبل عدد مساو من علامات اندفاعة والإدراج ويسلط الضوء في الزرقاء. خطوط حمراء عمودية تشير إلى توقع الموقع الانقسام، بين المواقف 17 و 18 من sgRNA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3). هلام الممثل تحديد عدم الحذف، monoallelic، واستنساخ biallelic للحصول على كل استنساخ، الممر الأيسر يمثل عدم الحذف-amplicon ("ND" باللون الأزرق) والممر الأيمن يمثل amplicon حذف ("D" في الحمراء ). يتم فصل الحيوانات المستنسخة الفردية عن طريق الخطوط المنقطة. استنساخ حذف monoallelic الثلاثة هي استنساخ 5 و 6 و 2. استنساخ حذف biallelic الثلاثة هي استنساخ 15، 17، و 13. كما رأينا في تسلسل البيانات، والفرقة الحذف لج وحيد 13 لديها حجم أصغر من المقرر أن الحذف أكبر عند تقاطع الحذف.

الشكل (4)
تم احتساب الرقم 4. فقدان Pim1 التعبير في استنساخ حذف biallelic. Pim1 التعبير عن اثنين من الحيوانات المستنسخة حذف biallelic التي كتبها RT-QPCR. تم تطبيع البيانات لGAPDH باستخدام 2 - طريقة ΔCt.

Protospacer تسلسل
sgRNA-A 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 "
sgRNA-B 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 "

الجدول 1. 20 مير تسلسل protospacer لمدة sgRNA لحذف Pim1.

543 "> تكملة العكسية للProtospacer تسلسل sgRNA-A-RC 5'-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 " sgRNA-B-RC 5'-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 "

الجدول 2. تكملة عكسي من متواليات protospacer لsgRNA اثنين من الجدول 1.

متواليات
sgRNA-A 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 "
sgRNA-A-RC 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 "
sgRNA-B 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 "
sgRNA-B-RC 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 "

الجدول 3. تسلسل Protospacer والعكس بهم يكمل مع "CACC" و "AAAC" وأضافت للاستنساخ في ناقلات pX330 باستخدام BBSI انزيم قيود.

متواليات
sgRNA-A 5'- CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 "
sgRNA-A-RC 5'- AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 "
sgRNA-B 5'- CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 "
sgRNA-B-RC 5'- AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 "

ومما يعزز الجدول التعبير 4. sgRNA من المروج U6 من متجه pX330 من خلال إضافة النوكليوتيدات G بعد تسلسل CACC وقبل20-مير. إضافة إلى G النوكليوتيدات إضافية يتطلب إضافة النوكليوتيدات C في نهاية 3 'من تكملة بنسبة ضئيلة العكسي (على سبيل المثال، sgRNA-A). ومع ذلك، إذا كان المركز الأول من بين 20 مير (تسلسل protospacer) هو بالفعل النوكليوتيدات G، ليست هناك حاجة لإضافة G آخر (على سبيل المثال، sgRNA-B)، وهناك حاجة لإضافة C إلى الموقف النهائي للمكملا عكسي بنسبة ضئيلة.

Discussion

وكريسبر / نظام Cas9 يمكن استخدامها لتوليد الحذف الجينومية من مجموعة واسعة من الأحجام. على الرغم من أننا لاحظنا أن وتيرة حذف يختلف عكسيا فيما يتعلق يقصد حجم الحذف، وكنا قادرين على استعادة الحذف تصل إلى 1 ميغابايت، والحذف تصل إلى 100 كيلو بايت تسفر بشكل روتيني متعددة biallelic حذف الحيوانات المستنسخة. وقد لاحظنا أي خسارة في كفاءة الحذف إدخال بالتتابع في خط الخلية. هذه الاستراتيجية يمكن استخدامها لإنشاء حذف اندماجي العديد من الجينات والعناصر. يمكن المعجل عملية الحصول على استنساخ حذف biallelic عن طريق تقدير الحد الأدنى لعدد من الحيوانات المستنسخة اللازمة ليتم عرضه على أساس حجم الحذف للحصول على العدد المطلوب من الحيوانات المستنسخة مع حذف biallelic 12.

القدرة على الحصول على حذف monoallelic مع غياب حذف biallelic في توزيع احتمالي يمكن أن تشير إلى الفتك الخلية المرتبطة خسارة كاملة وظيفة. منخفض الاب equency أو الحذف غائبة يمكن أن يعكس عددا من السيناريوهات بما في ذلك الفقراء ترنسفكأيشن، sgRNAs غير فعالة أو غير فعالة الاشعال فحص PCR (بسبب عدم وجود مراقبة إيجابية للتحقق من صحة الاشعال PCR للكشف عن الحذف). خلايا GFP + يمكن استخدام كبديل للكفاءة ترنسفكأيشن (راجع الخطوة 5.2)، لذلك من المرجح يعكس انخفاضا في GFP + الخلايا الفقراء ترنسفكأيشن وانخفض والناتجة كفاءة الحذف. باستخدام اثنين من أزواج sgRNA مختلفة مع الاشعال فحص مستقلة يمكن أن تساعد في السيطرة على sgRNA غير فعال وفحص PCR الاشعال وتعظيم فرص الحصول على استنساخ حذف biallelic. خلية الفرز لGFP + الخلايا يثري للالأليلات الحذف. بينما هذه الخطوة قد يتم حذف أو إغفال من المرجح أن تستلزم فحص أكثر الحيوانات المستنسخة لتحديد تلك مع الحذف monoallelic أو biallelic. إلى درجة أن كفاءة ترنسفكأيشن قد يكون الأمثل، فإننا نتوقع كفاءة تحرير الجينوم ليتم تعزيزه.

معشوقة = "jove_content"> الأحداث NHEJ التي تكمن وراء الحذف ونتيجة إصلاح المحلية في سلسلة من الأليلات مع مجموعة متنوعة من indels في المواقع المستهدفة. نتائج السائدة هي ~ 1 صغيرة - 10 بي بي الإدراج أو الحذف أكثر شيوعا في موقع انشقاق sgRNA الموجهة (الشكل 2B). وغالبا ما تظهر هذه الأليلات أن تكون نتيجة القائم على microhomology إصلاح 34،35. وتجدر الإشارة إلى أن الاستراتيجية القائمة على الكشف PCR-وصفنا لن يحدد الإدراج أكبر أو أكثر تعقيدا، والحذف، العكس، أو إعادة ترتيب. على الرغم من أن هذه الأحداث هي أقل شيوعا، لاحظنا الحيوانات المستنسخة التي يمكن من خلالها الكشف عن لا حذف ولا amplicons غير الحذف، وعند إجراء مزيد من التحقيق تعكس هذه النتائج أكثر تعقيدا.

وقد لاحظنا كريسبر واسعة / Cas9 بوساطة "تندب" من الأليلات غير الحذف من monoallelic وعدم الحذف استنساخ (انظر الشكل 2B). هذه "ندوب" تتكون منindels صغيرة تنتج في موقع sgRNA الانقسام دون حذف المقصود (أي حذف الجزء التدخل بين sgRNAs ألف وباء). هذه الندوب في كثير من الأحيان يقطع الاعتراف المستهدفة من قبل sgRNA. ولذا فإننا نحث الحذر في إعادة توجيه الأليلات في الخلايا التي سبق تعرضها للsgRNAs باستخدام نفس sgRNAs. استراتيجية إعادة توجيه أكثر نجاحا من شأنه الاستفادة sgRNA فريدة من نوعها تتابعات متميزة من قبل "ندوب" المواقع الاعتراف. في الحالات عندما يتعرف على زوج من sgRNAs تسلسل exonic (الشكل 1B، أسفل)، التي يمكن أن تنتج الأليلات انزياح الإطار حتى في حالة عدم وجود الحذف. ولذلك، استنساخ حذف monoallelic يمكن المخصب لالخسارة من وظيفة بسبب وتيرة عالية من الطفرات انزياح الإطار على غير حذف-أليل 12.

واحد قلق مع كريسبر / نظام Cas9 هو خارج الهدف آثار، أي تعديل الجيني في مواقع غير مقصودة 36-38. Rوأشارت تقارير ecent أن الرنا دليل أقصر مع 17-19 النيوكليوتيدات يمكن أن تقلل من تكرار كريسبر / خارج الهدف آثار 39 Cas9 المستندة. بالإضافة إلى ذلك، استراتيجية مزدوجة تخصر باستخدام اثنين من أدلة في الموقع المستهدف مع nickase يمكن استخدامها لإنشاء DSBs مع التقليل من خارج الهدف آثار 7. بدلا من ذلك، مماثلة لالاستراتيجيات المستخدمة لرني، نقترح أن أزواج مختلفة من sgRNAs مع غير متداخلة متواليات protospacer أن تستخدم لإظهار أن النمط الظاهري لوحظ هو نتيجة للكريسبر / Cas9 تعديل على هدف مقابل لإمكانات بعيدا عن الهدف تأثير. ومن شأن اتباع نهج مناسب يكون لتصميم اثنين على الأقل المجاورة ولكن غير متداخلة أزواج sgRNA بحيث مجموعة واحدة من الاشعال الفرز (راجع الخطوة 2) يمكن أن تستخدم للأزواج sgRNA متعددة (الشكل 1A). وعلاوة على ذلك، واستكمال خط الخلية حذف من إعادة تقديم تسلسل في عداد المفقودين و / أو الجينات تعطلت يمكن إثبات وجود علاقة سببية بينحذف الجينومية معين، والنمط الظاهري.

لعلماء الأحياء العمل مع أنظمة نموذج الخلوي، ورني يمثل أداة قوية لعلم الجينوم وظيفية. ومع ذلك، وشملت القيود المفروضة على هذا النهج غير مكتمل تخفيض في مستويات النص مرنا الهدف، عدم تجانس تأثير الكواشف مستقلة تستهدف نفس الجين، والمعروف خارج الهدف آثار بما في ذلك الآثار القائمة على البذور وغير المصنفة 40-42. استراتيجيات تحرير الجينوم وعد لمعالجة العديد من هذه الشواغل وتمثل توجها مثيرا، مكملة لاضطراب وراثي المحتملين 8،36،37. وعلاوة على ذلك، والتحرير الجينوم يسمح لدراسة غير الترميز العناصر الجينية بطريقة غير ممكن بواسطة رني والتي تمثل تحديا استهداف التقليدية نهج 25. ونحن نشجع الجيل الحذف الجينومية من قبل كريسبر / Cas9 كوسيلة من وسائل قوية ومحددة لإنتاج وتوصيف الخسارة من وظيفة الأليلات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T4 DNA ligase (with associated ligation buffer) New England Biolabs M0202T
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
BSA, molecular biology grade New England Biolabs B9000S
BbsI restriction enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) New England Biolabs R0539S
pSpCas9(BB) (pX330) Addgene 42230
S.O.C. medium Life Technologies 15544-034
BTX ECM 830 Harvard Apparatus 45-0052
BTX solution and 2 mm cuvettes Harvard Apparatus 45-0803
pmaxGFP plasmid Lonza VPA-1003
QuickExtract DNA Extraction Solution Epicentre QE09050
HotStarTaq PCR Master Mix Kit Qiagen 203443
Zero Blunt PCR Cloning Kit Life Technologies K2700-20
Plasmid Addgene 42230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. Z. F. N., TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709-1712 (2007).
  6. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  7. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  8. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  9. Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nature Protocols. 8 (11), 2180-2196 (2013).
  10. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  11. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  12. Canver, M. C., et al. Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by CRISPR/Cas9 in Mammalian Cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  13. Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Research. 41 (14), e141 (2013).
  14. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9 mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. , (2014).
  15. Wang, T., et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Niu, Y., et al. Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
  18. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
  19. Xie, K., Yang, Y. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. Molecular Plant. 6 (6), 1975-1983 (2013).
  20. Waaijers, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 195 (3), 1187-1191 (2013).
  21. Bassett, A. R., Liu, J. L. CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila. Journal of Genetics and Genomics. 41 (1), 7-19 (2014).
  22. Schwank, G., et al. Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in Intestinal Stem Cell Organoids of Cystic Fibrosis Patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  23. Wu, Y., et al. Correction of a Genetic Disease in Mouse via Use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 13 (6), 659-662 (2013).
  24. Lappalainen, T. M., et al. Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans. Nature. 501 (7468), 506-511 (2013).
  25. Bauer, D. E., et al. An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level. Science. 342 (6155), 253-257 (2013).
  26. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS One. 3, e3647 (2008).
  27. Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177, 437-447 (2003).
  28. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
  29. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  30. Finney, M., Nisson, P. E., Rashtchian, A. Molecular cloning of PCR products. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 15. (Unit 15.4), (2001).
  31. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR). J. Vis. Exp. (63), e3874 (2012).
  32. Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas. J. Vis. Exp. (89), e51093 (2014).
  33. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  34. McVey, M., Lee, S. E. MMEJ repair of double-strand breaks (director’s cut): deleted sequences and alternative endings. Trends in Genetics. 24 (11), 529-538 (2008).
  35. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  36. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  37. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnology. , (2014).
  38. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  39. Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32, 279-284 (2014).
  40. Alemán, L. M., Doench, J., Sharp, P. a Comparison of siRNA-induced off-target RNA and protein effects. RNA. 13 (3), 385-395 (2007).
  41. Anderson, E. M., et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA. 14, 853-861 (2008).
  42. Marine, S., et al. Common seed analysis to identify off-target effects in siRNA screens. Journal of Biomolecular Screening. 17 (3), 370-378 (2012).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 83، كريسبر، Cas9، هندسة الجينوم، جين خروج المغلوب، الجينوم الحذف، تنظيم الجينات
جيل من الجينوم الحذف في خطوط خلايا الثدييات عبر كريسبر / Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin,… More

Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118, doi:10.3791/52118 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter