Protocol
1. CRISPR Design
- Design sgRNAs manuelt eller ved hjælp frit tilgængelige online værktøjer 7. Brug disse værktøjer til at hjælpe med at identificere guide sekvenser, der minimerer identiske genomiske tændstikker eller næsten-kampe for at mindske risikoen for spaltning væk fra målsteder (off-target effekter). Sikrer, at oversigten sekvenser består af en 20-mer ("protospacer sekvens") opstrøms for en "NGG" sekvens ("protospacer tilstødende motivet" eller PAM) på genomisk anerkendelse site.
BEMÆRK: Figur 1 beskriver eventuelt fjerne strategier for gener og ikke-kodende elementer. For at skabe et gen knockout, vil to sgRNA beliggende inden exons berige selv monoallelisk deletionskloner for tab af funktion. Dette skyldes den høje frekvens af indels dannet på ikke-slettede alleler 12, som kan forårsage læserammeforskydningsmutationer fører til nonsens medieret nedbrydning af mRNA-transkriptet (figur 1B). - Brugeksempel guider til den påtænkte sletning af Pim1 i mus (Mus musculus, tabel 1, figur 2A).
BEMÆRK: I dette eksempel sgRNA-A'er protospacer sekvens og PAM tilfældigvis falder på bunden (Crick) streng mens sgRNA-B s protospacer sekvens og PAM falde på toppen (Watson) streng (figur 2A). Imidlertid vil DSB forekomme uafhængigt af orienteringen af protospacer sekvens / PAM i forhold til den øverste eller nederste streng. - Bestem den omvendte komplement (rc) for hver styresekvens. Eksempel reverse komplement sekvenser af Pim1 sgRNA fra tabel 1 findes i tabel 2.
- Opnå 24- eller 25-mer-oligoer for hver guide og dens tilhørende omvendte komplement herunder yderligere nukleotider til kloning og ekspression formål.
BEMÆRK: Her diskuterer vi brugen af pSpCas9 (BB) plasmid (pX330) (Addgene plasmid ID 42230). Dette plasmid giver mulighed for samtidigudtryk for sgRNA og SpCas9, men indeholder ikke markører til udvælgelse 7. Andre konstruktioner kan anvendes, såsom pX458 (Addgene plasmid ID 48138) eller pX459 (Addgene plasmid ID 48139), som omfatter GFP og puromycin som selekterbare markører henholdsvis eller konstruktioner, hvor flere sgRNAs kan udtrykkes fra en enkelt plasmid.- Tilføj "CACC" før guide sekvens 20-mer og "AAAC" før guidens omvendte supplement til kloning i pX330 vektor ved anvendelse enzym BbsI restriktion (tabel 3).
- Tilføj en G nukleotid efter CACC sekvens og før 20-mer, hvis den første position af den 20-mer er ikke G. sgRNA ekspression fra U6 promotoren af pX330 vektoren forstærkes ved inklusion af en G nukleotid efter CACC sekvens . Tilføj et C ved 3 'enden af den omvendte komplement oligo (f.eks sgRNA-A i tabel 4). De resulterende oligos ville være 25-mer oligoer.
- Hvordannogensinde, hvis den første position af 20-mer (protospacer sekvens) er G, ikke tilføje en anden G (f.eks sgRNA-B i tabel 4) og ikke tilføje C til den endelige position af den omvendte komplement oligo. I dette tilfælde ville de resulterende oligoer være 24-mer oligoer (tabel 4).
2. Design Deletion Screening Primere
- Design et sæt af primere internt i sekvensen, der skal slettes ("ikke-deletion band") og et andet sæt af primere opstrøms og nedstrøms for sgRNA spaltningssteder ("udeladelse band" Figur 1 - 2). I mangel af deletion, en "deletion band" er ofte for store til effektivt at forstærke. Typisk anvender primere på mindst 100 bp fra den forudsagte spaltningssted for at sikre påvisning vil ikke blive påvirket af en lille Indel på sgRNA målstedet.
- Design yderligere primere til at analysere for ardannelse (små indels produceret på sgRNA cleavage websted uden den tilsigtede tekst udgår). Brug et par frem og bak primere flankerer hver sgRNA målområde (indenfor 150-350 bp) for at forstærke den sgRNA målområdet for at undersøge for ardannelse. Dette kan være nyttigt at karakterisere de ikke-slettede allel i monoallelisk deletionskloner.
- For små deletioner (som "sletning band" kan stadig forstærke), løse ampliconer på en agarosegel for at bestemme, hvis størrelse er i overensstemmelse med tilstedeværelsen eller fraværet af deletion. Til denne fremgangsmåde kan de interne primere, der er beskrevet i trin 2.1 udelades.
3. CRISPR Kloning
- Anneale og phosphorylere oligoer.
- Resuspender oligos i en koncentration på 100 uM i Hedeselskabet 2 O.
- Forbered en 10 pi reaktionsblanding for hver vejledning og dens omvendte komplement: 1,0 pi sgRNA 24- eller 25-mer oligo (100 um, se trin 1.4), 1,0 pi sgRNA 24- eller 25-mer omvendt complement oligo (100 um, se trin 1.4), 1,0 pi 10x T4 Ligation Buffer, 6.5 pi Hedeselskabet 2 O og 0,5 pi T4-polynukleotidkinase (PNK) (10.000 U / ml).
BEMÆRK: Phosphoryleret oligoer kan bestilles i stedet. Til denne fremgangsmåde er anvendelsen af T4 PNK udeladt. - Anneal i en thermocycler anvendelse af følgende parametre: 37 ° C i 30 min; 95 ° C i 5 minutter og derefter rampe ned til 25 ° C ved 5 ° C / min.
- Fortynd oligoer 1:10 i Hedeselskabet 2 O (fx 1,0 pi annealet oligoer + 9,0 pi Hedeselskabet 2 O til opnåelse af en koncentration på 1 uM).
- Afsnøre annealede oligoer i pX330 bruger Golden Gate samling kloningsstrategi 26.
- Forbered en 50 pi reaktion mix: 100 ng cirkulær pX330 vektor 1,0 pi annealede oligoer (1 um, se trin 3.1.4), 5,0 pi restriktionsenzym buffer (10x), 4,0 pi (20 U) enzym BbsI restriktion (5.000 U / ml), 5,0 μl ATP (10 mM), 0,25 pi (5 ug) BSA (20 mg / ml), 0,375 pi (750 U) T4-DNA-ligase (2.000.000 U / ml) og H2O til slutvolumen på 50 pi. Denne reaktion kan skaleres ned til en mindre slutvolumen, hvis nødvendigt.
- Kør prøver i en thermocycler anvendelse af følgende parametre: Cycles 1-20 (37 ° C i 5 min, 20 ° C i 5 min); Cyklus 21 (80 ° C i 20 min). Disse cykelforhold tillader fordøjelse og ligering at forekomme i en reaktion (se trin 3.2).
- Transform 10 pi DH5a E. coli-celler med 1 pi reaktion (fra 3.2.1 - 3.2.2).
- Plade på en lysogeni bouillon (LB) agarplader med 100 ug / ml ampicillin og inkuberes O / N ved 37 ° C.
- Pick 2 - 3 kolonier og pode ind i en mini-prep kultur.
- Udfør mini-prep for hver prøve og sekventere hver koloni ved anvendelse af en U6 promotor fremadrettet primer: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Dette er arepresentative sekventeringsprimer; andre flankerende primere kan anvendes.
- Vælg en sekvens-verificeret koloni og pode ind i en maxi-prep kultur. Prep størrelse kan skaleres baseres på det krævede DNA udbytte.
- Udfør maxi-prep for hver CRISPR / Cas9 konstruktion.
4. -Transfektere CRISPRs i celler af interesse
BEMÆRK: Denne protokol indebærer levering af CRISPR / Cas9 plasmider ved elektroporation 27. Denne protokol er beskrevet i detaljer for murine erythroleukæmi (MEL) -celler, en suspension cellelinie. Dyrkningsmediet i alle trin består af DMEM suppleret med 2% penicillin / streptomycin og 1% L-glutamin, som anvendes til MEL-celler. Dog kan forbigående transfektion af CRISPR / Cas9 plasmider med held tilpasset talrige celletyper hjælp foretrukne dyrkningsbetingelser og transfektion strategier for hver celletype. Mens MEL celler er suspensionsceller, instruktioner for adhærente celler have også medtaget.
- Sørg der er 2 x 10 6 celler pr CRISPR par. Resuspender 2 x 10 6 celler i 100 pi elektroporering opløsning og tilføje til elektroporation cuvette.
- Tilsæt 5 ug af hver CRISPR / Cas9 konstruktionen (10 ug total). Tilsæt 0,5 ug GFP ekspressionskonstruktionen.
- Elektroporere celler med 250 volt til 5 ms på en 2 mm kuvette under anvendelse af et elektroporation systemet.
BEMÆRK: Alternativt kan en anden transfektion metode, såsom kationisk liposom-baseret transfektion. Optimer transfektion betingelser for hver cellelinje med en reporterkonstruktion at sikre robust plasmid levering, inden du forsøger genom redigering. - Straks overføre løsning fra kuvetten i 1 ml af dyrkningsmedier efter elektroporation. Minimer tiden mellem elektroporation og overføre opløsningen i medierne til at øge cellernes levedygtighed.
- Inkuberes ved 30-37 ° C i 24-72 timer. 30 ° C kan forøge genomredigering effektivitet, men 37 ° C er acceptable.
5. fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) af transficerede celler
- Forbered cellerne til FACS ved filtrering dem gennem et 50 um filter til et FACS-rør.
- FACS sortere top ~ 3% af GFP-positive celler med henblik på at berige for celler, der har modtaget høje niveauer af CRISPR / Cas9 konstruktioner.
- Plate sorterede celler individuelt i 96-brønds rundbundede plader under anvendelse sorteringsanlæg eller ved hjælp af begrænsende fortynding på 30 celler pr 96-brønds rundbundet plade. Optimer plating den celletype anvendt ved begrænsende fortynding forud for udførelse af dette trin til pålideligt at opnå cirka 30 celler pr plade med 96 brønde.
- Omfatte 100 pi per brønd af celledyrkningsmedier.
- For de resterende sorterede celler ("bulk"), der var ikke dubleret, fryse halvdelen af cellerne for fremtidig plating. Plate den anden halvdel til screening og primer validering (se trin 6).
BEMÆRK: Denne protokol er for suspension celler. Adhærerende celler kan enten vokse som individuelle celler i 96-brønds fladbundet plade eller i en 10 cm skål ved lav koncentration, således at individuelle encellede afledte kloner kan plukkes og flyttes til en fladbundet plade med 96 brønde. - Tillad bulk celler til at inkubere ved 37 ° C i 3 - 7 dage og lade klonerne at inkubere ved 37 ° C i 7-14 dage. Variere disse tider afhængigt af fordoblingstiden for cellelinien anvendes.
BEMÆRK: Denne inkubationstiden muliggør tilstrækkelig celleproliferation til screening genomisk DNA (gDNA) for den tilsigtede sletning ved PCR (se trin 6.1 og 7.1). Hovedparten celler har tilstrækkeligt prolifererede når koncentrationen overstiger ~ 100.000 celler / ml eller adhærente celler har cellerne nået ~ 80% sammenflydning. Klonerne har tilstrækkeligt spredt en gang makroskopisk synlige med ~ 2 mm diameter.
6. Primer Validering og Screening for CRISPR / Cas9-medieret Sletning
- Isoler gDNA fra forældrenes og bulk sorterede celler ved at resuspendere forældres og bulk cellepellets i 50 ul DNA-ekstraktion løsning.
Bemærk: Generelt ~ 100.000 celler anvendes til DNA-ekstraktion, selvom en bred vifte af celleantal er acceptabel. Hovedparten sorterede celler er sammensat af et polyklonalt population udsat for sgRNA-A og sgRNA-B (se trin 5). Formålet med den følgende PCR er at validere primere og kontrollere tilstedeværelsen af tilsigtede genomisk sletning. - Kør prøve i thermocycler og køre følgende program: 65 ° C i 6 min, 98 ° C i 2 minutter for at udtrække gDNA. Mål DNA-koncentrationen.
BEMÆRK: Når trin 6.1 og 6.2 anbefaler en effektiv metode til DNA-ekstraktion, kan enhver fremgangsmåde til genomisk DNA isolation udnyttes til at kunne udføre PCR i trin 6.3. - Saml en 20 pi PCR med følgende komponenter: 10 pi 2x PCR-blanding, 0,5 pi fremadrettede primer (10 _6 M), 0,5 pi reverse primer (10 uM), 50-100 ng gDNA og H 2 O op til 20 pi. Brug primere designet i trin 2 ovenfor. Conduct PCR for "ikke-deletion band" og "sletning band" i separate reaktioner.
BEMÆRK: Talrige polymeraser kan anvendes til trin 6.3.- Kør prøver i en thermocycler anvendelse af følgende parametre: 95 ° C i 15 minutter, 35 cykler af (95 ° C i 30 sek, 60 ° C i 1 min, 72 ° C i 1 min) og 72 ° C i 10 minutter . Optimer PCR-betingelser for hver primer par designet baseret på afprøvning bulk sorteres celler.
- Kør prøver på 2% agarosegel ved 10 V / cm ved anvendelse 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) puffer.
- Undersøge prøver for tilstedeværelse / fravær af ikke-deletion og sletning bånd (Figur 2). Overvej multiplexe "sletning" og "ikke-deletion" PCR primerpar i en enkelt reaktion. Optimer multiplexingi et polyklonalt population (dvs. størstedelen sorterede celler), før screening individuelle kloner. Det er afgørende, at sletning og ikke-sletning amplicons nemt løses på en agarosegel for multiplexing.
7. Screening CRISPR / Cas9 kloner for deletioner og Clone Selection
- For suspensionsceller, overføre alle kloner til en enkelt plade med 96 brønde, som allerede indeholder 50 pi celledyrkningsmedier per brønd for et endeligt volumen på 150 pi. Dette letter screening ved at tillade en multikanalpipette, der skal anvendes for den resterende del af trinene i trin 7.
- Overfør 50 pi fra hver brønd (forlader 100 pi i hver brønd) til en 96-brønds PCR-plade ved hjælp af en multikanalpipette.
- Centrifuge PCR-plade ved 400 xg i 5 minutter og fjern supernatanten ved at stille PCR-plade over en vask. Der tilsættes 50 pi DNA-ekstraktion opløsning per brønd og resuspender. Fortsæt til trin 7.3 for suspension celler.
- For adhærente celler Aspirer medier. Der tilsættes 20 pi 0,05% trypsin-EDTA til hver brønd med en klon til stede.
- Resuspender celler i 200 pi medier. Pipette mix at løsne cellerne.
- Plate 100 pi hver i to separate 96-brønds fladbundede plader. Hold en plade for at muliggøre kloner til at vokse og bruge den anden plade til at screene hver klon for deletioner.
- Tilføje en ekstra 100 pi til hver brønd i et samlet volumen på 200 pi. Vent 24-72 timer for at tillade celler til at vokse.
- Aspirer medier. Tilsættes 50 pi DNA-ekstraktion opløsning per brønd, resuspender og overførsel til 96-brønds PCR-plade. Fortsæt til trin 7.3.
- Uddrag gDNA fra kloner. Kør prøve i thermocycler: 65 ° C i 6 minutter og 98 ° C i 2 min for at ekstrahere gDNA.
- Screen hver klon under anvendelse af samme PCR-primere og reaktionsbetingelser er optimeret på bulk-celler (se trin 6).
- Vælg kloner idenficeres med den ønskede sletning og flytte til større plade eller kolbe for vækst.
8. Validering af biallele deletionskloner
- For at karakterisere opnåede kloner og validere en vellykket knockout, evaluere kloner på DNA samt RNA og / eller proteinniveauer.
- For at vurdere DNA forstærke sletning bands fra biallele deletionskloner med korrekturlæsning polymerase og klone amplikoner (f.eks, med en PCR-kloning kit) i en plasmidvektor. Omdan plasmidet i DH5a E. coli-celler og plade på LB agarplader med relevante antibiotika. Vælg flere kolonier, mini-prep hver enkelt, og underkaste hver klon til Sanger sekventering til at karakterisere hver sletning allel 28-30. Gentagelse af PCR test til sletning efter den første skærm sikrer, at den korrekte klon blev udvalgt og reproducerbarhed af resultaterne.
- For at evaluere RNA, udføre RT-qPCR for gene ekspression af det relevante gen 30,31.
- At evaluere proteinet udfører en immunblot under anvendelse af et antistof mod det pågældende protein 33.
Representative Results
Målet med dette forsøg var udeladelsen af Pim1 i MEL-celler. Anvendelse af multiple ikke-overlappende sgRNA par (dvs. uafhængige protospacer sekvenser) kan hjælpe til at kontrollere for off-target effekter (figur 1A). En konsekvent fænotype ville være mere tilbøjelige til at skyldes en on-target effekt i modsætning til en almindelig off-target effekt deles af flere uafhængige protospacer sekvenser. Hvert par vil føre til produktion af et unikt sletning breakpoint. Hvis tæt sammen (dvs. n mindre end ~ 150 bp) kunne de samme screening primere anvendes til at detektere deletioner produceres ved hvert sæt af sgRNAs. Genomiske deletioner kan forstyrre gener ved hjælp sgRNA par i forskellige steder i forhold til genet (figur 1B). For eksempel kan sgRNA par flankerer et gen for deletion af hele genet kroppen; parret kunne placeres i to exoner, med potentiale til at skabe frameshift indels selv hvis en eller begge alleles blev ikke slettet; eller parret kan flankere et specifikt exon at muliggøre afbrydelse af en bestemt isoform.
Sletningen anvendte strategi for Pim1 var at designe flankerende sgRNAs at slette hele genet kroppen, 8 kb deletion (figur 2). Denne strategi blev valgt dels på grund af den relativt lille størrelse Pim1 genet. Dette eksempel viser en PAM (grøn) på toppen (Watson) streng og en PAM på bunden (Crick) streng; Men DSB er uafhængig af PAM sekvens lokalisering til toppen eller bunden streng. sgRNA par kan have både PAM sekvenser på topstrengen, både på den nederste streng, eller en af hver. Ved hjælp af ovenfor beskrevne protokol, blev to sgRNA udformet, klonet i pX330 ekspressionsvektor, og leveret til MEL-celler ved elektroporering sammen med en GFP reporter (figur 2A). Toppen 3% af GFP + celler blev sorteret to dage efter-elektroporation og belagt klonalt at begrænse fortynding. SkærmIng primere blev udformet som beskrevet i trin 2 og som vist i figur 2. PCR-betingelser blev optimeret under anvendelse gDNA isoleret fra parentale MEL-celler og fra "bulk" sorterede celler.
10 dage efter udpladning blev gDNA isoleret fra alle kloner og screenet for sletning via PCR, hvilket identificerede ikke-deletion, monoallelisk og biallele deletionskloner ifølge mønstre af ikke-deletion (ND) og deletion (D) amplikoner (figur 3) . Ikke-deletionskloner blev identificeret som havende den tilstedeværelsen af det ikke-deletion amplicon og fraværet af deletionen amplicon. Monoallelisk kloner blev identificeret som havende tilstedeværelsen af både den ikke-deletion og sletning ampliconer. Biallele kloner blev identificeret som havende fravær af ikke-deletion amplicon og tilstedeværelsen af deletionen amplicon. Til denne sletning blev 400 kloner screenet som identificerede 126 monoallelisk deletionskloner og 32 biallele DELET ion kloner (det er vigtigt at bemærke, at sletning frekvens varierer med sletning størrelse 12). Biallele deletionskloner blev udvalgt og flyttet til kolber med 8 ml medie. Efter at 5 dage for ekspansion, blev hver klon underkastes en ny PCR af gDNA at bekræfte biallele sletning og sletning amplicons blev underkastet Sanger sekventering for at identificere den præcise sletning (figur 2B). Heterogenitet inden sletningen amplikoner afspejler ufuldstændig Indel-dannende NHEJ reparation. Sekventering af ikke-deletion allel i monoallelelic deletionskloner udækkede indels i de fleste tilfælde, hvilket viser, at selv ikke-slettede allel ofte er redigeret af CRISPR / Cas9, der kan være vigtig til anvendelser, hvor der kræves både monoallelisk og biallele deletionskloner . RNA blev isoleret fra biallele deletionskloner og analyseret ved RT-qPCR at bekræfte tab af Pim1 ekspression (figur 4).
måder ">
Figur 1. Skematisk af eventuelt fjerne strategier. (A) To eksempel sgRNA par for genomiske deletioner (vist i sort og orange, henholdsvis). De blå pile angiver primere til påvisning af ikke-deletion amplikon og røde pile viser primere til påvisning af deletion amplicon. sgRNA positioner 17 og 18 er fremhævet med rødt og blåt sgRNA-steder-A 1 / A 2 og er fremhævet med lilla og orange på sgRNA-steder-B 1 / B 2 med en rød linje angiver det forudsagte Cas9 spaltning mellem positionerne 17 og 18. (B) CRISPR-rettet spaltninger er vist som lodrette sorte streger. De blå pile angiver primere til påvisning af ikke-sletning amplikon og røde pile angiver primere til påvisning af sletning ampliconen. Klik her for at seen større version af dette tal.
Figur 2. Strategi for at producere og opdage sletning af Pim1, herunder sekventering sletning og ikke-sletning alleler. (A) Skematisk af PCR-baseret screening strategi for at identificere Pim1 sletning kloner. Et primerpar ligger internt i deletion (blå pile) og en primerpar er lokaliseret uden for deletion (røde pile). sgRNA sekvenser (protospacer sekvenser) er vist i lilla. De lodrette røde streger angiver det forudsagte Cas9 spaltning mellem positionerne 17 og 18 i sgRNA sekvensen. (B) Sanger sekventering afslører Indel dannelse på stedet sgRNA anerkendelse. sgRNA sekvenser er vist i lilla og Pam sekvenser i grønt. Deletion begivenheder er shegne med et tilsvarende antal dash mærker og indsættelser er fremhævet med blåt. Lodrette røde linjer angiver forudsagt spaltningsstedet mellem positionerne 17 og 18 i sgRNA. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Repræsentant gel identifikation af ikke-deletion, monoallelisk og biallele kloner. For hver klon, venstre vognbane repræsenterer manglende sletning amplikon ("ND" i blåt) og den rigtige vognbane repræsenterer sletningen amplikon ("D" i rødt ). Individuelle kloner er adskilt af stiplede linier. De tre monoallelisk deletionskloner er kloner 5, 6 og 2. De tre biallele deletionskloner er kloner 15, 17, og 13. Som det ses på sekventering data sletningen båndet for C Lone 13 har en mindre størrelse på grund af større deletioner på sletningen krydset.
Figur 4. Tab af Pim1 ekspression i biallele deletionskloner. Pim1 ekspression blev beregnet for to biallele sletning kloner ved RT-qPCR. Dataene blev normaliseret til GAPDH ved hjælp af 2 - ACt metoden.
| Protospacer Sequence | |
| sgRNA-A | 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' |
| sgRNA-B | 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' |
Tabel 1. 20-mer protospacer sekvenser for to sgRNA for sletning af Pim1.
543 ">Tabel 2. omvendte komplement af protospacer sekvenser for de to sgRNA fra tabel 1.
| Sekvenser | |
| sgRNA-A | 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' |
| sgRNA-A-rc | 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' |
| sgRNA-B | 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' |
| sgRNA-B-RC | 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' |
Tabel 3. Protospacer sekvenser og deres omvendte supplerer med "CACC" og "AAAC" tilføjede til kloning i pX330 vektor ved anvendelse BbsI restriktionsenzym.
| Sekvenser | |
| sgRNA-A | 5'- CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' |
| sgRNA-A-rc | 5'- AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 ' |
| sgRNA-B | 5'- CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' |
| sgRNA-B-rc | 5'- AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' |
Tabel 4. sgRNA ekspression fra U6 promotoren af pX330 vektoren forstærkes ved tilsætning af en G nukleotid efter CACC sekvens og før20-mer. Tilsætning af en ekstra G nucleotid kræver tilsætning af et C nukleotidet i 3'-enden af det reverse komplement oligo (f.eks sgRNA-A). Men hvis den første position af den 20-mer (protospacer sekvens) er allerede en G nukleotid, der ikke er behov for at tilføje endnu G (f.eks sgRNA-B) og ikke nødvendigt at tilføje C til den endelige position af den omvendte komplement oligo.
Discussion
The CRISPR / Cas9 Systemet kan anvendes til at generere genomiske deletioner af en række størrelser. Selv om vi har observeret, at hyppigheden af sletningen varierer omvendt med hensyn til hensigten sletning størrelse, har vi været i stand til at inddrive sletninger på op til 1 Mb, og sletninger op til 100 kb rutinemæssigt giver flere biallele slettet kloner. Vi har observeret noget tab i effektivitet sekventielt indfører deletioner i en cellelinie. Denne strategi kan anvendes til skabelse af kombinatorisk sletning af mange gener og elementer. Processen med at opnå biallele deletionskloner kan fremskyndes ved at estimere det minimale antal af kloner, der er nødvendige for at blive screenet baseret på sletning størrelse for at opnå det ønskede antal kloner med biallel deletion 12.
Evnen til at opnå monoallelisk deletion med fraværet af biallele deletion ved probabilistisk fordeling kunne tyde celle letalitet forbundet med komplet tab af funktion. Lav frequency eller fraværende sletninger kunne afspejle en række scenarier, herunder dårlig transfektion, ineffektive sgRNAs eller ineffektive PCR screening primere (på grund af manglen på en positiv kontrol at validere PCR-primere til at screene for sletning). GFP + celler kan anvendes som et surrogat for transfektionseffektivitet (se trin 5.2), så en reduktion i GFP + -celler sandsynligvis afspejler dårlig transfektion og en deraf faldt deletion effektivitet. Brug to forskellige sgRNA par med uafhængige screening primere kan hjælpe med at kontrollere for ineffektiv sgRNA og screening PCR-primere og maksimere chancerne for at opnå biallele sletning kloner. Cellesortering for GFP + -celler beriger for sletning alleler. Mens dette trin kan udelades, vil udeladt nødvendiggør screening flere kloner for at identificere dem med monoallelisk eller biallele sletninger. I den grad, at transfektionseffektiviteten kan optimeres, ville vi forvente genom redigering effektivitet skal forbedres.
(figur 2B). Ofte er disse alleler synes at være resultatet af microhomology baseret reparation 34,35. Det skal bemærkes, at det PCR-baseret detektion strategi beskriver vi ikke vil identificere større eller mere komplicerede insertioner, deletioner, inversioner eller omlejringer. Selv om disse begivenheder er mindre almindelige, har vi observeret kloner, hvor hverken sletning eller ikke-sletning amplikoner kan opdages, og efter yderligere undersøgelse afspejle disse mere komplekse resultater.
Vi har observeret omfattende CRISPR / Cas9-medieret "ardannelse" ikke-deletion alleler fra monoallelisk og ikke-deletionskloner (se figur 2B). Disse "ar" består afsmå indels produceret på sgRNA spaltningsstedet uden den tilsigtede sletning (dvs. udeladelse af den mellemliggende segment mellem sgRNAs A og B). Disse ar ofte afbryde mål anerkendelse fra sgRNA. Derfor vil vi opfordre til forsigtighed i retargeting alleler i celler tidligere har været udsat for sgRNAs med de samme sgRNAs. En mere succesfuld retargeting strategi ville udnytte unikke sgRNA sekvenser adskiller sig fra tidligere "arrede" Anerkendelse sites. I tilfælde, hvor et par af sgRNAs genkender exon sekvenser (figur 1B, nederst), kan frameshift alleler fremstilles selv i fravær af sletningen. Derfor kan monoallelisk deletionskloner beriges for tab af funktion på grund af den høje frekvens af rammeskift mutationer på den ikke-slettet allel 12.
En bekymring med CRISPR / Cas9 systemet er off-target effekter, dvs. genomisk modifikation på utilsigtede steder 36-38. RSENESTE rapporter har antydet, at kortere guide RNA'er med 17-19 nukleotider kan reducere hyppigheden af CRISPR / Cas9-baseret off-target effekter 39. Derudover kan en dobbelt-nicking strategi ved hjælp af to føringer pr målsted med nickase bruges til at skabe DSB'er samtidig minimere off-target virkninger 7. Alternativt analogt med strategier, der anvendes til RNAi, foreslår vi, at forskellige par sgRNAs med ikke-overlappende protospacer sekvenser bruges til at påvise, at den observerede fænotype er resultatet af CRISPR / Cas9 modifikation on target i modsætning til en potentiel off-target virkning. En bekvem fremgangsmåde ville være at designe mindst to tilstødende, men ikke-overlappende sgRNA parvis, så et enkelt sæt screening primere (se trin 2) kan bruges til flere sgRNA par (figur 1A). Desuden kan supplere en sletning cellelinie ved at genindføre de manglende sekvens og / eller forstyrres gen underbygge en årsagssammenhæng mellemen given genomisk deletion og fænotype.
For biologer, der arbejder med cellulære modelsystemer har RNAi repræsenteret et kraftfuldt værktøj til funktionel genomforskning. Imidlertid har begrænsninger ved denne metode medtaget ufuldstændig reduktion i target mRNA transkriptniveauer, heterogenitet effekt af uafhængige reagenser rettet mod samme gen, og kendte ikke-tilsigtede virkninger, herunder frø-baserede og ikke-seed virkninger 40-42. Genom redigering strategier lover at behandle mange af disse bekymringer, og repræsenterer en spændende, komplementær tilgang til potentielle genetiske forstyrrelse 8,36,37. Endvidere genom redigering muliggør studiet af ikke-kodende genetiske elementer på en måde, ikke mulig ved RNAi og udfordrende ved konventionel målretningsmetoder 25. Vi opfordrer generation af genomiske udeladelser CRISPR / Cas9 som en robust og specifik metode til at producere og karakterisere tab af funktion alleler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 DNA ligase (with associated ligation buffer) | New England Biolabs | M0202T | |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| BSA, molecular biology grade | New England Biolabs | B9000S | |
| BbsI restriction enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) | New England Biolabs | R0539S | |
| pSpCas9(BB) (pX330) | Addgene | 42230 | |
| S.O.C. medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| BTX ECM 830 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| BTX solution and 2 mm cuvettes | Harvard Apparatus | 45-0803 | |
| pmaxGFP plasmid | Lonza | VPA-1003 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Epicentre | QE09050 | |
| HotStarTaq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 203443 | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Life Technologies | K2700-20 | |
| Plasmid |  Addgene |
42230 |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. Z. F. N., TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709-1712 (2007).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nature Protocols. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Canver, M. C., et al. Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by CRISPR/Cas9 in Mammalian Cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).
- Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Research. 41 (14), e141 (2013).
- Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9 mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. , (2014).
- Wang, T., et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Niu, Y., et al. Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Xie, K., Yang, Y. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. Molecular Plant. 6 (6), 1975-1983 (2013).
- Waaijers, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 195 (3), 1187-1191 (2013).
- Bassett, A. R., Liu, J. L. CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila. Journal of Genetics and Genomics. 41 (1), 7-19 (2014).
- Schwank, G., et al. Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in Intestinal Stem Cell Organoids of Cystic Fibrosis Patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Wu, Y., et al. Correction of a Genetic Disease in Mouse via Use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 13 (6), 659-662 (2013).
- Lappalainen, T. M., et al. Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans. Nature. 501 (7468), 506-511 (2013).
- Bauer, D. E., et al. An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level. Science. 342 (6155), 253-257 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS One. 3, e3647 (2008).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177, 437-447 (2003).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Finney, M., Nisson, P. E., Rashtchian, A. Molecular cloning of PCR products. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 15. (Unit 15.4), (2001).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR). J. Vis. Exp. (63), e3874 (2012).
- Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas. J. Vis. Exp. (89), e51093 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- McVey, M., Lee, S. E. MMEJ repair of double-strand breaks (director’s cut): deleted sequences and alternative endings. Trends in Genetics. 24 (11), 529-538 (2008).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
- Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnology. , (2014).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32, 279-284 (2014).
- Alemán, L. M., Doench, J., Sharp, P. a Comparison of siRNA-induced off-target RNA and protein effects. RNA. 13 (3), 385-395 (2007).
- Anderson, E. M., et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA. 14, 853-861 (2008).
- Marine, S., et al. Common seed analysis to identify off-target effects in siRNA screens. Journal of Biomolecular Screening. 17 (3), 370-378 (2012).
