Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

टी कोशिकाओं की व्युत्पत्ति Published: October 14, 2014 doi: 10.3791/52119
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Hunter College and Graduate Center, City University of New York, 2Sunnybrook Research Institute, Department of Immunology, University of Toronto

Protocol

संस्कृति, मीडिया, साइटोकिन्स और gelatinized प्लेट्स की 1. तैयारी

  1. उच्च ग्लूकोज और सोडियम पाइरूवेट साथ ईगल मध्यम (DMEM) की है Dulbecco संशोधन का उपयोग करके ES सेल मीडिया तैयार करें. 1% HEPES बफर, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 0.1% Gentamicin (50 मिलीग्राम / एमएल) और 0.1% (भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के योग्य 20% ईएससी, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% एल glutamine, जोड़ें 55 माइक्रोन) β-mercaptoethanol. निस्पंदन द्वारा ES सेल मीडिया जीवाणुरहित.
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पाउडर से अल्फा न्यूनतम आवश्यक मध्यम (α सदस्य) की 1 एल बनाकर OP9 मीडिया तैयार करें. 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें. मिश्रण को पलटना. दो 500 मिलीलीटर aliquots में निस्पंदन द्वारा जीवाणुरहित.
    नोट: पाउडर से बना मीडिया के उपयोग की सिफारिश की और बेहतर OP9 सेल रखरखाव और इन विट्रो भेदभाव परिणामों में मिलने की संभावना है. यह दृष्टिकोण हमारी मानक प्रक्रिया बन गया है. हालांकि, हम यह भी था ध्यान देंटी हम समय पर पर्याप्त सफलता के साथ पूर्व बनाया तरल α सदस्य का इस्तेमाल किया है.
  3. 90% FBS के लिए 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) जोड़कर मीडिया ठंड तैयार करें. धीरे भंवर और निस्पंदन द्वारा बाँझ. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  4. 10 माइक्रोग्राम / एमएल को पूरा OP9 मीडिया में मानव पुनः संयोजक फ्लाइट -3 ligand (फ्लाइट-3L) भंग करके 2,000x फ्लाइट -3 ligand (10 माइक्रोग्राम / एमएल) तैयार करें. -80 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में विभाज्य और दुकान. स्थिरता और भंडारण के बारे में आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों का पालन करें.
    नोट: फ्लाइट-3L की स्थिरता (4 डिग्री सेल्सियस या 3 महीने -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीना) कम है.
  5. पूरा OP9 मीडिया का उपयोग करके 1,000x आईएल -7 (1 माइक्रोग्राम / एमएल) तैयार करें. -80 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में विभाज्य और दुकान. स्थिरता और भंडारण पर सप्लायर की सिफारिशों का पालन (आईएल -7 -80 डिग्री सेल्सियस से 12 महीने के लिए स्थिर है).
  6. LIF मैं 10 के लिए 7 इकाइयों में से एक 1:10 कमजोर पड़ने से 1,000x लेकिमिया निरोधात्मक फैक्टर (LIF) (10 माइक्रोग्राम / एमएल) की तैयारीn ES सेल मीडिया. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर विभाज्य. विभाज्य शीशियों पर निर्माता द्वारा प्रदान की समाप्ति तिथि नोट करने के लिए सुनिश्चित करें.
    नोट: उत्पाद निर्माण की तारीख से केंद्रित या पतला रूप में कम से कम 18 महीने में स्थिर है.
  7. Gelatinized 6 अच्छी तरह प्लेटें तैयार द्वारा 6 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में 1.5 मिलीलीटर 0.1% की जिलेटिन समाधान जोड़ें. कोटिंग के लिए कम से कम 30 मिनट की अनुमति, पर lids के साथ कमरे के तापमान पर बाँझ हुड में बर्तन छोड़ दें. व्यंजन भी एक humidified इनक्यूबेटर रातोंरात में छोड़ा जा सकता है. सही सेल बोने से पहले किसी भी बचे हुए जिलेटिन समाधान निकालें. जिलेटिन समाधान पूरी तरह से अच्छी तरह से बाहर सूखी मत देना.

2 तैयार करना और फीडर कोशिकाओं और माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव (mESC)

नोट: 5% सीओ 2 के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सभी कोशिकाओं को सेते हैं.

  1. विगलन माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEF)
    1. एक जमे हुए शीशी (~ 5 एक्स 10 6 त्वरित पिघलना
    2. धीरे धीरे ठंड मध्यम से DMSO पतला करने के लिए एक बूंद के लिहाज से फैशन में, thawed कोशिकाओं को ES सेल मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़ें.
    3. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 400 x जी पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और ES सेल मीडिया के 3 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend.
    4. पूर्व गर्म ES सेल मीडिया के 33 मिलीलीटर के साथ एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयार करें. 36 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए resuspended MEFs के 3 मिलीलीटर जोड़ें.
    5. दो gelatinized 6 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक कुएं में resuspended MEFs के 3 मिलीलीटर बांटो. कोशिकाओं देते हैं और उन पर mESCs बोने से पहले बाहर का प्रसार करने की अनुमति के लिए कम से कम छह घंटे के लिए इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस. उनके मीडिया हर 2-3 दिन बदल रहा है अगर ये mitotically गिरफ्तार फीडर परतों, प्रारंभिक बोने के बाद कई दिनों के लिए उपयोगी हो सकता है.
      नोट: हौसले गिरफ्तार MEFs भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
      6. </ राजभाषा>
    6. सीडिंग mESCs
      1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक जमे हुए mESC क्लोन के साथ एक शीशी त्वरित पिघलना और 2.1.1-2.1.3 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को तैयार करते हैं.
        नोट: हम एक 6 अच्छी तरह से थाली का एक मिला हुआ अच्छी तरह से mESC के 2 शीशियों फ्रीज.
      2. (चरण 2.1.5 में तैयार) को गिरफ्तार कर लिया MEF monolayers साथ 6 अच्छी तरह से थाली की (mESC क्लोन प्रति) एक अच्छी तरह से मीडिया निकालें और MEF monolayer के शीर्ष पर mESCs के 3 मिलीलीटर बीज. 1,000x LIF (10 एनजी / एमएल) के 3 μl जोड़ें. इनक्यूबेटर में व्यंजन लौटें.
    7. ES सेल रखरखाव और trypsin मध्यस्थता बीतने
      नोट: mESC के संगम पर आधारित बदले दैनिक मीडिया, या विभाजन. बेहतर, फसल और विभाजन / फिर से थाली कोशिकाओं हर दूसरे दिन.
      1. ES सेल मीडिया निकालें और पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ mESCs धो लो. पीबीएस निकालें. 0.25% trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
      2. Trypsinized कोशिकाओं को इकट्ठा और एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में उन्हें स्थानांतरण. सख्ती एम के clumps को तोड़ने के लिए सेल निलंबन pipetESCs. Trypsin बेअसर करने के लिए सेल निलंबन को पूरा ES सेल मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x जी पर स्पिन कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 3 मिलीलीटर ES सेल मीडिया में गोली resuspend.
      4. तैयार गिरफ्तार MEF monolayers युक्त 6 अच्छी तरह प्लेटों से मीडिया निकालें. प्रत्येक अच्छी तरह से ES सेल मीडिया के 3 मिलीलीटर में (वांछित विभाजन अनुपात के आधार पर) सेल निलंबन की उचित मात्रा में जोड़ने वरीयता प्राप्त होंगे. 1,000x lif की 3 μl जोड़ें. 2 दिन में पारित होने के लिए तैयार हो जाएगा 6: एक मिला हुआ mESC अच्छी तरह से 1 विभाजित.
    8. OP9 / OP9-DL1 सेल रखरखाव
      1. OP9 कोशिकाओं की एक शीशी पिघलना (चरणों का पालन 2.1.1-2.1.3 OP9 मीडिया का उपयोग)
      2. 10 सेमी टिशू कल्चर डिश 7 मिलीलीटर OP9 मीडिया जोड़ें. थाली भर में कोशिकाओं का वितरण, एक बूंद वार ढंग से resuspended कोशिकाओं के 3 मिलीलीटर जोड़ें. इनक्यूबेटर में रातोंरात कोशिकाओं रखें.
      3. अगले दिन OP9 कोशिकाओं के संगम की जाँच करें. डिश कई मृत चल सेल शामिल हैं, रेमोमीडिया है और ताजा OP9 मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें. लगभग पूरा संगम नहीं मनाया जाता है अगर इनक्यूबेटर पकवान लौटें. 4 के पास मिला हुआ OP9 monolayer: स्प्लिट 1 (trypsin का उपयोग).
        नोट: प्लेट्स के बारे में 2 दिनों में फिर से वही संगम स्तर तक पहुंच जाना चाहिए. अधिक-मिला हुआ बन OP9 कोशिकाओं जाने के लिए नहीं ख्याल रखना.
      4. विस्तार शेयरों के रूप में OP9 कोशिकाओं के शुरुआती अंश रुक.
        नोट: हम मिला हुआ 10 सेमी पकवान के पास एक से OP9 कोशिकाओं के 2 शीशियों फ्रीज. विस्तार शेयर की प्रत्येक शीशी आगे बाद में mESC सह संस्कृति प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है कि काम कर रहे शेयरों बनाने के लिए प्रचारित किया जा सकता है. अस्थिर तापमान नकारात्मक जमा देता है की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं, बल्कि -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में से तरल नाइट्रोजन में जमे हुए सभी OP9 शेयरों रखें.

    3 OP9-DL1 सह संस्कृति प्रक्रिया

    1. सह संस्कृति तैयारी
      1. लगभग एक सप्ताह पूर्व एक सह संस्कृति की दीक्षा के लिए, MEFs, mESCs और OP9 सेल काम कर STO पिघलनाCKS. OP9-DL1 कोशिकाओं सह संस्कृति दिवस 8 तक की जरूरत नहीं कर रहे हैं, सह संस्कृति दीक्षा के बाद पहले तीन दिनों के दौरान OP9-DL1 कोशिकाओं पिघलना. बनाए रखने या जरूरत के रूप में सभी कोशिकाओं फ्रीज.
      2. प्रयोग के पैमाने पर आधारित दिन 0 सह संस्कृति पर 80% संगम तक पहुंचने के लिए तैयार OP9 सेल monolayers साथ 10 सेमी प्लेटों की प्रारंभिक संख्या का निर्धारण करते हैं (उदाहरण के लिए, mESC क्लोन की संख्या भेदभाव किया जा करने के लिए सह संस्कृति समय बिंदुओं की संख्या को ) विश्लेषण किया. 4 और 1: एक सह संस्कृति के लिए तैयार करने के लिए, 1 के बीच OP9 कोशिकाओं का मिला हुआ पकवान के पास विभाजित 6 दो दिन आगे monolayers जरूरत होगी जब की.
        ध्यान दें: एक ईएससी क्लोन प्रति कम से कम एक प्लेट की जरूरत होगी. सुबह 5 बीतने पर छह प्लेटें बीज के लिए पर्याप्त कोशिकाओं उपज चाहिए 0 दिन पर (नीचे वर्णित) आमतौर पर, एक भी ईएससी क्लोन एक ही थाली पर वरीयता प्राप्त. प्रत्येक दिन 5 प्लेट एक बाद के विश्लेषण के समय बिंदु सक्षम हो जाएगा.
      3. OP9 monolayers लगातार सह संस्कृति पारित होने के लिए आवश्यक हो जाएगा के बाद से, ध्यान हमेशा mainta करने के लिए लेसह संस्कृति के साथ समानांतर में अतिरिक्त OP9 संस्कृति प्लेटों की एक पर्याप्त संख्या में.
    2. 0 दिन: सह संस्कृति की शुरूआत
      1. 2.3.1-2.3.4 में के रूप में mESC लीजिए. कोशिकाओं की गणना.
      2. प्रत्येक mESC क्लोन के लिए थाली प्रति OP9 मीडिया के 10 एमएल में 5 एक्स 10 4 mESC तैयार करते हैं.
        नोट:. हम इसे इस्तेमाल नहीं किया है, हम एक वैकल्पिक माध्यम के α सदस्य, 10% FBS से मिलकर, और 5 एक्स 10 β-mercaptoethanol भी भेदभाव सह संस्कृतियों में इस्तेमाल के लिए सूचित किया गया है -5 एम 10 ध्यान दें कि
      3. OP9 व्यंजन से पुराने मीडिया निकालें और थाली भर में समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए देखभाल करने के व्यंजन को mESC निलंबन के 10 मिलीलीटर जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बर्तन रखें.
    3. दिन 3: मीडिया बदलें
      1. इनक्यूबेटर से बर्तन निकालें और माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करते हैं. कालोनियों चमक खोने के लिए और चपटा दिखाई शुरू करना चाहिए.
      2. व्यंजन से मीडिया निकालें और धीरे ताजा OP9 के 10 एमएल जोड़ेंमीडिया.
      3. इनक्यूबेटर सह संस्कृति व्यंजन लौटें. नेत्रहीन कालोनियों के 80-90% नेत्रहीन mesoderm तरह आकारिकी प्रदर्शित ~ जब तक बाहर नहीं किया जा चाहिए जो अगले बीतने (5 दिन), के लिए OP9 फीडर monolayer तैयारी के समय को सूचित करने के लिए दैनिक mesoderm तरह कॉलोनी गठन की निगरानी. सुबह 5 सेल हस्तांतरण कदम की अधिकतम स्थगन 2 दिन है.
    4. दिन 5: पूर्व चढ़ाना के साथ trypsin मध्यस्थता बीतने.
      नोट: बेहतर मिला हुआ OP9 कोशिकाओं के साथ अग्रिम में 10 सेमी व्यंजन की एक पर्याप्त संख्या तैयार करें. सह संस्कृतियों नेत्रहीन कदम 3.3.3 में वर्णित सुविधाओं को प्रदर्शित केवल अगर अगले चरणों के साथ आगे बढ़ें (भी प्रतिनिधि परिणाम देखें).
      1. सह संस्कृति व्यंजन से मीडिया निकालें. धोने के लिए 4 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें. पीबीएस भंवर और हटा दें. 0.25% trypsin के 4 मिलीलीटर जोड़ें और ~ 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में व्यंजन जगह है.
      2. देखभाल करने के लिए एक, जब तक अत्यधिक हवा बुलबुले परिचय नहीं, जोरदार pipetting द्वारा trypsinized कोशिकाओं की परत बाधितसजातीय, ज्यादातर एकल कक्ष निलंबन हासिल की है.
      3. पूरा OP9 मीडिया के 4 मिलीलीटर जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण. 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में एक नया, खाली 10 सेमी पकवान और जगह में स्थानांतरित कोशिकाओं OP9 कोशिकाओं पकवान का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए. यह "पूर्व चढ़ाना" कदम सह संस्कृति के अगले कदम के लिए स्थानांतरित कर OP9 कोशिकाओं की संख्या कम कर देता है.
      4. 40 माइक्रोन सेल strainers साथ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों तैयार.
      5. पूर्व चढ़ाया पकवान से गैर पक्षपाती कोशिकाओं को इकट्ठा और ट्यूब में सेल झरनी के माध्यम से गुजरती हैं. पीबीएस के 6 मिलीलीटर के साथ धीरे पकवान धो लें और पीछे जुड़ी OP9 कोशिकाओं छोड़ रहा है, वही झरनी के माध्यम से इसे पारित.
      6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 400 x जी 5 मिनट पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला निकालें और पूरा OP9 मीडिया के 3 मिलीलीटर में pelleted कोशिकाओं resuspend. कोशिकाओं की गणना.
      7. बेहतर मिला हुआ OP9 कोशिकाओं के साथ 10 सेमी प्लेटों से मीडिया निकालें.
      8. प्रत्येक विश्लेषण समय बिंदु के लिए, OP9 मोनो पर 5 x 10 5 कोशिकाओं बीज10 मिलीलीटर अंतिम मात्रा में परत.
      9. 5 एनजी / एमएल मानव पुनः संयोजक फ्लाइट-3L जोड़ें और इनक्यूबेटर में व्यंजन जगह है.
    5. दिवस 8: Hematopoietic पूर्वपुस्र्ष सेल (एचपीसी) संग्रह
      नोट: इस कदम के लिए समय में वे हो जाएगा कि इतना अग्रिम में OP9 या OP9-DL1 सेल monolayers साथ 6 अच्छी तरह प्लेटों की एक पर्याप्त संख्या तैयार ~ 80% मिला हुआ.
      1. 40 माइक्रोन strainers साथ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों तैयार.
      2. इनक्यूबेटर से बर्तन निकालें और माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करते हैं. HPCs की चमकदार समूहों शिथिल OP9 monolayer से जुड़ी होनी चाहिए. एक विंदुक के साथ OP9 monolayer और पकवान पर मौजूदा मीडिया धोने (लेकिन पीढ़ी में बाधा पहुँचा नहीं) द्वारा संभव के रूप में इन कोशिकाओं के रूप में कई लीजिए. झाग रोकने के लिए, हमेशा इस एचपीसी संग्रह / वाशिंग कदम दौरान pipet की नोक में मीडिया का कम से कम 1 मिलीलीटर छोड़ दें.
      3. एक ट्यूब में 40 माइक्रोन झरनी के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती हैं. अगर सब HPCs एक ही थाली के लिए 8 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें और खुर्दबीन के नीचे की जांच हमफिर से एकत्र की. अधिक सशक्त धोने के साथ (यदि आवश्यक हो) पीबीएस के साथ धोने / संग्रह चरण को दोहराएँ और. पहले से ही एक ही थाली से कोशिकाओं से युक्त ट्यूब में कोशिकाओं तनाव.
      4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x जी पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं.
      5. 5 एनजी साथ OP9 मीडिया के (प्लेट दिन 5 पर वरीयता प्राप्त प्रति) 3 मिलीलीटर की एक मास्टर मिश्रण तैयार / एमएल फ्लाइट-3L और 1 एनजी / एमएल आईएल 7.
      6. फ्लाइट-3L + आईएल -7 मास्टर मिश्रण के साथ OP9 मीडिया में (प्रसंस्कृत प्रत्येक 10 सेमी पकवान के लिए 3 मिलीग्राम) सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें. OP9 कोशिकाओं के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएँ में प्रत्येक थाली से एकत्र कोशिकाओं स्थानांतरण.
        1. , Monocytic, बी सेल या एर्य्थ्रोइद प्रजातियों की ओर कोशिकाओं ड्राइव OP9 कोशिकाओं पर एकत्र कोशिकाओं बीज के लिए आदेश में. टी कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए, OP9-DL1 सेल monolayers पर कोशिकाओं बीज.
      7. इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह प्लेटें रखें.
    6. दिन 10: मीडिया बदलें
      1. प्रत्येक अलग mESC क्लोन-फीडर सेल प्रकार combina के लिए एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयारसह संस्कृति में tion.
      2. फ्लाइट-3L के 5 एनजी / एमएल और आईएल -7 की 1 एनजी / एमएल के साथ OP9 मीडिया के एक मास्टर मिश्रण तैयार करें. प्रत्येक के लिए अच्छी तरह 3 मिलीलीटर तैयार करें.
      3. धीरे वही ईएससी क्लोन-फीडर सेल प्रकार संयोजन युक्त कई कुओं से मीडिया के संयोजन 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया इकट्ठा.
      4. प्रत्येक कुएं में OP9 मीडिया मास्टर मिश्रण के 2 मिलीलीटर (3.6.2 देखें) जोड़ें.
      5. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x जी पर एकत्र मीडिया. अच्छी तरह से प्रति OP9 मीडिया मास्टर मिश्रण की 1 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली (दृश्य बहुत छोटे) (3.6.2 देखें) मूल रूप से कदम 3.6.3 में एकत्र सतह पर तैरनेवाला निकालें और resuspend.
      6. वापस प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया मूल रूप से 3 मिलीग्राम के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक में मात्रा लाने एकत्र किया गया था जिसमें से में कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर बांटो. इनक्यूबेटर व्यंजन लौटें.
    7. 12 दिन: नहीं trypsin बीतने
      नोट: इस S के लिए वे बेहतर समय में मिला हुआ हो जाएगा तो यह है कि अग्रिम में OP9 या OP9-DL1 कोशिकाओं के साथ 6 अच्छी तरह से व्यंजनों की एक पर्याप्त संख्या को तैयारTEP. 12 दिन के विकास एर्य्थ्रोइद, monocytic, और प्रारंभिक चरण टी कोशिकाओं का विश्लेषण प्रवाह cytometry के लिए आदर्श है.
      1. एक मास्टर मिश्रण फ्लाइट-3L के 5 एनजी / एमएल और आईएल -7 की 1 एनजी / एमएल के साथ OP9 मीडिया की (सह संस्कृति में जारी रहेगा कि प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से 3 मिलीग्राम) तैयार करें.
      2. 40 माइक्रोन strainers (सह संस्कृति में प्रत्येक ईएससी क्लोन-फीडर सेल प्रकार संयोजन के लिए एक) के साथ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों तैयार.
      3. सख्ती कुएं में (monolayer सहित) सभी कोशिकाओं disaggregate लिए प्रत्येक कुएं में मौजूदा मीडिया विंदुक. एक एकल कक्ष निलंबन जैसी एक राज्य हासिल की है जब तक सशक्त pipetting के साथ आगे बढ़ें.
      4. ट्यूब में झरनी के माध्यम से एकत्र की कोशिकाओं से गुजरती हैं. शेष सभी कोशिकाओं को धोने और इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 3 मिलीलीटर जोड़ें. एक ही झरनी के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती हैं. एक ही ईएससी क्लोन-फीडर सेल प्रकार संयोजन युक्त कई कुओं से कोशिकाओं का मिश्रण.
      5. इस्तेमाल किया सेल झरनी त्यागें और एक अच्छी तरह से करने के लिए एक विभाज्य बराबर हटाने (~ 6 मिलीग्राम) किसी भी वांछित के लिए(या अन्य) प्रवाह cytometry उस दिन बाहर ले जाने का विश्लेषण करती है. उपयोग करने से पहले बर्फ पर इन aliquots स्टोर.
      6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x जी पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला निकालें. अच्छी तरह से प्रति मास्टर मिश्रण के 3 मिलीलीटर में 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब से गोली Resuspend फिर से वरीयता प्राप्त होंगे. उचित फीडर सेल का प्रकार पर प्रत्येक कोशिका निलंबन की अच्छी तरह से प्रति 3 मिलीलीटर जोड़ें और इनक्यूबेटर में व्यंजन जगह है.
    8. 14 दिन: मीडिया बदलें
      1. खंड 3.6 में उल्लिखित चरणों का पालन करें.
    9. 16 दिन: नहीं trypsin बीतने
      नोट: इस चरण के लिए अग्रिम में बेहतर मिला हुआ OP9 या OP9-DL1 कोशिकाओं की 6 अच्छी तरह से व्यंजन तैयार करते हैं.
      नोट: फ्लो बी लिम्फोसाइटों और मध्य चरण टी कोशिकाओं का विश्लेषण करती है के लिए 16 दिन आदर्श है.
      1. खंड 3.7 में उल्लिखित चरणों का पालन करें.
    10. दिवस 18: मीडिया बदलें
      1. खंड 3.6 में उल्लिखित चरणों का पालन करें.
    11. दिवस 20: नहीं trypsin बीतने
      नोट: दिन 20 मैंफ्लो के लिए आदर्श टी कोशिकाओं के विकास देर से मंच के मध्य का विश्लेषण करती है.
      1. खंड 3.7 में उल्लिखित चरणों का पालन करें. अगर वांछित, कोशिकाओं पिछले दिन 20 बारी मीडिया परिवर्तन फर्क ले और कोई trypsin लिम्फोसाइट विस्तार दर की दैनिक निगरानी के साथ, हर दो दिन मार्ग.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Lif की उपस्थिति में MEFs पर हो जब, mESCs एक undifferentiated राज्य में बनाए रखा जा सकता है. आदर्श परिस्थितियों में, वे चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी में एक चमकदार प्रभामंडल से घिरे कोशिकाओं की कॉम्पैक्ट कालोनियों (चित्रा 1) के रूप में दिखाई देते हैं. इन संस्कृतियों दैनिक निगरानी की जानी चाहिए. कोशिकाओं के संगम पर निर्भर करता है, मीडिया बदला जा सकता है या कोशिकाओं को विभाजित किया जा सकता है. पड़ोसी mESC कालोनियों एक दूसरे के साथ संपर्क के मुद्दे पर नहीं आना चाहिए. Undifferentiated mESCs की एक सामान्य, स्वस्थ संस्कृति में इन विट्रो टी सेल भेदभाव के लिए एक अनिवार्य प्रारंभिक बिंदु है. सह संस्कृति की शुरुआत करने पर, यह कोशिकाओं भीड़ होने के बिना पूरी तरह से मिला हुआ हो कि सिफारिश की है. OP9 monolayers पर कोशिकाओं बोने के लिए काटा कोशिकाओं का बहुमत (बल्कि फीडर कोशिकाओं की तुलना में) mESC हैं तो यह है. संगम में प्रमुख मतभेद 0 दिन में भेदभाव किया जा करने के लिए विभिन्न mESC क्लोन के बीच मनाया जाता है, तो यह आज़ादी पूर्व पालन द्वारा MEFs दूर करने के लिए सबसे अच्छा होगासह संस्कृति बोने के लिए mESCs गिनती से पहले (पूर्ण ES सेल मीडिया का उपयोग कर कदम 3.4.3-3.4.6 के रूप में) मुकदमा संस्कृति व्यंजन.

(धारा 2.4 में वर्णित है) OP9 कोशिकाओं अच्छी तरह से पूर्व सह संस्कृति दीक्षा बनाए रखा जाना चाहिए. इसके अलावा, यह OP9 कोशिकाओं लंबे समय तक संस्कृति और / या उनके प्रसार दर में स्पष्ट वृद्धि के साथ उनके गुणों में से कुछ खोना सोचा है कि 7 1 परे विभाजन के अनुपात से बचना:. OP9 कोशिकाओं के रखरखाव के दौरान 5, और छह सप्ताह के बाद निरंतर OP9 संस्कृतियों discarding, इन नुकसान से बचने में मदद मिलेगी.

सह संस्कृति (0 दिन, 5, 8, 12, 16) का प्रारंभिक सेल बोने और सेल हस्तांतरण कदम पर, OP9 monolayers. संगम के एक इष्टतम सीमा के भीतर होना चाहिए 2 कम (2A चित्रा) से पता चलता है और उच्च (चित्रा 2 बी) सह संस्कृति monolayers के रूप में उपयोग के लिए उचित OP9 सेल संगम की सीमा के समाप्त होता है. एक से अधिक मिला हुआ थाली का एक उदाहरण छवि में दिखाया गया हैure -2 सी. इष्टतम संगम बनाए रखने में विफलता बड़ी मात्रा में, नकारात्मक सह संस्कृति को प्रभावित कर सकते हैं, adipocytes (चित्रा 2 डी) के गठन को प्रेरित कर सकते हैं.

Mesoderm गठन OP9 कोशिकाओं पर इष्ट है के बाद से दिन 0 पर, सह संस्कृति OP9 कोशिकाओं के बजाय OP9-DL1 कोशिकाओं पर शुरू कर दिया है. कोशिकाओं टी सेल उत्पादन के लिए प्रेरित करने के लिए सुबह 8 पर शुरुआत OP9-DL1 कोशिकाओं monolayers पर चढ़ाया जाता है. कुछ mESC क्लोन नेत्रहीन सह संस्कृति (चित्रा 3 ए बी) के दिन 5 से mesoderm तरह कालोनियों के मजबूत और मात्रात्मक (~ 90%) के गठन को प्रदर्शित करते हैं, दूसरों के इस कदम (चित्रा -3 सी एफ) में देरी प्रदर्शित कर सकते हैं. माइक्रोस्कोप के तहत, इस परख में निकाली गई mesoderm तरह कालोनियों अस्थायित्व वैगन पहियों या खड्ड (चित्रा -4 ए) या, starbursts या फ्लोरेट्स (चित्रा 4 बी) जैसी रूप में वर्णित किया गया है.

प्रकाशित OP9-DL1 प्रोटोकॉल मात्रात्मक mesoderm प्रपत्र का एक आदर्श को दर्शाता है, जबकिसह संस्कृति की सुबह 5 से tion, 7 हम सभी ईएससी क्लोन इस समय सीमा के भीतर है कि आदर्श को प्राप्त नहीं हैं. इन मामलों में, हम सुबह 5 पर मध्यम बदलने और "सुबह 5" सेल फसल / स्थानांतरण प्रोटोकॉल का आयोजन से पहले एक अतिरिक्त 1-2 दिन इंतजार. इस देरी के लक्ष्य से पहले स्थानांतरित करने के लिए नेत्रहीन बन mesodermal को ~ ES सेल कालोनियों के 80-90% की अनुमति है. यह इस 80-90% आंकड़ा सह संस्कृति बर्तन में कॉलोनी आकारिकी की सरल चरण विपरीत सूक्ष्म निरीक्षण द्वारा एक सख्ती दृश्य कसौटी साफ़ दर्शाता है कि स्पष्ट करना जरूरी है. यह केवल 4 चित्र में दिखाया गया है उन जैसे लगते हैं कि ईएससी कालोनियों के अनुपात को संदर्भित करता है. यह कुछ ईएससी क्लोन भी एक दो दिन की देरी के बाद, इस दृश्य कसौटी नहीं पहुँच जाएगा कि संभव है. पहले से वर्णित किया गया है के रूप में इस तरह के एक मामले में, यह, FLK-1 + कोशिकाओं के लिए सेल छँटाई प्रवाह cytometry का उपयोग रक्त बनाने mesodermal व्यापारियों के लिए समृद्ध करने के लिए संभव है. किसी भी मामले में 6,11, एसए के लिएKe नामकरण सुविधा के लिए, हम "घड़ी को रीसेट 'और' सुबह 5 'के रूप में mesoderm तरह कॉलोनी हस्तांतरण के दिन का संदर्भ लें

कई ईएससी क्लोन समानांतर में भेदभाव किया जा रहा है, जब वह दूसरों से पीछे है, जबकि कुछ सह संस्कृतियों, समय पर सुबह 5 पारित होने के लिए तैयार हो जाएगा कि संभव है. इस मामले में, यह धीमी क्लोन दूसरों को पकड़ने जब तक सभी सह संस्कृतियों के पारित होने में देरी करने की सलाह दी जाती है. देरी "समय पर" सह संस्कृतियों को कोई नुकसान नहीं करने के लिए लगता है, लेकिन धीमी क्लोन एक बड़ा सौदा के बाद भेदभाव लाभ.

दिवस 8 (यानी, mesodermal कॉलोनी स्थानांतरण के बाद तीन दिन) HPCs के उद्भव और संचय को देखता है. HPCs शिथिल OP9 फीडर कोशिकाओं (चित्रा 5) का पालन कर रहे हैं कि कोशिकाओं की चमकदार समूहों के रूप में दिखाई दे रहे हैं. जाते वक्त एक सावधान धोने की प्रक्रिया, एक विंदुक और पकवान पर मीडिया का उपयोग कर, अलग कर HPCs एकत्रित करेगाOP9 monolayer ज्यादातर बरकरार (चित्रा 6A सी). यह शायद प्रोटोकॉल का सबसे तकनीक के प्रति संवेदनशील कदम है. यह फीडर परत की न्यूनतम विघटन के साथ HPCs की अधिक से अधिक फसल के वांछित संतुलन प्राप्त करने के लिए उचित गति और मीडिया इंजेक्शन दबाव को खोजने के लिए कुछ अभ्यास लेता है. OP9 monolayer के कुछ बंद लिफ्टों अगर फ़िल्टरिंग. चित्रा 6D आवश्यक से अधिक monolayer विघटन के लिए अग्रणी अत्यधिक pipetting के बाद एक monolayer शो के बाद किसी भी आवारा monolayer के बहुमत 40 माइक्रोन नायलॉन जाल में कब्जा हो जाएगा, क्योंकि यह स्वीकार्य है. इस धोने कदम के दौरान, यह सब HPCs एकत्र किया गया है या नहीं, खुर्दबीन के नीचे की जांच, और तदनुसार धोने दबाव को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

सह संस्कृति की प्रगति फ्लो द्वारा नजर रखी जा सकती है. विशेष रूप से ईएससी के गैर एर्य्थ्रोइद hematopoietic संतान का विश्लेषण करने के लिए, यह लाइव CD45 + कोशिकाओं पर पहले गेट के लिए महत्वपूर्ण है.विश्लेषण से OP9 कोशिकाओं बाहर इस कदम स्क्रीन, DAPI या अन्य परमाणु धुंधला डाई का उपयोग nonviable कोशिकाओं के बहिष्कार के लिए सक्षम बनाता है. सुबह 12 से, छोटे, गोल, चमकदार कोशिकाओं के कई समूहों को दिखाई देना चाहिए. यह इस स्तर पर कोशिकाओं की गिनती करने के लिए आवश्यक नहीं है. लेकिन हम रहते हैं, gated फ्लो घटना मायने रखता अच्छी तरह से दिन 12 सह संस्कृति के अनुसार 1-3 एक्स 10 5 की रेंज में आम तौर पर कर रहे हैं कि देखा है. प्रवाह cytometry एर्य्थ्रोइद निकलेगा OP9 monolayer पर भेदभाव रहते gated कोशिकाओं (CD45 neg, TER119 +) और monocytic (CD45 +, CD11b HI) प्रजातियों (चित्रा 7A) का विश्लेषण करती है. सीडी 4 / सीडी 8 डबल नकारात्मक की विशेषता मार्कर प्रकट करना चाहिए OP9-DL1 monolayers पर फर्क लाइव, CD45 + कोशिकाओं का विश्लेषण (डी.एन.) -1 (CD44 + CD25 neg, सीडी 4 neg, सीडी 8 neg) और DN2 (CD44 + CD25 + सीडी 4 neg, सीडी 8 neg) चरण टी कोशिकाओं (चित्रा 7B एनजी>). सुबह 16 से, संस्कृतियों में छोटे, गोल, चमकदार कोशिकाओं की मात्रा में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है. OP9-DL1s, DN3 (CD44 neg, CD25 +, सीडी 4 neg, सीडी 8 neg) और DN4 (CD44 neg, CD25 neg, सीडी 4 neg, सीडी 8 neg) चरणों को टी सेल भेदभाव उत्पादों प्रगति पर. कुछ डी पी (सीडी 4 +, सीडी 8 +) टी कोशिकाओं को भी सुबह 16 (चित्रा 7B) द्वारा उभरते शुरू कर सकते हैं. HPCs OP9 पर कोशिकाओं, डी पी टी कोशिकाओं और एक सकारात्मक (सपा) सीडी 8 + टी कोशिकाओं वर्तमान की बड़ी मात्रा में (वहाँ होगा OP9-DL1-mESC सह संस्कृति की सुबह 20 से दिन में 16 से बी कोशिकाओं (CD19 +) उपज वरीयता प्राप्त चित्रा 7B). 8 चित्रा ऊपर प्रक्रियाओं की महत्वपूर्ण कदम सारांश एक चित्र, और सह संस्कृति के दौरान सुझाव दिया विश्लेषण समय अंक प्रदान करता है.

ghres.jpg "/>
एक MEF monolayer (100x बढ़ाई) के शीर्ष पर बढ़ undifferentiated mESCs (तेज धार कालोनियों) की संख्या 1 चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवि.

चित्रा 2
चित्रा 2:. OP9 monolayer confluency के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवियों (ए) निम्नतम और सह संस्कृति बीतने / बोने (40x बढ़ाई) के लिए उचित (बी) उच्चतम confluency स्तर एक से अधिक मिला हुआ OP9 monolayer (40x बढ़ाई (सी) उदाहरण. adipocyte गठन (युक्त बड़े, पुटिका, कोशिकाओं के साथ). (डी) से अधिक मिला हुआ OP9 monolayer (200X बढ़ाई)).

चित्रा 3
चित्रा 3: चरण विपरीत microscopसह संस्कृति की "सुबह 5" में mesoderm तरह कॉलोनी गठन के वाई छवियों. (ए)> 90% mesodermal कॉलोनी भेदभाव के साथ सह संस्कृति प्लेटों के 40X और (बी) 100X देखा गया. ये प्लेटें दिन 5 पारित होने के लिए तैयार हैं. हस्तांतरण (सी और ई, 40X बढ़ाई, डी और एफ, 100X बढ़ाई) से पहले 1-2 दिन स्थगित की आवश्यकता है कि दिन 5 सह संस्कृति प्लेटों की (सीएफ) उदाहरण.

चित्रा 4
चित्रा 4: सह संस्कृति की सुबह 5 पर mesoderm तरह कॉलोनी संरचनाओं की विविधता के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवियों (क) "खड्ड" या के रूप में भेजा कॉलोनी आकारिकी (बी) में भेजा कॉलोनी आकारिकी. "गाड़ी का पहिया." "स्टारबर्स्ट" या "पुष्पक" (200X बढ़ाई) के रूप में.


एक OP9 monolayer (40x बढ़ाई) पर छोटे, गोल, चमकदार HPCs के समूहों के साथ दिन 8 सह संस्कृति प्लेट की चित्रा 5 चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवि.

चित्रा 6
चित्रा 6:.. दिन से बाधित अधिक सह संस्कृति दिवस 8 पर HPCs संग्रह के बाद OP9 monolayer (एसी) HPCs फसल के लिए सावधान धोने के बाद OP9 monolayer के विघटन की उचित सीमा (डी) एक OP9 monolayer का एक उदाहरण दिया गया है कि 8 एचपीसी कटाई प्रक्रिया.

चित्रा 7
चित्रा 7: प्रतिनिधि फ्लो (FACS) के दौरान विशेष समय बिंदुओं पर विश्लेषण करती हैइन विट्रो में mESC भेदभाव. (ए) erythroid (बाएं), monocytic (मध्य) और बी सेल के लिए धुंधला (दाएं) दिन 12 या संकेत के रूप में 16 mESC-OP9 सह संस्कृति के उत्पादों. (बी) के संकेत समय बिंदुओं पर टी कोशिकाओं के विकास के लिए धुंधला हो जाना mESC-OP9-DL1 सह संस्कृति. Immunophenotypes के विस्तृत विवरण के लिए पाठ देखें.

चित्रा 8
MESC-OP9 सह संस्कृति प्रक्रिया के इस कदम से 8 चित्रा आरेख. (ए) सह संस्कृति के पहले आठ दिनों की कुंजी सेल हस्तांतरण कदम. शून्य और पांच संकेत कर रहे हैं दिनों में OP9 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की अनुमानित संख्या. (बी) सुबह 8 स्थानांतरण कदम और cytometry सह संस्कृति की कुंजी timepoints पर प्रवाह से पता चला की उम्मीद सेलुलर भेदभाव उत्पादों. Immunophenotypes के विस्तृत विवरण के लिए पाठ देखें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OP9-DL1 सह संस्कृति प्रणाली स्टेम कोशिकाओं से रक्त कोशिका प्रकार की विकास के दौरान विभिन्न जीन उत्पादों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है. 8,12,13 यह भी जीन विनियामक डीएनए के समारोह का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी मॉडल साबित हो गया है सेलुलर भेदभाव के दौरान. 9,14 समय और hematopoiesis में कई बुनियादी सवालों का पता है कि प्रयोगों की लागत में काफी बचत कर सकते हैं उपज पूरे माउस मॉडल के लिए एक विकल्प के रूप में इस दृष्टिकोण का उपयोग करना. हालांकि, इन उद्देश्यों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन इन प्रक्रियाओं में इस्तेमाल किया जाएगा कि mESC क्लोन के बीच संभावित परिवर्तनशीलता के संज्ञान की आवश्यकता है. प्रकाशित प्रोटोकॉल के समय औसत से expectable है, अच्छी तरह से बनाए रखा, गैर चालाकी mESC लाइन. 7 इसके अलावा, mESC क्लोन आम तौर पर उच्च गुणवत्ता के हैं और OP9 सह संस्कृति में बहुत मजबूती के साथ प्रदर्शन करेंगे काइमेरिक चूहों की पीढ़ी के लिए चयनित . दूसरी ओर, mESC क्लोन स्थिर से सीधे उभरतेएक ectopically एकीकृत transgene साथ अभिकर्मक औसत से नीचे औसत से लेकर प्रारंभिक भेदभाव दक्षता की डिग्री अलग प्रदर्शित करेगा. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल विट्रो में hematopoiesis की प्रेरण से पहले इन संभावित मतभेद बाहर भी सुबह 5 बीतने के कदम का एक सामरिक 1-2 दिन की देरी के लिए प्रदान करता है.

सुबह 8 बीतने इस प्रोटोकॉल का निष्पादन त्रुटि के लिए सबसे संभावित है, जिस पर कदम है. धैर्य, अभ्यास और सावधान अवलोकन OP9 monolayer व्यवधान जबकि कम से कम एचपीसी फसल का अनुकूलन कि तकनीक विकसित करने के लिए एक सक्षम हो जाएगा. कुंजी दिन 5 और सुबह 8 कदम के अलावा, महत्वपूर्ण पैरामीटर प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के लिए (जैसा कि ऊपर वर्णित विशेष रूप से OP9 कोशिकाओं,) सूक्ष्म सेल संस्कृति रखरखाव और विशेष ध्यान शामिल है. सबसे महत्वपूर्ण अभिकर्मक FBS है. FBS की अलग बहुत से इस प्रक्रिया का समर्थन करने की क्षमता में स्पष्ट रूप से अलग अलग होंगे. एकाधिक बहुत सारे ओ में परीक्षण किया जाना चाहिएrder इस परख में मजबूत भेदभाव निकलेगा जो निर्धारित करने के लिए.

यह सह संस्कृति प्रणाली की अपनी सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, इस मॉडल एक सकारात्मक सीडी 4 कोशिकाओं के भेदभाव का समर्थन नहीं करता. इसका एक कारण यह OP9 कोशिकाओं में प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (MHC) वर्ग द्वितीय प्रतिजन प्रस्तुति बुनियादी ढांचे की अभिव्यक्ति का अभाव है. MHC वर्ग द्वितीय द्वारा एंटीजन की 1 कोशिका की सतह प्रस्तुति सीडी 4 सपा कोशिकाओं के समुचित विकास के लिए आवश्यक है. उभरने करते हैं कि सीडी 8 सपा कोशिकाओं परिपक्व और अपरिपक्व सीडी 8 सपा thymocyte चरणों का एक मिश्रण का प्रतिनिधित्व करते हैं. 1 इसके अलावा, mESC का सफल प्रत्यारोपण एक माउस में टी सेल progenitors व्युत्पन्न भ्रूण Thymic अंग संस्कृति के माध्यम से पहले पारित होने की आवश्यकता है. 1 फिर भी, इस तकनीक को साबित किया है इसके वी में पता लगाने के लिए पहले से ही संभव हो गया है कि रक्त और प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास में दोनों सेलुलर और आणविक सवालों का एक शक्तिशाली खोजी दृष्टिकोण के रूप में वादाइवो. इस प्रकार, एक तरफ प्रायोगिक पशुओं के उपयोग को कम करने के व्यापक प्रभाव पड़ेगा इन सवालों पर अधिक तेजी से प्रगति, OP9-ईएससी सह संस्कृति प्रणाली की व्यापक अपनाने बनाने के लिए एक उपन्यास रास्ता प्रदान करने से.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 15-013-CV
Stem cell qualified FBS Gemini 100-125 Heat inactivated
Penicillin/Streptomycin Corning 30-002-CI
L-alanyl L-glutamine Corning 25-015-CI
HEPES buffer  Millipore TMS-003-C
Non-Essential Amino Acids ThermoScientific SH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) Life Technologies  15750-060
β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS Life Technologies  21985-023
Filter Unit Millipore SCGPU05RE 0.22 μm PES membrane
Cell Culture Grade Water Corning 25-055-CM
α-MEM  Life Technologies  12000-022 Powder, reconstitute per manufacture recommendation
Sodium bicarbonate  Sigma S5761-500G
FBS ThermoScientific SH 30396.03 Testing of individual lots required 
Dimethyl Sulphoxide  Sigma D2650
Recombinant Human Flt-3 Ligand R&D Systems 308-FK
Recombinant Murine IL-7 PeproTech 217-17
LIF  Millipore ESG1107
Utrapure water with 0.1% gelatin Millipore ES-006-B
MEFs mitomycin C treated Millipore PMEF-CF Any mitotically arresteded MEFs can be used
DPBS Corning 21-031-CV
Cell strainer (40 μm) Fisher 22363547
Tissue culture dish 100 x 20 mm BD Falcon 353003
Multiwell 6-well BD Falcon 353046
1.5 ml microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
15 ml centrifuge tubes BD Falcon 352096
50 ml centrifuge tubes BD Falcon 352070
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap BD Falcon 352235 Tubes for FACS 
ES R1 cells ATCC SCRC-1011
OP9 cells Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).
OP9-DL1 cells      Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory.
FlowJo software  Tree Star FACS data analyses
Flow Cytometer BD FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  2. Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
  4. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  5. Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
  6. de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
  7. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
  8. Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
  9. Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
  10. Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
  11. Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
  12. de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
  13. Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
  14. Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 92 माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं, OP9 कोशिकाओं डेल्टा की तरह 1 (DLL -1) ligand पायदान hematopoiesis लिम्फोसाइटों टी कोशिकाओं
टी कोशिकाओं की व्युत्पत्ति<em&gt; इन विट्रो</em&gt; माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kučerová-Levisohn, M.,… More

Kučerová-Levisohn, M., Lovett, J., Lahiji, A., Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C., Ortiz, B. D. Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (92), e52119, doi:10.3791/52119 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter