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Biology

CRISPR / Cas9 के माध्यम से स्तनधारी सेल लाइनों में जीनोमिक विलोपन का सृजन

Published: January 3, 2015 doi: 10.3791/52118
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1,2,3,4
1Harvard Medical School, 2Division of Hematology/Oncology, Boston Children's Hospital, 3Department of Pediatric Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, 4Howard Hughes Medical Institute
* These authors contributed equally

Protocol

1. CRISPR डिजाइन

  1. डिजाइन sgRNAs मैन्युअल रूप से या स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऑनलाइन उपकरण 7 का उपयोग। दूर लक्ष्य साइटों (बंद लक्ष्य प्रभाव) से दरार के जोखिम को कम करने के लिए समान जीनोमिक मैच या निकट मैचों को कम से कम उस गाइड दृश्यों को पहचानने में मदद करने के लिए इन उपकरणों का उपयोग। गाइड दृश्यों जीनोमिक मान्यता स्थल पर एक "NGG" अनुक्रम ("protospacer आसन्न आकृति" या पीएएम) के अपस्ट्रीम एक 20-मेर ("protospacer अनुक्रम") से मिलकर बनता है कि सुनिश्चित करें।
    नोट: चित्रा 1 जीन और गैर-कोडिंग के तत्वों के लिए संभव विलोपन रणनीतियों का वर्णन है। एक जीन पीटा बनाने के लिए, एक्सॉनों के भीतर स्थित दो sgRNA समारोह के नुकसान के लिए भी monoallelic विलोपन क्लोन को समृद्ध करेंगे। इस mRNA के प्रतिलेख (चित्रा 1 बी) की बकवास मध्यस्थता क्षय करने के लिए अग्रणी frameshift म्यूटेशन के कारण होने की संभावना है, जो गैर-हटाए एलील 12 पर गठित indels, के उच्च आवृत्ति की वजह से है।
  2. यूज़उदाहरण के माउस में Pim1 का इरादा विलोपन (; 1 टेबल, 2A चित्रा मस मस्कुलस) के लिए गाइड।
    नोट: इस उदाहरण में, sgRNA-ए के protospacer अनुक्रम और PAM sgRNA-बी के protospacer अनुक्रम और PAM शीर्ष (वाटसन) कतरा (2A चित्रा) पर गिर जाते हैं, जबकि नीचे (क्रिक) कतरा पर गिर करने के लिए होता है। हालांकि, डीएसबी ऊपर या नीचे किनारा करने protospacer अनुक्रम / पीएएम रिश्तेदार के उन्मुखीकरण के स्वतंत्र हो जाएगा।
  3. प्रत्येक गाइड अनुक्रम के रिवर्स पूरक (आर सी) निर्धारित करते हैं। तालिका 1 तालिका 2 में पाए जाते हैं से उदाहरण Pim1 sgRNA के पूरक दृश्यों को उल्टा।
  4. क्लोनिंग और अभिव्यक्ति प्रयोजनों के लिए अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड सहित प्रत्येक गाइड और उसके संबंधित रिवर्स पूरक के लिए 24 या 25 मेर oligos प्राप्त करते हैं।
    नोट: यहाँ हम pSpCas9 (बी बी) प्लाज्मिड (pX330) (Addgene प्लाज्मिड आईडी 42,230) के उपयोग पर चर्चा की। यह प्लाज्मिड एक साथ के लिए अनुमति देता हैsgRNA और SpCas9, लेकिन की अभिव्यक्ति चयन 7 के लिए मार्कर शामिल नहीं है। अन्य निर्माणों ऐसे GFP और puromycin के रूप में चयन मार्करों, क्रमशः, या एकाधिक sgRNAs एक एकल प्लाज्मिड से व्यक्त किया जा सकता है, जिसमें निर्माणों में शामिल हैं जो pX458 (Addgene प्लाज्मिड आईडी 48,138) या pX459 (Addgene प्लाज्मिड आईडी 48,139), के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
    1. BbsI प्रतिबंध एंजाइम (3 टेबल) का उपयोग pX330 वेक्टर में क्लोनिंग के लिए गाइड की रिवर्स पूरक पहले 20 मेर गाइड अनुक्रम और "AAAC" से पहले "CACC" जोड़ें।
    2. 20-मेर के पहले की स्थिति CACC अनुक्रम के बाद एक जी न्यूक्लियोटाइड के शामिल किए जाने से बढ़ी है pX330 वेक्टर के U6 प्रमोटर से नहीं जी sgRNA अभिव्यक्ति है अगर CACC अनुक्रम के बाद और 20 मेर से पहले एक जी न्यूक्लियोटाइड जोड़ें । रिवर्स पूरक oligo के 3 'अंत में एक सी जोड़ें (जैसे, sgRNA-ए तालिका 4 में)। परिणामी oligos 25 मेर oligos होगा।
    3. केसी20-मेर (protospacer अनुक्रम) के पहले की स्थिति जी अगर कभी, एक और जी जोड़ नहीं है (उदाहरण के लिए, sgRNA-बी तालिका 4 में) और रिवर्स पूरक oligo के अंतिम स्थिति के लिए सी जोड़ नहीं है। इस मामले में, परिणामी oligos 24 मेर oligos (तालिका 4) होगा।

2. डिजाइन विलोपन स्क्रीनिंग प्राइमर

  1. ("विलोपन बैंड"; 1 आंकड़े - 2) अनुक्रम को आंतरिक प्राइमरों के डिजाइन एक सेट ("गैर-विलोपन बैंड") और नदी के ऊपर और sgRNA दरार साइटों के बहाव प्राइमरों का एक और सेट हटाए जाने के लिए। विलोपन के अभाव में, "विलोपन बैंड" अक्सर कुशलता बढ़ाना बहुत बड़ा है। आमतौर पर पता लगाने sgRNA लक्ष्य स्थल पर एक छोटा सा INDEL से प्रभावित नहीं होगा सुनिश्चित करने के लिए भविष्यवाणी की दरार साइट से प्राइमरों कम से कम 100 बीपी का उपयोग करें।
    1. (Scarring के लिए sgRNA सेल्सियस पर उत्पादित छोटे indels का विश्लेषण करने के लिए अतिरिक्त डिजाइन प्राइमरोंइरादा विलोपन के बिना leavage साइट)। आगे की एक जोड़ी का उपयोग करें और (150 के भीतर - 350 बीपी) प्रत्येक sgRNA लक्ष्य साइट flanking प्राइमरों रिवर्स scarring के लिए जांच करने के लिए sgRNA लक्ष्य साइट बढ़ाना। इस monoallelic विलोपन क्लोन में गैर-हटाए एलील चिह्नित करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
  2. छोटे विलोपन के लिए ("विलोपन बैंड" अभी भी बढ़ाना हो सकता है के रूप में), आकार विलोपन की उपस्थिति या अनुपस्थिति के साथ संगत है, तो यह निर्धारित करने के लिए एक agarose जेल पर amplicons को हल। इस दृष्टिकोण के लिए, 2.1 कदम में वर्णित आंतरिक प्राइमरों छोड़ा जा सकता है।

3. CRISPR क्लोनिंग

  1. पानी रखना और oligos phosphorylate।
    1. DDH 2 ओ में 100 माइक्रोन की एकाग्रता में resuspend oligos
    2. 24 या 25 मेर complemen रिवर्स, 1.0 μl sgRNA; (देखें कदम 1.4 100 माइक्रोन) 1.0 μl sgRNA 24 या 25 मेर oligo: एक 10 μl प्रतिक्रिया प्रत्येक गाइड के लिए मिश्रण और उसके रिवर्स पूरक तैयार करेंटी oligo;, 1.0 μl 10x टी -4 Ligation बफर, 6.5 μl DDH 2 हे, और 0.5 μl टी -4 polynucleotide kinase (पी एन) (10,000 यू / एमएल) (100 माइक्रोन कदम 1.4 देखें)।
      नोट: phosphorylated oligos बजाय आदेश दिया जा सकता है। इस दृष्टिकोण के लिए, टी -4 पी एन के उपयोग छोड़ा जाता है।
    3. निम्नलिखित मानकों का उपयोग कर एक thermocycler में पानी रखना: 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस; 95 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए और फिर 5 डिग्री सेल्सियस / मिनट में 25 डिग्री सेल्सियस नीचे रैंप।
    4. DDH 2 ओ में oligos 01:10 पतला (जैसे, 1.0 μl 1 माइक्रोन की एकाग्रता उपज के लिए oligos + 9.0 μl DDH 2 हे annealed)।
  2. एक गोल्डन गेट विधानसभा क्लोनिंग रणनीति 26 का उपयोग कर pX330 में ligate annealed oligos।
    1. एक 50 μl प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार: 100 एनजी परिपत्र pX330 वेक्टर, 1.0 μl annealed oligos (1 माइक्रोन; कदम 3.1.4 देखें), 5.0 μl प्रतिबंध एंजाइम बफर (10x), 4.0 μl (20 यू) BbsI प्रतिबंध एंजाइम (5000 यू / मिलीलीटर), 5.0 μएल एटीपी (10 मिमी), 0.25 μl (5 माइक्रोग्राम प्रति) बीएसए (20 मिलीग्राम / एमएल), 0.375 μl (750 यू) टी -4 डीएनए ligase (2,000,000 यू / एमएल), और एच 2 हे 50 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए। यदि आवश्यक हो तो यह प्रतिक्रिया एक छोटे अंतिम मात्रा से नीचे पहुंचा जा सकता है।
    2. निम्नलिखित मानकों का उपयोग कर एक thermocycler में चलाने के लिए नमूने: साइकिल 1-20 (5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस); साइकिल 21 (20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस)। ये साइकिल चालन की स्थिति एक प्रतिक्रिया (3.2 कदम देखें) में होने की पाचन और बंधाव के लिए अनुमति देते हैं।
    3. DH5α ई के 10 μl रूपांतरण (- 3.2.2 3.2.1) से प्रतिक्रिया का एक μl साथ कोलाई कोशिकाओं।
    4. 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल एम्पीसिलीन और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते के साथ एक lysogeny शोरबा (पौंड) अगर प्लेट पर प्लेट।
  3. 3 कालोनियों और एक मिनी प्रस्तुत करने का संस्कृति में टीका लगाना - 2 उठाओ।
    1. प्रत्येक नमूने के लिए मिनी प्रस्तुत करने का प्रदर्शन और एक U6 प्रमोटर आगे प्राइमर का उपयोग करते हुए प्रत्येक कॉलोनी अनुक्रम: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC। इस गिरफ्तारी हैepresentative अनुक्रमण प्राइमर; अन्य flanking प्राइमरों उपयोग किया जा सकता है।
  4. एक दृश्य-सत्यापित कॉलोनी चुनें और एक मैक्सी प्रस्तुत करने का संस्कृति में टीका लगाना। प्रस्तुत करने का आकार आवश्यक डीएनए उपज के आधार पर बढ़ाया जा सकता है।
  5. प्रत्येक CRISPR / Cas9 निर्माण के लिए मैक्सी प्रस्तुत करने का कार्य करें।

4. ब्याज की कोशिकाओं में CRISPRs Transfecting

नोट: इस प्रोटोकॉल electroporation के 27 से CRISPR / Cas9 plasmids के वितरण शामिल है। इस प्रोटोकॉल murine erythroleukemia (एमईएल) कोशिकाओं, एक निलंबन सेल लाइन के लिए विस्तार से वर्णन किया गया है। सभी चरणों में संस्कृति के माध्यम एमईएल कोशिकाओं के लिए प्रयोग किया जाता है, जो 2% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1% एल glutamine, साथ पूरक DMEM के होते हैं। हालांकि, CRISPR / Cas9 plasmids के क्षणिक अभिकर्मक सफलतापूर्वक प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए वरीय संस्कृति की स्थिति और अभिकर्मक रणनीतियों का उपयोग अनेक प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एमईएल कोशिकाओं निलंबन कोशिकाओं, पक्षपाती कोशिकाओं ज के लिए निर्देश दिए गए हैं जबकिएवेन्यू भी शामिल किया गया।

  1. CRISPR जोड़ी प्रति 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं रहे हैं सुनिश्चित करें। Electroporation के समाधान के 100 μl में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं Resuspend और electroporation क्युवेट में जोड़ें।
    1. प्रत्येक CRISPR / Cas9 निर्माण (10 माइक्रोग्राम प्रति कुल) के 5 माइक्रोग्राम प्रति जोड़ें। GFP अभिव्यक्ति निर्माण के 0.5 माइक्रोग्राम प्रति जोड़ें।
  2. एक electroporation के सिस्टम का उपयोग कर एक 2 मिमी क्युवेट में 5 मिसे के लिए 250 वोल्ट के साथ electroporate कोशिकाओं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से इस तरह के धनायनित liposome आधारित अभिकर्मक के रूप में एक और अभिकर्मक विधि का उपयोग करें। जीनोम संपादन प्रयास करने से पहले मजबूत प्लाज्मिड वितरण सुनिश्चित करने के लिए एक पत्रकार के निर्माण के साथ प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए अभिकर्मक शर्तों का अनुकूलन।
  3. इसके तत्काल बाद electroporation के बाद संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर में क्युवेट से समाधान स्थानांतरण। सेल व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए मीडिया में electroporation और समाधान के हस्तांतरण के बीच के समय को कम।
  4. 72 घंटा - 24 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस - 30 पर सेते हैं। जीनोम में वृद्धि हो सकती है 30 डिग्री सेल्सियसदक्षता संपादन, लेकिन 37 डिग्री सेल्सियस से स्वीकार्य है।

ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की छंटनी (FACS) 5. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल

  1. एक FACS ट्यूब में एक 50 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से उन्हें छान कर FACS के लिए कोशिकाओं को तैयार।
  2. FACS के CRISPR के उच्च स्तर को प्राप्त है कि कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के क्रम में GFP सकारात्मक कोशिकाओं के 3 ~ शीर्ष% प्रकार / Cas9 निर्माण करती है।
  3. व्यक्तिगत रूप से सॉर्टर का उपयोग कर 96 अच्छी तरह से दौर नीचे प्लेटों में या 96 अच्छी तरह से दौर नीचे प्लेट प्रति 30 कोशिकाओं में सीमित कमजोर पड़ने का उपयोग करके प्लेट पर छाँटे कोशिकाओं। पूर्व मज़बूती से 96 अच्छी तरह से थाली के अनुसार लगभग 30 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए इस चरण का पालन करने के लिए कमजोर पड़ने सीमित करने के लिए प्रयोग किया जाता सेल प्रकार चढ़ाना अनुकूलन।
  4. सेल संस्कृति मीडिया के प्रति अच्छी तरह से 100 μl शामिल करें।
  5. चढ़ाया नहीं गया कि शेष सॉर्ट किया गया कोशिकाओं ("थोक") के लिए, भविष्य चढ़ाना के लिए कोशिकाओं का आधा फ्रीज। स्क्रीनिंग और प्राइमर सत्यापन के लिए दूसरे आधे प्लेट (चरण 6 देखें)।
    नोट: यह पीrotocol निलंबन की कोशिकाओं के लिए है। व्यक्तिगत एकल कोशिका ली गई क्लोन उठाया और एक फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए ले जाया जा सकता है, ताकि पक्षपाती कोशिकाओं 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे की थाली में या कम एकाग्रता में एक 10 सेमी पकवान के रूप में व्यक्ति की कोशिकाओं से विकसित कर सकते हैं या तो।
  6. 7 दिन और क्लोन 7 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते करने की अनुमति - - 14 दिनों के थोक कोशिकाओं 3 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते करने की अनुमति दें। इन बार इस्तेमाल सेल लाइन का दोहरीकरण समय के आधार पर भिन्न।
    नोट: इस ऊष्मायन समय पीसीआर द्वारा इरादा हटाने के लिए जीनोमिक डीएनए (gDNA) स्क्रीनिंग के लिए पर्याप्त सेल प्रसार (चरणों 6.1 और 7.1 देखें) के लिए अनुमति देता है। एकाग्रता से अधिक है जब थोक कोशिकाओं को पर्याप्त लाख कोशिकाओं / एमएल या पक्षपाती कोशिकाओं के लिए ~ proliferated है, कोशिकाओं ~ 80% संगम तक पहुँच चुके हैं। क्लोन पर्याप्त ~ 2 मिमी व्यास के साथ एक बार macroscopically दिखाई दे proliferated है।

6. प्राइमर के प्रमाणीकरण और CRISPR के लिए स्क्रीनिंग / Cas9 की मध्यस्थता विलोपन

  1. डीएनए निष्कर्षण समाधान के 50 μl में माता-पिता और थोक सेल छर्रों resuspending द्वारा माता-पिता और थोक सॉर्ट किया गया कोशिकाओं से gDNA अलग।
    नोट: सेल नंबर की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए स्वीकार्य है, हालांकि आम तौर पर ~ लाख कोशिकाओं, डीएनए निष्कर्षण के लिए उपयोग किया जाता है। थोक सॉर्ट किया गया कोशिकाओं sgRNA-ए और sgRNA-बी के संपर्क में एक पॉलीक्लोनल आबादी से बना रहे हैं (5 कदम देखें)। निम्नलिखित पीसीआर के उद्देश्य प्राइमरों मान्य है और इरादा जीनोमिक विलोपन की उपस्थिति सत्यापित करने के लिए है।
  2. Thermocycler में नमूना चलाने के लिए और निम्नलिखित कार्यक्रम चलाने: 65 डिग्री सेल्सियस 6 मिनट के लिए, 98 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट के लिए gDNA निकालने के लिए। डीएनए एकाग्रता उपाय।
    नोट: चरणों 6.1 और 6.2 डीएनए निष्कर्षण के लिए एक कारगर तरीका अनुशंसा करते हैं, जीनोमिक डीएनए अलगाव के लिए कोई भी तरीका कदम 6.3 में पीसीआर प्रदर्शन करने में सक्षम होने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
  3. 10 _ (10 μl 2x पीसीआर मिश्रण, 0.5 μl आगे प्राइमर: निम्नलिखित घटकों के साथ एक 20 μl पीसीआर इकट्ठे6; एम), 0.5 μl रिवर्स प्राइमर (10 माइक्रोन), 50-100 एनजी gDNA, और 20 μl अप करने के लिए एच 2 हे। ऊपर चरण 2 में बनाया गया प्राइमरों का प्रयोग करें। अलग प्रतिक्रियाओं में "गैर-विलोपन बैंड" और "विलोपन बैंड" के लिए पीसीआर आचरण।
    नोट: कई पीसीआर कदम 6.3 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. 10 मिनट के लिए 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस (30 सेकंड, एक मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस) के 35 चक्र, और 72 डिग्री सेल्सियस: निम्नलिखित मानकों का उपयोग कर एक thermocycler में चलाने के लिए नमूने । थोक सॉर्ट किया गया कोशिकाओं का परीक्षण के आधार पर बनाया प्रत्येक प्राइमर जोड़ी के लिए पीसीआर स्थिति अनुकूलन।
  4. 1x Tris- एसीटेट EDTA (TAE) बफर का उपयोग 10 वी / सेमी 2% agarose जेल पर नमूने चलाएँ।
  5. गैर-विलोपन और विलोपन बैंड (चित्रा 2) की उपस्थिति / अनुपस्थिति के लिए नमूनों की जांच। बहुसंकेतन "विलोपन" और "गैर-विलोपन" एक ही प्रतिक्रिया में पीसीआर प्राइमर जोड़े पर विचार करें। बहुसंकेतन का अनुकूलनएक पॉलीक्लोनल आबादी में अलग-अलग क्लोन स्क्रीनिंग से पहले (यानी, थोक कोशिकाओं को हल)। यह विलोपन और गैर-विलोपन amplicons आसानी बहुसंकेतन के लिए एक agarose जेल पर हल किया जाना है कि महत्वपूर्ण है।

7. स्क्रीनिंग CRISPR / विलोपन और क्लोन चुनाव के लिए Cas9 क्लोन

  1. निलंबन कोशिकाओं के लिए, जो पहले से ही 150 μl के अंतिम मात्रा के लिए अच्छी तरह से प्रति 50 μl सेल संस्कृति मीडिया में शामिल है कि एक एकल 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए सभी क्लोन हस्तांतरण। यह एक मल्टीचैनल पिपेट चरण 7 में चरणों के शेष के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देकर स्क्रीनिंग की सुविधा।
    1. प्रत्येक से स्थानांतरण 50 μl अच्छी तरह से एक multichannel पिपेट का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली करने के लिए (प्रत्येक कुएं में 100 μl छोड़कर)।
    2. 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र पीसीआर थाली और एक सिंक पर पीसीआर थाली flicking द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। अच्छी तरह से और resuspend प्रति डीएनए निष्कर्षण समाधान के 50 μl जोड़ें। निलंबन की कोशिकाओं के लिए 7.3 कदम करने के लिए आगे बढ़ें।
    3. पक्षपाती कोशिकाओं, महाप्राण मीडिया के लिए। एक क्लोन वर्तमान के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.05% trypsin-EDTA के 20 μl जोड़ें।
      1. मीडिया के 200 μl में Resuspend कोशिकाओं। पिपेट कोशिकाओं को अलग करने के लिए मिश्रण।
      2. दो अलग-अलग 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटों में प्रत्येक μl प्लेट 100। क्लोन बढ़ने और विलोपन के लिए प्रत्येक क्लोन स्क्रीन करने के लिए अन्य प्लेट का उपयोग करने के लिए अनुमति देने के लिए एक थाली रखें।
      3. 200 μl की कुल मात्रा के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक अतिरिक्त 100 μl जोड़ें। कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए 72 घंटा - 24 रुको।
      4. महाप्राण मीडिया। 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली करने के लिए अच्छी तरह से, Resuspend और हस्तांतरण प्रति 50 μl डीएनए निष्कर्षण समाधान जोड़ें। 7.3 कदम करने के लिए आगे बढ़ें।
    4. क्लोन से gDNA निकालें। Thermocycler में नमूना चलाएँ: 6 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 2 मिनट gDNA निकालने के लिए 98 डिग्री सेल्सियस।
    5. पीसीआर प्राइमरों और थोक कोशिकाओं पर अनुकूलित प्रतिक्रिया की स्थिति में एक ही उपयोग करते हुए प्रत्येक क्लोन स्क्रीन (चरण 6 देखें)।
    6. क्लोन IDEN का चयन करेंवांछित विलोपन के साथ tified और विकास के लिए बड़ा थाली या कुप्पी के लिए कदम।

    Biallelic हटाने का क्लोन 8. मान्यकरण

    1. प्राप्त क्लोन विशेषताएँ और एक सफल पीटकर को मान्य करने के लिए, डीएनए में क्लोन के रूप में अच्छी तरह से शाही सेना और / या प्रोटीन के स्तर का मूल्यांकन।
      1. एक प्लाज्मिड वेक्टर में (एक पीसीआर क्लोनिंग किट के साथ जैसे,) amplicons, डीएनए का मूल्यांकन एक प्रूफरीडिंग पोलीमर्स साथ biallelic विलोपन क्लोन से हटाए जाने के बैंड बढ़ाना और क्लोन करने के लिए। DH5α ई में प्लाज्मिड रूपांतरण प्रासंगिक एंटीबायोटिक के साथ लेग अगर प्लेटों पर कोलाई कोशिकाओं और थाली। कई कालोनियों, मिनी प्रस्तुत करने का हर एक का चयन करें, और प्रत्येक विलोपन एलील 28 चिह्नित करने के लिए सेंगर अनुक्रमण के लिए प्रत्येक क्लोन विषय - 30। प्रारंभिक स्क्रीन के बाद हटाने के लिए पीसीआर परीक्षण दोहरा सही क्लोन चुना है और परिणामों के reproducibility किया गया था कि यह सुनिश्चित करता है।
      2. शाही सेना का मूल्यांकन करने के लिए, जनरल के लिए आर टी-qPCR के लिए प्रदर्शनप्रासंगिक जीन 30,31 के ई अभिव्यक्ति।
      3. प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए, प्रासंगिक प्रोटीन 33 के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर एक immunoblot प्रदर्शन करते हैं।

Representative Results

इस प्रयोग के लक्ष्य एमईएल कोशिकाओं में Pim1 का विलोपन था। कई गैर अतिव्यापी sgRNA जोड़े (यानी, स्वतंत्र protospacer दृश्यों) का प्रयोग बंद लक्ष्य प्रभाव (चित्रा 1 ए) के लिए नियंत्रित करने में मदद कर सकते हैं। एक सुसंगत phenotype के कई स्वतंत्र protospacer दृश्यों द्वारा साझा एक आम बंद लक्ष्य प्रभाव के लिए विरोध के रूप में एक पर लक्ष्य प्रभाव से परिणाम के लिए और अधिक होने की संभावना होगी। प्रत्येक जोड़ी एक अद्वितीय विलोपन ब्रेकपाइंट के उत्पादन के लिए नेतृत्व करेंगे। (यानी, एन ~ 150 बीपी से भी कम) करीब एक साथ, एक ही स्क्रीनिंग प्राइमरों sgRNAs के प्रत्येक सेट के द्वारा उत्पादित विलोपन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जीनोमिक विलोपन जीन (चित्रा 1 बी) के संबंध में विभिन्न स्थानों में sgRNA जोड़े का उपयोग करके जीन को बाधित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, sgRNA जोड़ी पूरे जीन शरीर के विलोपन के लिए एक जीन पार्श्व सकता है; जोड़ी frameshift indels बनाने की क्षमता के साथ, दो एक्सॉनों के भीतर स्थित हो सकता है, भले ही एक या दोनों allelतों हटाया नहीं गया था; या जोड़ी एक विशेष isoform के विघटन की अनुमति के लिए एक विशिष्ट एक्सॉन पार्श्व सकता है।

Pim1 के लिए इस्तेमाल किया हटाए जाने की रणनीति पूरे जीन शरीर, एक 8 केबी विलोपन (चित्रा 2) को हटाने के लिए sgRNAs flanking डिजाइन करने के लिए किया गया था। इस रणनीति के कारण Pim1 जीन की अपेक्षाकृत छोटे आकार के हिस्से में चुना गया था। इस उदाहरण नीचे (क्रिक) कतरा पर शीर्ष (वाटसन) कतरा और एक पीएएम पर एक पीएएम (हरा) से पता चलता है; हालांकि, डीएसबी ऊपर या नीचे किनारा करने के लिए पीएएम अनुक्रम स्थानीयकरण से स्वतंत्र है। sgRNA जोड़े नीचे किनारा पर, शीर्ष किनारा पर दोनों दोनों पीएएम दृश्यों है, या प्रत्येक का एक कर सकते हैं। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, दो sgRNA, डिजाइन pX330 अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन है, और एक GFP रिपोर्टर (2A चित्रा) के साथ-साथ electroporation द्वारा एमईएल कोशिकाओं को दिया गया। GFP + कोशिकाओं के शीर्ष 3% दो दिनों के बाद electroporation हल और कमजोर पड़ने सीमित पर clonally चढ़ाया गया। स्क्रीनचित्रा 2 में दिखाया गया है आईएनजी प्राइमरों चरण 2 में वर्णित के रूप में बनाया गया है और कर रहे थे। पीसीआर स्थितियों पैतृक एमईएल कोशिकाओं से और "थोक" हल कोशिकाओं से अलग gDNA का उपयोग कर अनुकूलित किया गया।

10 दिनों के चढ़ाना के बाद, gDNA सभी क्लोन से अलग किया गया था और गैर-विलोपन (एनडी) और विलोपन (डी) amplicons के पैटर्न के अनुसार गैर-विलोपन, monoallelic और biallelic विलोपन क्लोन की पहचान की है, जो पीसीआर के माध्यम से हटाए जाने, के लिए जांच (चित्रा 3) । गैर-विलोपन क्लोन गैर-विलोपन amplicon की उपस्थिति और विलोपन amplicon के अभाव होने के रूप में पहचान की गई। Monoallelic क्लोन गैर-विलोपन और विलोपन amplicons दोनों की उपस्थिति होने के रूप में पहचान की गई। Biallelic क्लोन गैर-विलोपन amplicon के अभाव और विलोपन amplicon की उपस्थिति होने के रूप में पहचान की गई। इस विलोपन के लिए, 400 क्लोन जांच की गई 126 monoallelic विलोपन क्लोन और 32 biallelic delet जो पहचान आयन क्लोन (यह विलोपन आवृत्ति विलोपन आकार 12 के साथ बदलता रहता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है)। Biallelic विलोपन क्लोन चयनित और मीडिया के 8 मिलीलीटर के साथ बोतल के लिए ले जाया गया। विस्तार के लिए 5 दिन की इजाजत देने के बाद, प्रत्येक क्लोन biallelic विलोपन और विलोपन amplicons सटीक विलोपन (चित्रा 2B) की पहचान करने के लिए सेंगर अनुक्रमण के अधीन थे पुष्टि करने के लिए gDNA की पीसीआर द्वारा पुनर्परीक्षण किया गया था। विलोपन amplicons के भीतर विविधता अपूर्ण INDEL के गठन NHEJ मरम्मत को दर्शाता है। मामलों के बहुमत में indels खुला monoallelelic विलोपन क्लोन में गैर-विलोपन एलील की अनुक्रमण, monoallelic और biallelic विलोपन क्लोन दोनों आवश्यक हैं जहां अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, जो भी गैर-हटाए एलील अक्सर CRISPR / Cas9 द्वारा संपादित किया है कि प्रदर्शन । शाही सेना biallelic विलोपन क्लोन से अलग और (चित्रा 4) Pim1 अभिव्यक्ति की हानि पुष्टि करने के लिए आर टी-qPCR के द्वारा विश्लेषण किया गया था।

तरीके "> चित्रा 1
संभव विलोपन रणनीतियों के चित्रा 1. योजनाबद्ध। (ए) जीनोमिक विलोपन के लिए दो उदाहरण sgRNA जोड़े (क्रमशः, काले और नारंगी में दिखाया गया है)। नीले तीर गैर-विलोपन amplicon पता लगाने के लिए प्राइमरों से संकेत मिलता है और लाल तीर विलोपन amplicon पता लगाने के लिए प्राइमरों संकेत मिलता है। sgRNA 17 पदों और 18 पर लाल और नीले रंग में डाला जाता है sgRNA साइटों-एक 1 / ए 2 और पदों पर 17 के बीच की भविष्यवाणी की Cas9 दरार का संकेत एक लाल रेखा के साथ sgRNA साइटों बी 1 / बी 2 पर बैंगनी और नारंगी में डाला जाता है और 18 (बी) के CRISPR निर्देशित चोली खड़ी काले रंग की लाइनों के रूप में दिखाया जाता है। नीले तीर गैर-विलोपन amplicon पता लगाने के लिए प्राइमरों से संकेत मिलता है और लाल तीर विलोपन amplicon पता लगाने के लिए प्राइमरों संकेत मिलता है। देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण।

चित्रा 2
चित्रा उत्पादन और अनुक्रमण विलोपन और गैर-विलोपन एलील सहित Pim1 का विलोपन, पता लगाने के लिए 2. रणनीति। पीसीआर आधारित स्क्रीनिंग रणनीति की (ए) योजनाबद्ध Pim1 विलोपन क्लोन की पहचान करने के लिए। एक प्राइमर जोड़ी विलोपन (नीले तीर) और एक प्राइमर जोड़ी के लिए आंतरिक स्थित है विलोपन (लाल तीर) के लिए बाहरी स्थानीय है। sgRNA दृश्यों (protospacer दृश्यों) बैंगनी रंग में दिखाया गया है। खड़ी लाल लाइनों के पदों पर 17 और sgRNA अनुक्रम में से 18 के बीच की भविष्यवाणी की Cas9 दरार का संकेत मिलता है। (बी) सेंगर अनुक्रमण sgRNA मान्यता स्थल पर INDEL गठन का पता चलता है। sgRNA दृश्यों हरे रंग में बैंगनी और PAM दृश्यों में दिखाया गया है। विलोपन घटनाओं श कर रहे हैंपानी का छींटा के निशान और सम्मिलन के एक बराबर संख्या से खुद को नीले रंग में डाला जाता है। कार्यक्षेत्र लाल लाइनों के पदों पर 17 और sgRNA के 18 के बीच।, दरार साइट की भविष्यवाणी संकेत मिलता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3। गैर-विलोपन, monoallelic, और biallelic क्लोन की पहचान के प्रतिनिधि जेल। प्रत्येक क्लोन के लिए, बाईं लेन गैर-विलोपन amplicon (नीले रंग में "एन डी") और सही लेन का प्रतिनिधित्व करता है लाल रंग में विलोपन amplicon ("डी" का प्रतिनिधित्व करता है )। व्यक्तिगत क्लोन बिंदीदार रेखा से अलग हो रहे हैं। तीन monoallelic विलोपन क्लोन क्लोन 5, 6 हैं, और अनुक्रमण डेटा के रूप में देखा 2. तीन biallelic विलोपन क्लोन, ग के लिए विलोपन बैंड क्लोन 15, 17, और 13 हैं लोन 13 विलोपन जंक्शन पर बड़ा विलोपन की वजह से एक छोटे आकार की है।

चित्रा 4
Biallelic विलोपन क्लोन में Pim1 अभिव्यक्ति की चित्रा 4 में कमी। Pim1 अभिव्यक्ति आर टी-qPCR के द्वारा दो biallelic विलोपन क्लोन के लिए गणना की गई। ΔCt विधि - डेटा 2 का उपयोग कर GAPDH के लिए सामान्यीकृत किया गया था।

Protospacer अनुक्रम
sgRNA-ए 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 '
sgRNA-बी 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 '

टेबल Pim1 का विलोपन के लिए दो sgRNA के लिए 1. 20 मेर protospacer दृश्यों।

543 "> Protospacer अनुक्रम के रिवर्स पूरक sgRNA-ए-आर.सी. 5'-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-बी आर सी 5'-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 '

तालिका 1 से दो sgRNA के लिए protospacer दृश्यों की तालिका 2 रिवर्स पूरक।

दृश्यों
sgRNA-ए 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 '
sgRNA-ए-आर.सी. 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 '
sgRNA-बी 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 '
sgRNA-बी आर सी 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 '

तालिका 3. Protospacer दृश्यों और उनके रिवर्स "CACC" और "AAAC" के साथ पूरक BbsI प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग कर pX330 वेक्टर में क्लोनिंग के लिए जोड़ा गया।

दृश्यों
sgRNA-ए 5'- CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 '
sgRNA-ए-आर.सी. 5'- AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 '
sgRNA-बी 5'- CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 '
sgRNA-बी आर सी 5'- AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 '

PX330 वेक्टर के U6 प्रमोटर से तालिका 4 sgRNA अभिव्यक्ति CACC अनुक्रम के बाद और पहले एक जी न्यूक्लियोटाइड के अलावा द्वारा बढ़ाया है20-मेर। एक अतिरिक्त जी न्यूक्लियोटाइड के अलावा रिवर्स पूरक oligo के 3 'के अंत (जैसे, sgRNA-ए) में एक सी न्यूक्लियोटाइड के अलावा आवश्यकता है। 20-मेर (protospacer अनुक्रम) के पहले की स्थिति में पहले से ही एक जी न्यूक्लियोटाइड है हालांकि, अगर एक और जी जोड़ने के लिए कोई जरूरत नहीं है (उदाहरण के लिए, sgRNA-बी) और रिवर्स पूरक की अंतिम स्थिति के लिए सी जोड़ने के लिए कोई ज़रूरत नहीं oligo।

Discussion

CRISPR / Cas9 प्रणाली आकारों की एक श्रेणी के जीनोमिक विलोपन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम हटाए जाने की आवृत्ति इरादा विलोपन आकार के संबंध में विपरीत रूप से भिन्न होता है देखा है कि हालांकि, हम नियमित रूप से कई biallelic नष्ट कर दिया क्लोन उपज 100 KB अप करने के लिए अप करने के लिए 1 एमबी का विलोपन, और विलोपन ठीक करने में सक्षम किया गया है। हम एक सेल लाइन में क्रमिक रूप से शुरू करने विलोपन की दक्षता में कोई नुकसान नहीं मनाया है। इस रणनीति के कई जीन और तत्वों की मिश्रित विलोपन के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। biallelic विलोपन क्लोन प्राप्त करने की प्रक्रिया biallelic विलोपन 12 के साथ क्लोन की वांछित संख्या प्राप्त करने के लिए हटाए जाने के आकार के आधार पर जांच किए जाने की आवश्यकता क्लोन की न्यूनतम संख्या का आकलन करके तेजी लाई जा सकती है।

संभाव्य वितरण में biallelic विलोपन के अभाव के साथ monoallelic विलोपन प्राप्त करने की क्षमता समारोह का पूरा नुकसान के साथ जुड़े सेल मारक का संकेत मिलता है। कम frequency या अनुपस्थित विलोपन गरीब अभिकर्मक, अक्षम sgRNAs या कारण (एक सकारात्मक नियंत्रण की कमी के कारण हटाए जाने के लिए स्क्रीन के लिए पीसीआर प्राइमरों मान्य करने के लिए) अकुशल पीसीआर स्क्रीनिंग प्राइमरों सहित परिदृश्यों की एक संख्या को प्रतिबिंबित कर सके। GFP + कोशिकाओं, अभिकर्मक दक्षता (कदम 5.2 देखें) के लिए एक किराए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि GFP + कोशिकाओं में कमी होने की संभावना गरीब अभिकर्मक को दर्शाता है और जिसके परिणामस्वरूप एक विलोपन दक्षता की कमी हुई। अक्षम sgRNA के लिए नियंत्रण में मदद कर सकते हैं स्वतंत्र स्क्रीनिंग प्राइमरों के साथ दो अलग अलग sgRNA जोड़े का प्रयोग और पीसीआर प्राइमरों स्क्रीनिंग और biallelic विलोपन क्लोन प्राप्त करने की संभावना को अधिकतम। GFP + कोशिकाओं के लिए सेल छँटाई विलोपन alleles के लिए समृद्ध करती है। इस कदम से हटाया जा सकता है, चूक की संभावना monoallelic या biallelic विलोपन के साथ उन लोगों की पहचान करने के लिए और अधिक क्लोन स्क्रीनिंग की जरूरत होगी। अभिकर्मक दक्षता अनुकूलित किया जा सकता है कि डिग्री करने के लिए, हम जीनोम संपादन दक्षता बढ़ाने की उम्मीद है।

(चित्रा 2B) की साइट पर विलोपन - प्रमुख परिणाम छोटे ~ 1 है। अक्सर इन alleles के microhomology आधारित मरम्मत 34,35 का नतीजा हो दिखाई देते हैं। यह हम वर्णन पीसीआर आधारित पता लगाने की रणनीति बड़ा या अधिक जटिल सम्मिलन, विलोपन, व्युत्क्रमों, या rearrangements की पहचान नहीं होगा कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इन घटनाओं में कम आम हैं, यद्यपि हम न तो विलोपन और न ही गैर-विलोपन amplicons पता लगाया जा सकता है जिसमें क्लोन मनाया, और आगे की जांच पर इन अधिक जटिल परिणामों को प्रतिबिंबित किया है।

हम व्यापक CRISPR / monoallelic और गैर-विलोपन क्लोन से गैर-विलोपन alleles की "scarring के" Cas9 की मध्यस्थता मनाया है (चित्रा 2B देखें)। ये "निशान" से मिलकर बनता हैइच्छित विलोपन के बिना sgRNA दरार स्थल पर उत्पादन छोटे indels (यानी, sgRNAs ए और बी के बीच बीच के खंड का विलोपन)। ये निशान अक्सर sgRNA द्वारा लक्ष्य मान्यता में व्यवधान डाला। इसलिए हम पहले से ही sgRNAs का उपयोग कर sgRNAs के संपर्क में कोशिकाओं में alleles के retargeting में सावधानी से आग्रह करता हूं। अद्वितीय sgRNA का उपयोग होगा एक और अधिक सफल पुनर्लक्ष्यीकरण रणनीति पहले "जख्म" मान्यता साइटों से अलग दृश्यों। मामलों में sgRNAs की एक जोड़ी (चित्रा 1 बी, नीचे), frameshift एलील भी विलोपन के अभाव में उत्पादन किया जा सकता है exonic दृश्यों को पहचानता है। इसलिए, monoallelic विलोपन क्लोन कारण एलील 12 गैर नष्ट कर दिया पर frameshift म्यूटेशन के उच्च आवृत्ति को नुकसान के समारोह के लिए समृद्ध किया जा सकता है।

38 - CRISPR / Cas9 प्रणाली के साथ एक चिंता का विषय बंद लक्ष्य प्रभाव, यानी, अनायास ही साइटों 36 पर जीनोमिक संशोधन है। आरecent रिपोर्टों 17 के साथ छोटे गाइड RNAs सुझाव दिया है कि - 19 न्यूक्लियोटाइड CRISPR की आवृत्ति को कम कर सकते हैं / बंद लक्ष्य प्रभाव 39 Cas9 आधारित। इसके अतिरिक्त, एक nickase साथ लक्ष्य साइट प्रति दो गाइडों का उपयोग करते हुए एक डबल Nicking रणनीति बंद लक्ष्य प्रभाव सात जबकि कम से कम DSBs बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, आरएनएआई के लिए इस्तेमाल किया रणनीति के अनुरूप है, हम गैर अतिव्यापी protospacer दृश्यों के साथ sgRNAs के विभिन्न जोड़े बंद लक्ष्य एक संभावित विरोध के रूप में मनाया फेनोटाइप पर लक्ष्य CRISPR / Cas9 संशोधन का परिणाम है कि प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सुझाव है कि प्रभाव। एक सुविधाजनक दृष्टिकोण स्क्रीनिंग प्राइमरों (चरण 2 देखें) का एक सेट एकाधिक sgRNA जोड़े (चित्रा 1 ए) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि कम से कम दो आसन्न लेकिन गैर अतिव्यापी sgRNA जोड़े डिजाइन करने के लिए किया जाएगा। इसके अलावा, लापता अनुक्रम और / या बाधित जीन reintroducing द्वारा एक विलोपन सेल लाइन के पूरक के बीच एक कारण रिश्ते को पुष्ट कर सकते हैंएक दिया जीनोमिक विलोपन और फेनोटाइप।

सेलुलर मॉडल सिस्टम के साथ काम कर रहे जीव के लिए, आरएनएआई कार्यात्मक जीनोमिक्स के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व किया है। 42 - हालांकि, इस दृष्टिकोण की सीमाओं लक्ष्य mRNA प्रतिलेख के स्तर में अधूरा कमी, एक ही जीन को लक्षित स्वतंत्र अभिकर्मकों के प्रभाव की विविधता, और बीज आधारित और गैर-बीज प्रभाव 40 सहित ज्ञात बंद लक्ष्य प्रभाव को शामिल किया है। जीनोम संपादन रणनीतियों इन चिंताओं में से कई को संबोधित करने का वादा और भावी आनुवंशिक गड़बड़ी 8,36,37 के लिए एक रोमांचक, पूरक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, जीनोम संपादन आरएनएआई के द्वारा ही संभव है और पारंपरिक लक्ष्य-निर्धारण से चुनौतीपूर्ण नहीं एक तरह से आनुवंशिक तत्वों गैर-कोडिंग 25 दृष्टिकोण के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। हम उत्पादन और नुकसान के समारोह एलील चिह्नित करने के लिए एक मजबूत और विशिष्ट पद्धति के रूप में CRISPR / Cas9 द्वारा जीनोमिक विलोपन की पीढ़ी के लिए प्रोत्साहित करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T4 DNA ligase (with associated ligation buffer) New England Biolabs M0202T
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
BSA, molecular biology grade New England Biolabs B9000S
BbsI restriction enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) New England Biolabs R0539S
pSpCas9(BB) (pX330) Addgene 42230
S.O.C. medium Life Technologies 15544-034
BTX ECM 830 Harvard Apparatus 45-0052
BTX solution and 2 mm cuvettes Harvard Apparatus 45-0803
pmaxGFP plasmid Lonza VPA-1003
QuickExtract DNA Extraction Solution Epicentre QE09050
HotStarTaq PCR Master Mix Kit Qiagen 203443
Zero Blunt PCR Cloning Kit Life Technologies K2700-20
Plasmid Addgene 42230

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 83 CRISPR Cas9 जीनोम इंजीनियरिंग जीन नॉकआउट जीनोमिक विलोपन जीन विनियमन
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Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin,… More

Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118, doi:10.3791/52118 (2015).

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