Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generasjon av Genomiske slettinger i pattedyrcellelinjer via CRISPR / Cas9

Published: January 3, 2015 doi: 10.3791/52118
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1,2,3,4
1Harvard Medical School, 2Division of Hematology/Oncology, Boston Children's Hospital, 3Department of Pediatric Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, 4Howard Hughes Medical Institute
* These authors contributed equally

Protocol

1. CRISPR Design

  1. Design sgRNAs manuelt eller ved hjelp av fritt tilgjengelige elektroniske verktøy 7. Bruk disse verktøyene for å bidra til å identifisere guide sekvenser som minimerer identiske genomiske fyrstikker eller nesten kamper for å redusere risikoen for spalting unna målwebområder (off-target effekter). Sørg for at styre sekvenser består av en 20-mer ("protospacer sekvens") oppstrøms av en "NGG" sekvens ("protospacer tilstøtende motiv" eller PAM) ved genomisk anerkjennelse nettstedet.
    MERK: Figur 1 beskriver mulige sletting strategier for gener og ikke-koding elementer. For å skape et gen knockout, vil to sgRNA ligger innenfor exoner berike selv monoallelic sletting kloner for tap av funksjon. Dette er på grunn av den høye frekvensen av indels dannet på ikke-slettede lene 12, som er egnet til å føre rammeskiftmutasjoner som fører til nonsense-mediert nedbrytning av mRNA transkript (figur 1B).
  2. Brukeksempel guider for den tiltenkte sletting av Pim1 i mus (Mus musculus, Tabell 1, Figur 2A).
    MERK: I dette eksemplet sgRNA-A protospacer sekvens og PAM tilfeldigvis falle på bunnen (Crick) strand mens sgRNA-B protospacer sekvens og PAM falle på toppen (Watson) tråd (Figur 2A). Imidlertid vil DSB skje uavhengig av orientering av protospacer sekvensen / PAM i forhold til den øvre eller nedre tråd.
  3. Bestem den omvendte komplement (rc) i hver styresekvens. Eksempel reverse komplement sekvenser av Pim1 sgRNA fra tabell 1 er funnet i tabell 2.
  4. Skaff 24- eller 25-mer oligos for hver guide og tilhørende revers komplement inkludert ekstra nukleotider for kloning og uttrykksmessig.
    MERK: Her diskuterer vi bruken av pSpCas9 (BB) plasmid (pX330) (Addgene plasmid ID 42230). Dette plasmid muliggjør den samtidigeekspresjon av sgRNA og SpCas9, men ikke inneholder markører for seleksjon 7. Andre konstruksjoner kan anvendes, for eksempel pX458 (Addgene plasmid ID 48138) eller pX459 (Addgene plasmid ID 48139), som omfatter GFP og puromycin som seleksjonsmarkører, respektivt, eller konstruksjoner hvor flere sgRNAs kan uttrykkes fra en enkelt plasmid.
    1. Legg til "CACC" før 20-mer anvisning sekvens og "AAAC" før det guide revers komplement for kloning inn i pX330 vektor ved hjelp BbsI begrensning enzym (Tabell 3).
    2. Legg til en G nukleotid etter CACC sekvens og før den 20-mer hvis den første stilling av 20-mer er ikke G. sgRNA ekspresjon fra U6 promoteren til pX330 vektoren er forbedret ved innlemmelse av en G nukleotid etter CACC sekvensen . Legg til en C ved 3'-enden av den omvendte komplement oligo (f.eks sgRNA-A i tabell 4). De resulterende oligos ville være 25-mer oligos.
    3. Hvordannoensinne, hvis den første plasseringen av 20-mer (protospacer sekvens) er G, ikke legg en annen G (for eksempel i tabell 4-B sgRNA) og ikke legge C til den endelige plasseringen av revers komplement oligo. I dette tilfelle, ville de resulterende oligoer være 24-mer oligonukleotider (tabell 4).

2. Design Sletting Screening Primere

  1. Design ett sett av primere indre til sekvensen som skal slettes ("ikke-sletting band") og et annet sett av primere oppstrøms og nedstrøms av de sgRNA spaltningsseter ("sletting bånd"; Figurene 1 - 2). I fravær av delesjon, er "sletting band" ofte for store til effektivt å amplifisere. Vanligvis bruker primere minst 100 bp fra spådd spaltingssetet å sikre påvisning ville ikke bli påvirket av en liten Indel på sgRNA målområde.
    1. Designe flere primere for å analysere for arrdannelse (små indels produsert på sgRNA cleavage nettstedet uten den tiltenkte sletting). Bruke et par av forover og bakover primere flankerer hver sgRNA målområde (innen 150-350 bp) for å forsterke den sgRNA målområde for å undersøke for arrdannelse. Dette kan være nyttig for å karakterisere de ikke-slettede allelet i monoallelic sletting kloner.
  2. For små delesjoner (som "sletting band" kan fortsatt amplifisere), løse amplikonene på en agarosegel for å bestemme hvis størrelse er i overensstemmelse med nærværet eller fraværet av slettingen. For denne tilnærmingen, kan den interne primere som er beskrevet i trinn 2.1 utelates.

3. CRISPR Cloning

  1. Gløder og phosphorylate oligos.
    1. Resuspender oligoer ved en konsentrasjon på 100 uM i DDH 2 O.
    2. Forberede en 10 pl reaksjonsmiks for hver guide og dens revers komplement: 1,0 mL sgRNA 24- eller 25-mer oligo (100 mikrometer, se trinn 1.4), 1,0 mL sgRNA 24- eller 25-mer reversere complement oligo (100 pM; se trinn 1.4), 1,0 ul 10 x T4-ligeringsbuffer, 6,5 ul DDH 2 O, og 0,5 pl T4-polynukleotidkinase (PNK) (10 000 U / ml).
      MERK: fosforylerte oligos kan bestilles i stedet. For denne metode er bruk av T4-PNK utelatt.
    3. Glødning i en termosykler ved hjelp av følgende parametere: 37 ° C i 30 min; 95 ° C i 5 min og deretter rampe ned til 25 ° C ved 5 ° C / min.
    4. Fortynn 1:10 i oligoer DDH 2 O (for eksempel 1,0 mL glødet oligoer + 9,0 ul DDH 2 O for å gi en konsentrasjon på 1 pM).
  2. Ligate glødet oligos inn pX330 ved hjelp av en Golden Gate montering kloning strategi 26.
    1. Tilbered en 50 pl reaksjonsblanding: 100 ng sirkulær pX330 vektor, 1,0 ul glødet oligoer (1 uM; se trinn 3.1.4), 5,0 ul restriksjonsenzymbuffer (10x), 4,0 ul (20 U) BbsI restriksjonsenzym (5000 U / ml), 5,0 μl ATP (10 mM), 0,25 ul (5 ug) BSA (20 mg / ml), 0,375 mL (750 U) T4 DNA-ligase (2 millioner U / ml) og H2O til sluttvolum på 50 ul. Denne reaksjonen kan bli skalert ned til et sluttvolum mindre hvis det er nødvendig.
    2. Kjøre prøver i en termosykler ved hjelp av følgende parametere: 1 til 20 sykluser (37 ° C i 5 min, 20 ° C i 5 minutter); Syklus 21 (80 ° C i 20 min). Disse sykkelforholdene tillater for fordøyelsen og ligering å oppstå i en reaksjon (se trinn 3.2).
    3. Transform 10 mL av DH5a E. coli-celler med 1 pl av reaksjonen fra (3.2.1 - 3.2.2).
    4. Plate på en lysogeni buljong (LB) agar-plate med 100 ug / ml ampicillin og inkuberes O / N ved 37 ° C.
  3. Plukk 2-3 kolonier og vaksinere inn i en mini-prep kultur.
    1. Utføre mini-prep for hver prøve og sekvensere hver koloni ved hjelp av en U6 promoter fremover primer: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Dette er arepresentative sekvense grunning; andre flankerende primere kan anvendes.
  4. Velg en sekvens-verifisert koloni og vaksinere i en maxi-prep kultur. Prep størrelse kan bli skalert basert på den ønskede DNA-utbytte.
  5. Utføre maxi-prep for hver CRISPR / Cas9 konstruere.

4. trans CRISPRs inn Celler av interesse

MERK: Denne protokollen innebærer levering av CRISPR / Cas9 plasmider ved elektroporering 27. Denne protokollen er beskrevet i detalj for murine erytroleukemi (MEL) celler, en suspensjonscellelinje. Kulturmediet i alle trinn består av DMEM supplert med 2% penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin, som er brukt for MEL-celler. Imidlertid kan transient transfeksjon av CRISPR / Cas9 plasmider være vellykket tilpasset mange celletyper ved hjelp av foretrukne kulturforhold og transfeksjonsteknologier strategier for hver celletype. Mens MEL celler er suspensjonsceller, instruksjoner for heft celler have også tatt med.

  1. Sørg for at det er 2 x 10 6 celler per CRISPR pair. Resuspender 2 x 10 6 celler i 100 ul av elektroporering løsningen og tilsett til elektroporering kyvette.
    1. Tilsett 5 ug av hvert CRISPR / Cas9 konstruksjon (10 ug totalt). Tilsett 0,5 mikrogram av GFP uttrykk konstruere.
  2. Electroporate celler med 250 volt for 5 msek i en 2 mm kyvette ved hjelp av en elektroporering system.
    MERK: Alternativt kan du bruke en annen transfeksjonsmetoden som kationiske liposom-baserte transfeksjon. Optimalisere transfeksjonsteknologier betingelser for hver cellelinje med en reporter konstruksjon for å sikre robust plasmid levering før du prøver genom redigering.
  3. Umiddelbart overføre løsning fra kuvetten inn en ml dyrkningsmedier etter elektroporering. Minimere tiden mellom elektroporering og overføring av oppløsningen i mediet for å øke cellenes levedyktighet.
  4. Inkuber ved 30 til 37 ° C i 24 - 72 timer. 30 ° C kan forsterke genomredigering effektivitet, men 37 ° C er akseptable.

5. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) fra transfekterte celler

  1. Forbered celler for FACS ved å filtrere dem gjennom et 50 um filter inn i en FACS-rør.
  2. FACS sortere toppen ~ 3% av GFP positive celler for å berike for celler som fikk høye nivåer av CRISPR / Cas9 konstruerer.
  3. Tallerken sorterte cellene individuelt i 96-brønners rundbunnede plater ved hjelp av sortereren eller ved hjelp av begrenset fortynning i 30 celler per 96-brønns rundbunnet plate. Optimalisere plating celletypen som brukes ved begrensende fortynning før du utfører dette trinnet å pålitelig få ca 30 celler per 96-brønns plate.
  4. Inkluderer 100 mikroliter per brønn av cellekulturmedier.
  5. For de gjenværende sorterte cellene ("bulk") som ikke ble belagt, fryse halvparten av cellene for fremtidig plettering. Plate den andre halvparten for screening og primer validering (se trinn 6).
    MERK: Dette protocol er for suspensjonsceller. Adherente celler kan vokse enten som individuelle celler i 96-brønns flatbunnet plate, eller i en 10 cm plate ved lav konsentrasjon, slik at individuelle enkeltcellekloner avledet kan plukkes og flyttet til en flatbunnet 96-brønns plate.
  6. Tillat bulk cellene inkuberes ved 37 ° C i 3-7 dager og lar kloner å inkubere ved 37 ° C i 7 - 14 dager. Variere disse tider avhengig av doblingstiden for cellelinje som brukes.
    MERK: Denne inkubasjonstiden gir tilstrekkelig celleproliferasjon for screening genomisk DNA (gDNA) for den tiltenkte sletting av PCR (se trinn 6.1 og 7.1). Bulk cellene har tilstrekkelig prolifererte når konsentrasjonen overskrider ~ 100 000 celler / ml eller for adherente celler, har cellene nådde ~ 80% konfluens. Klonene har tilstrekkelig proliferated gang makroskopisk synlig med ~ 2 mm diameter.

6. Primer Validering og Screening for CRISPR / Cas9-mediert sletting

  1. Isolere gDNA fra foreldre og bulk sortert celler ved resuspending foreldre og bulk cellepelleter i 50 mL av DNA-ekstraksjon løsning.
    MERK: generelt ~ 100.000 celler brukes for DNA-ekstraksjon, selv om et bredt spekter av cellenumrene er akseptabelt. Bulk sortert celler er sammensatt av en polyklonal populasjon utsettes for sgRNA-A og sgRNA-B (se trinn 5). Formålet med den følgende PCR-primere er å validere og verifisere tilstedeværelsen av beregnet genomisk delesjon.
  2. Kjør prøven i termo og kjøre følgende program: 65 ° C i 6 min, 98 ° C i 2 min for å pakke gDNA. Måle DNA konsentrasjon.
    MERK: Mens trinn 6.1 og 6.2 anbefale en effektiv metode for DNA-ekstraksjon, kan en hvilken som helst metode for isolering av genomisk DNA benyttes til å være i stand til å utføre PCR i trinn 6.3.
  3. Montere en 20 mL PCR med følgende komponenter: 10 pl 2x PCR mix, 0,5 mL forward primer (10 _6, M), 0,5 pl revers primer (10 uM), 50 til 100 ng gDNA, og H 2 O opp til 20 mL. Bruk primere utformet i trinn 2 ovenfor. Gjennomføre PCR for "non-sletting band" og "sletting band" i egne reaksjoner.
    MERK: Mange polymeraser kan brukes til trinn 6.3.
    1. Kjøre prøver i en termosykler ved hjelp av følgende parametere: 95 ° C i 15 minutter, 35 sykluser av (95 ° C i 30 sek, 60 ° C i 1 min, 72 ° C i 1 min), og 72 ° C i 10 min . Optimalisere PCR betingelser for hver primer par utformet basert på testing av bulk sortert celler.
  4. Kjør prøver på 2% agarosegel ved 10 V / cm ved hjelp 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer.
  5. Undersøke prøver for tilstedeværelse / fravær av ikke-sletting og delesjonsbånd (figur 2). Betrakt multipleksing av "sletting" og "ikke-slettet" PCR-primerpar i en enkelt reaksjon. Optimalisere multiplexingi en polyklonal populasjon (dvs. bulk sortert celler) før screening av individuelle kloner. Det er kritisk at sletting og ikke-sletting amplikonene enkelt kan løses på en agarosegel for multipleksing.

7. Screening CRISPR / Cas9 Clones for slettinger og Clone Selection

  1. For suspensjonsceller, overføre alle kloner i en enkelt 96-brønners plate som allerede inneholder 50 pl cellekulturmedium per brønn i et sluttvolum på 150 ul. Dette letter screening ved å la en flerkanals pipette som skal benyttes for resten av fremgangsmåten i trinn 7.
    1. Overfør 50 ul fra hver brønn (forlater 100 ul i hver brønn) i en 96-brønners PCR-plate ved anvendelse av en multikanal pipette.
    2. Sentrifuger PCR plate ved 400 xg i 5 min og fjerne supernatanten ved å flikke PCR plate over en vask. Tilsett 50 ul av DNA-ekstraksjon løsning per brønn og resuspender. Fortsett til trinn 7.3 for suspensjonsceller.
    3. For heftende celler, aspirer media. Tilsett 20 ul av 0,05% trypsin-EDTA til hver brønn med en klon tilstede.
      1. Resuspender celler i 200 ul medium. Pipette blande å løsne cellene.
      2. Plate 100 ul hver inn i to separate 96-brønners flatbunnede plater. Holde en plate for å tillate kloner til å vokse og bruke den andre plate for å skjerme hver klon for delesjoner.
      3. Legg ytterligere 100 ul til hver brønn for et totalvolum på 200 ul. Vent i 24 - 72 timer for å tillate cellene å vokse.
      4. Aspirer media. Legg 50 pl DNA ekstraksjon løsning per brønn, resuspender og overføring til 96-brønns PCR plate. Fortsett til trinn 7.3.
    4. Pakk ut gDNA fra kloner. Kjør prøven i termo: 65 ° C i 6 minutter og 98 ° C i 2 minutter for å ekstrahere gDNA.
    5. Screen hver klone ved hjelp av samme PCR-primere og reaksjonsbetingelser optimalisert på bulk celler (se trinn 6).
    6. Velg kloner Idenkonstaterte med ønsket slette og flytte til større plate eller kolbe for vekst.

    8. Prøving av Biallelic Sletting Clones

    1. For å karakter framstilt kloner og validere en vellykket knockout, evaluere kloner på DNA, så vel som RNA og / eller proteinnivåer.
      1. Å evaluere DNA, forsterke sletting band fra biallelic sletting kloner med en korrekturlesing polymerase og klone amplikonene (f.eks med en PCR kloning kit) til en plasmidvektor. Forvandle plasmidet inn DH5a E. coli-celler og plate på LB-agar-plater med det relevante antibiotikum. Velge flere kolonier, mini-prep hver enkelt, og utsett hver klone til Sanger-sekvensering for å karakterisere hver sletting allele 28-30. Gjenta PCR test for sletting etter den første skjermen sørger for at riktig klonen ble valgt og reproduserbarhet av resultater.
      2. Å evaluere RNA, utføre RT-qPCR for gene ekspresjonen av det aktuelle genet 30,31.
      3. For å evaluere protein, utfører en immunoblot ved å bruke et antistoff mot det relevante protein 33.

Representative Results

Målet med dette eksperimentet var sletting av Pim1 i MEL-celler. Bruk av flere ikke-overlappende sgRNA parene (dvs. uavhengige protospacer sekvenser) kan bidra til å kontrollere for off-target effekter (figur 1A). En konsekvent fenotype vil være mer sannsynlig å være et resultat av en on-target effekt i motsetning til en vanlig off-target effekt deles av flere uavhengige protospacer sekvenser. Hvert par ville føre til produksjon av en unik sletting knekkpunkt. Hvis tett sammen (dvs. n mindre enn ~ 150 bp), kan de samme screening-primere bli anvendt for å detektere delesjoner produseres av hvert sett av sgRNAs. Genomiske delesjoner kan forstyrre gener ved hjelp sgRNA parvis på forskjellige steder i forhold til genet (figur 1B). For eksempel kan sgRNA par flankerer et gen for sletting av hele genet kroppen; paret kan være lokalisert innen to eksoner, med mulighet for å opprette rammeskift indels selv om en eller begge alleles ble ikke slettet; eller paret kan flanke en bestemt ekson å tillate avbrudd av en bestemt isoform.

Slettingen strategien brukes for Pim1 var å designe flankerer sgRNAs å slette hele genet kroppen, en 8 kb sletting (Figur 2). Denne strategien ble valgt delvis på grunn av den relativt lille størrelsen på Pim1 genet. Dette eksempelet viser en PAM (grønn) på toppen (Watson) strand og en PAM på bunnen (Crick) strand; imidlertid DSB uavhengig av PAM sekvens lokalisering til toppen eller bunnen strand. sgRNA parene kan ha både PAM-sekvenser på den øverste tråd, både på den nederste tråd, eller en av hver. Ved anvendelse av protokollen beskrevet ovenfor ble to sgRNA konstruert, klonet inn i pX330 ekspresjonsvektor, og levert til MEL-celler ved elektroporering sammen med en reporter GFP (figur 2A). Den øverste 3% av GFP + celler ble sortert to dager etter elektroporering og belagt clonally på å begrense fortynning. Screening primere ble utformet som beskrevet i trinn 2, og som vist i figur 2. PCR-betingelser ble optimalisert ved bruk av gDNA isolert fra foreldre MEL-celler og fra "bulk" sorterte cellene.

10 dager etter plettering ble gDNA isolert fra alle kloner og screenet for sletting via PCR, som identifiserte ikke-sletting, monoallelic og bialleliske delesjonskloner i henhold til mønster av ikke-delesjon (ND) og sletting (D) amplikoner (Figur 3) . Ikke-delesjonskloner ble identifisert til å ha nærvær av den ikke-sletting amplikon og fravær av slettingen amplikon. Monoallelic kloner ble identifisert til å ha nærvær av både de ikke-sletting og sletting amplikoner. Bialleliske kloner ble identifisert til å ha fravær av det ikke-sletting amplikon og tilstedeværelsen av slettingen amplikon. For denne slettingen, ble 400 kloner screenet som identifiserte 126 monoallelic sletting kloner og 32 biallelic DELET ion-kloner (det er viktig å merke seg at sletting frekvens varierer med sletting størrelse 12). Biallelic sletting kloner ble valgt ut og flyttet til krukker med 8 ml av media. Etter tillater fem dager for utvidelse, ble hver klone testes ved PCR av gDNA å bekrefte biallelic sletting og sletting amplikonene ble utsatt for Sanger-sekvensering for å identifisere den nøyaktige sletting (figur 2B). Heterogenitet innenfor sletting amplikonene reflekterer ufullkommen Indel dannende NHEJ reparasjon. Sekvensering av ikke-sletting allel i monoallelelic sletting kloner avdekket indels i de fleste tilfeller, viser at selv de ikke-slettet allelet er ofte redigert av CRISPR / Cas9, noe som kan være viktig for applikasjoner der både monoallelic og biallelic sletting kloner er påkrevd . RNA ble isolert fra bialleliske delesjonskloner og analysert ved RT-qPCR å bekrefte tap av Pim1 uttrykket (figur 4).

måter "> Figur 1
Figur 1. Skjematisk av mulige sletting strategier. (A) To eksempel sgRNA par for genomisk slettinger (vist i svart og oransje, henholdsvis). De blå piler indikerer primere for å påvise ikke-sletting amplikon og røde pilene viser primere for å detektere slettingen amplikon. sgRNA posisjonerer 17 og 18 er uthevet i rødt og blått på sgRNA-nettsteder-A 1 / A 2 og er markert med rødt og oransje på 1 / B to B sgRNA-nettsteder-med en rød linje som angir spådd Cas9 spalting mellom posisjonene 17 og 18. (B) CRISPR styrt spaltinger vises som vertikale svarte linjer. De blå pilene viser primere for å oppdage den ikke-sletting amplicon og røde piler indikerer primere for å oppdage sletting amplicon. Klikk her for å seen større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Strategi for å produsere og oppdage sletting av Pim1, inkludert sekvense sletting og ikke-sletting alleler. (A) Skjematisk av PCR-basert screening strategi for å identifisere Pim1 sletting kloner. En primer-par er plassert internt i den delesjon (blå piler), og en primer-par er lokalisert utvendig i forhold til delesjon (røde piler). sgRNA sekvenser (protospacer sekvenser) er vist i lilla. De vertikale røde linjene indikerer spådd Cas9 spalting mellom posisjonene 17 og 18 i sgRNA sekvens. (B) Sanger-sekvensering avslører Indel dannelse på sgRNA anerkjennelse nettstedet. sgRNA sekvenser er vist i lilla og PAM sekvenser i grønt. Sletting hendelser er shegen ved et tilsvarende antall dash merker og innsett er markert med rødt. Vertikale røde linjene indikerer spådd spaltingssete, mellom posisjonene 17 og 18 i sgRNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representant gel identifisere ikke-sletting, monoallelic, og biallelic kloner. For hver klone, representerer venstre kjørefelt ikke-sletting amplicon ("ND" i blått) og høyre felt representerer slettingen amplicon ("D" i rødt ). Individuelle kloner ble separert ved hjelp av stiplede linjer. De tre monoallelic delesjonskloner er kloner 5, 6 og 2. De tre bialleliske delesjonskloner er klonene 15, 17 og 13. Som det fremgår av sekvenseringsdata, slettingen båndet for c lone 13 har en mindre størrelse på grunn av større slettinger på sletting krysset.

Figur 4
Figur 4. Tap av Pim1 uttrykk i biallelic sletting kloner. Pim1 uttrykk ble beregnet for to biallelic sletting kloner ved RT-qPCR. Data ble normalisert til GAPDH hjelp av 2 - ΔCt metoden.

Protospacer Sequence
sgRNA-A 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 '
sgRNA-B 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 '

Tabell 1. 20-mer protospacer sekvenser for to sgRNA for sletting av Pim1.

543 "> Revers komplement av Protospacer Sequence sgRNA-A-rc 5'-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-B-rc 5'-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 '

Tabell 2. Bakover komplement av protospacer sekvenser for to sgRNA fra tabell 1.

Sekvenser
sgRNA-A 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 '
sgRNA-A-rc 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 '
sgRNA-B 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 '
sgRNA-B-rc 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 '

Tabell 3. Protospacer sekvenser og deres omvendt utfyller med "CACC" og "AAAC" lagt for kloning inn i pX330 vektor ved hjelp BbsI begrensning enzym.

Sekvenser
sgRNA-A 5'- CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 '
sgRNA-A-rc 5'- AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 '
sgRNA-B 5'- CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 '
sgRNA-B-rc 5'- AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 '

Tabell 4. sgRNA ekspresjon fra U6 promoteren til pX330 vektoren er forbedret ved tilsetning av en G nukleotid etter CACC sekvensen og før20-mer. Tilsetningen av en ekstra G nukleotid krever tilsetning av en C nukleotid ved 3'-enden av den omvendte komplement oligo (f.eks sgRNA-A). Men hvis den første plasseringen av 20-mer (protospacer sekvens) er allerede en G nucleotide, er det ikke nødvendig å legge til en annen G (f.eks-B sgRNA) og trenger ikke å legge til C til den endelige plasseringen av revers komplement oligo.

Discussion

Den CRISPR / Cas9 systemet kan brukes til å generere genomisk slettinger av en rekke størrelser. Selv om vi har observert at hyppigheten av sletting varierer omvendt i forhold til beregnet sletting størrelse, har vi vært i stand til å gjenopprette slettinger på opp til 1 Mb, og slettinger opp til 100 kb rutinemessig gi flere biallelic slettet kloner. Vi har observert noe tap i virkningsgrad på sekvensmessig innføring av delesjoner i en cellelinje. Denne strategi kan anvendes for opprettelse av kombinatorisk delesjon av tallrike gener og elementer. Prosessen med å skaffe bialleliske delesjonskloner kan bli fremskyndet ved å beregne minimum antall kloner som trengs for å være skjermet basert på sletting størrelse for å oppnå det ønskede antall kloner med bialleliske sletting 12.

Muligheten til å skaffe monoallelic sletting med fravær av biallelic sletting ved sannsynlighetsfordeling kan indikere celle dødelighet assosiert med fullstendig tap av funksjon. Lav frfrekvensskiftnøklede eller fraværende slettinger kan reflektere en rekke scenarier, inkludert dårlig transfeksjon, ineffektive sgRNAs eller ineffektive PCR screening primere (på grunn av mangel på en positiv kontroll for å validere PCR primere til skjermen for sletting). GFP + celler kan brukes som et surrogat for transfeksjonseffektivitet (se trinn 5.2), slik at en reduksjon i GFP + celler sannsynligvis skyldes dårlig transfeksjon og en resulterende redusert sletting effektivitet. Ved hjelp av to ulike sgRNA parene med uavhengige screening primere kan hjelpe kontroll for ineffektiv sgRNA og screening PCR primere og maksimere sjansene for å få biallelic sletting kloner. Celle sortering for GFP + celler beriker for sletting alleler. Selv om dette trinn kan utelates, vil utelatelsen sannsynlig nødvendig screening flere kloner for å identifisere de med monoallelic eller bialleliske delesjoner. I den grad transfeksjonseffektivitet kan optimaliseres, ville vi forvente genom redigering effektivitet for å bli styrket.

(figur 2B). Ofte er disse alleler synes å være et resultat av microhomology basert reparasjons 34,35. Det skal bemerkes at PCR-basert deteksjon strategi beskriver vi ikke vil identifisere større og mer kompliserte insersjoner, delesjoner, inversjoner eller rearrangementer. Selv om disse hendelsene er mindre vanlig, har vi observert kloner der verken sletting eller ikke-sletting amplikonene kunne påvises, og ved nærmere undersøkelse gjenspeile disse mer komplekse utfall.

Vi har observert utstrakt CRISPR / Cas9-mediert "scarring" av ikke-delesjons alleler fra monoallelic og ikke-delesjonskloner (se figur 2B). Disse "arr" består avsmå indels produsert ved sgRNA spaltingssete uten den tilsiktede delesjon (det vil si, delesjon av den mellomliggende segment mellom sgRNAs A og B). Disse arrene avbryte ofte målet anerkjennelse av sgRNA. Derfor vil vi oppfordre forsiktig i retargeting alleler i cellene tidligere utsatt for sgRNAs bruker de samme sgRNAs. En mer vellykket retargeting strategi ville utnytte unike sgRNA sekvenser forskjellig fra tidligere "arrete" gjenkjenningsseter. I tilfeller hvor et par av sgRNAs gjenkjenner exonic sekvenser (figur 1B, nederst), kan rammeskiftlene fremstilles selv i fravær av delesjon. Derfor kan monoallelic delesjonskloner anrikes for tap-av-funksjon på grunn av den høye frekvensen av rammeskiftmutasjoner på den ikke-slettede 12 allelet.

En bekymring med CRISPR / Cas9 systemet er off-target effekter, dvs. genomisk modifikasjon ved utilsiktede nettsider 36-38. Recent rapporter har antydet at kortere lede RNA med 17 - 19 nukleotider kan redusere hyppigheten av CRISPR / Cas9-basert off-target effekter 39. I tillegg kan en dobbel-sammenpressing strategi ved hjelp av to guider per målområde med en nickase brukes til å lage DSB sin samtidig som off-target effekter 7. Alternativt, som er analog med strategier benyttes for RNAi, foreslår vi at forskjellige par av sgRNAs med ikke-overlappende protospacer sekvenser brukes for å vise at den observerte fenotype er et resultat av den på-target CRISPR / Cas9 modifikasjon i motsetning til et potensial off-target effekt. En praktisk tilnærming ville være å utforme i det minste to nærliggende, men ikke-overlappende sgRNA parvis, slik at et enkelt sett av primere screening (se trinn 2) kan benyttes for flere sgRNA parene (figur 1A). Videre kan utfyller en sletting cellelinje ved å gjeninnføre den manglende delen og / eller forstyrret genet bygge en årsakssammenheng mellomen gitt genomisk sletting og fenotype.

For biologer som arbeider med mobilnettet modellsystemer, har RNAi representert et kraftig verktøy for funksjonell genomforskning. Men begrensninger av denne tilnærmingen har tatt ufullstendig reduksjon i mål mRNA transkripsjonsnivåer, heterogenitet av effekten av uavhengige reagenser rettet mot samme genet, og kjente off-target effekter inkludert frø baserte og ikke-seedet effekter 40-42. Genome redigering strategier lover å møte mange av disse bekymringene og representerer en spennende, komplementær tilnærming for potensiell genetisk forstyrrelse 8,36,37. Videre kan genomet redigering for studiet av ikke-kodende genetiske elementer på en måte som ikke er mulig ved RNAi og utfordrende ved konvensjonell målretting nærmer seg 25. Vi oppfordrer generasjon av genomisk slettinger av CRISPR / Cas9 som en robust og bestemt metode for å produsere og karakterisere tap-av-funksjon alleler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T4 DNA ligase (with associated ligation buffer) New England Biolabs M0202T
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
BSA, molecular biology grade New England Biolabs B9000S
BbsI restriction enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) New England Biolabs R0539S
pSpCas9(BB) (pX330) Addgene 42230
S.O.C. medium Life Technologies 15544-034
BTX ECM 830 Harvard Apparatus 45-0052
BTX solution and 2 mm cuvettes Harvard Apparatus 45-0803
pmaxGFP plasmid Lonza VPA-1003
QuickExtract DNA Extraction Solution Epicentre QE09050
HotStarTaq PCR Master Mix Kit Qiagen 203443
Zero Blunt PCR Cloning Kit Life Technologies K2700-20
Plasmid Addgene 42230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. Z. F. N., TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709-1712 (2007).
  6. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  7. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  8. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  9. Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nature Protocols. 8 (11), 2180-2196 (2013).
  10. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  11. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  12. Canver, M. C., et al. Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by CRISPR/Cas9 in Mammalian Cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  13. Xiao, A., et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Research. 41 (14), e141 (2013).
  14. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9 mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. , (2014).
  15. Wang, T., et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Niu, Y., et al. Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
  18. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
  19. Xie, K., Yang, Y. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. Molecular Plant. 6 (6), 1975-1983 (2013).
  20. Waaijers, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 195 (3), 1187-1191 (2013).
  21. Bassett, A. R., Liu, J. L. CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila. Journal of Genetics and Genomics. 41 (1), 7-19 (2014).
  22. Schwank, G., et al. Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in Intestinal Stem Cell Organoids of Cystic Fibrosis Patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  23. Wu, Y., et al. Correction of a Genetic Disease in Mouse via Use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 13 (6), 659-662 (2013).
  24. Lappalainen, T. M., et al. Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans. Nature. 501 (7468), 506-511 (2013).
  25. Bauer, D. E., et al. An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level. Science. 342 (6155), 253-257 (2013).
  26. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS One. 3, e3647 (2008).
  27. Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177, 437-447 (2003).
  28. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
  29. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  30. Finney, M., Nisson, P. E., Rashtchian, A. Molecular cloning of PCR products. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 15. (Unit 15.4), (2001).
  31. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR). J. Vis. Exp. (63), e3874 (2012).
  32. Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas. J. Vis. Exp. (89), e51093 (2014).
  33. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  34. McVey, M., Lee, S. E. MMEJ repair of double-strand breaks (director’s cut): deleted sequences and alternative endings. Trends in Genetics. 24 (11), 529-538 (2008).
  35. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  36. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  37. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnology. , (2014).
  38. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  39. Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32, 279-284 (2014).
  40. Alemán, L. M., Doench, J., Sharp, P. a Comparison of siRNA-induced off-target RNA and protein effects. RNA. 13 (3), 385-395 (2007).
  41. Anderson, E. M., et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA. 14, 853-861 (2008).
  42. Marine, S., et al. Common seed analysis to identify off-target effects in siRNA screens. Journal of Biomolecular Screening. 17 (3), 370-378 (2012).

Tags

Molecular Biology CRISPR Cas9 Genome Engineering Gene Knockout Genomisk Sletting Gene forordning
Generasjon av Genomiske slettinger i pattedyrcellelinjer via CRISPR / Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin,… More

Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118, doi:10.3791/52118 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter