Protocol
문화 미디어, 사이토 카인 및 젤라틴 판의 1 준비
- 높은 포도당과 피루브산 나트륨과 이글의 중간 (DMEM) 둘 베코의 변형 례를 사용하여 ES 세포 매체를 준비한다. 1 % HEPES 버퍼, 1 % 비 필수 아미노산, 0.1 % 겐타 마이신 (50 ㎎ / ㎖) 및 0.1 % (태아 혈청 (FBS)를 공인 20 % ESC, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L-글루타민을 추가 55 μM) β-머 캅토 에탄올. 여과에 의해 ES 세포를 멸균 매체.
- 제조업체의 지침에 따라 분말 알파 최소 필수 중간 (α-MEM)의 1 L함으로써 OP9 미디어를 준비합니다. 20 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. 혼합하는 반전. 이 500 ㎖의 분취 액으로 여과하여 멸균.
참고 : 분말로 만든 미디어의 사용은 권장 개선 OP9 세포의 유지 보수 및 시험 관내 분화 결과를 얻을 가능성이있다. 이 방법은 우리의 표준 절차가되었다. 그러나, 우리는 그쪽에주의t 우리는 시간에 적절한 성공을 미리 만들어진 액체 α-MEM을 사용했다. - 90 % FBS 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 추가하여 미디어를 동결 준비합니다. 부드럽게 소용돌이 여과 소독. 4 ℃에서 보관하십시오.
- 10 μg / ml의 완전한 OP9 미디어에서 인간 재조합 FLT-3 리간드 (FLT-3L)을 용해하여 2,000x FLT-3 리간드 (10 μg / ㎖)을 준비합니다. -80 ° C에서 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 및 저장. 안정성 및 저장에 대한 공급 업체의 권장 사항을 따르십시오.
참고 : FLT-3L의 안정성 (4 ° C 또는 3개월 -80 ° C에서의 1 개월) 짧습니다. - 전체 OP9 미디어를 사용하여 1,000 배 IL-7 (1 μg / ㎖)를 준비합니다. -80 ° C에서 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 및 저장. 안정성 및 저장에 대한 공급 업체의 권장 사항을 따르십시오 (IL-7은 -80 ° C에서 최대 12 개월 동안 안정적이다).
- LIF의 난의 열 일곱 단위의 1:10 희석 1,000 배 백혈병 억제 인자 (LIF) (10 μg / ㎖)를 준비N ES 세포 매체. 4 ℃에서 보관 나누어지는. 나누어지는 병에 제조업체가 제공하는 유효 기간을주의해야합니다.
참고 : 제품이 제조 일로부터 농축 또는 희석 된 형태로 적어도 18 개월 동안 안정적이다. - 젤라틴 6 - 웰 플레이트를 준비하여 6 - 웰 플레이트의 각 웰에 1.5 ml의 0.1 % 젤라틴 용액을 추가한다. 코팅에 적어도 30 분 수에 뚜껑 실온에서 멸균 후드에서 요리를 둡니다. 요리는 가습 인큐베이터 하룻밤에 남아있을 수 있습니다. 바로 세포 파종 전에 남은 젤라틴 용액을 제거합니다. 젤라틴 용액이 완전히 우물에 건조시키지 마십시오.
2 준비 및 피더 세포 및 마우스 배아 줄기 세포의 유지 보수 (MESC)
주 : 5 % CO 2 가습 37 ° C 배양기에서 모든 세포를 품어.
- 해동 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF)
- 냉동 바이알 (~ 5 × 10 6 빠른 해동
- 점차적으로 동결 매체로부터 DMSO를 희석 드롭 현명한 방식으로, 해동 세포에 ES 세포 매체의 8 ML을 추가합니다.
- 5 분 동안 4 ° C에서 400 X g에서 원심 분리기 세포. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 ES 세포 미디어 3 ㎖에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 미리 예열 ES 세포의 미디어 (33)를 가하여 50 ㎖의 원심 분리 관을 준비한다. 36 ml의 최종 볼륨을 가지고 재 부유 MEFs의 3 ML을 추가합니다.
- 이 젤라틴 6 웰 플레이트의 각 웰에 재 부유 MEFs 3 ㎖를 배포합니다. 세포가 부착하고 그들에 mESCs 시드 전에 확산 할 수 있도록 최소 6 시간 동안 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 자신의 미디어를 2-3 일마다 변경되는 경우 이러한 mitotically 체포 피더 층은 초기 시딩 후 몇 일 동안 사용할 수있다.
주 : 갓 체포 MEFs도 사용할 수 있습니다. </ OL>
- 시드 mESCs
- 37 ° C의 물을 욕조에 얼어 붙은 MESC 클론 유리 병을 빠른 해동 2.1.1-2.1.3에 설명 된대로 세포를 준비합니다.
참고 : 우리는 6 웰 플레이트의 합류 우물에서 MESC의 두 병을 동결. - (단계 2.1.5에서 준비) 체포 MEF 단일 층과 6 - 웰 플레이트의 (MESC 클론 당) 한 우물에서 용지를 제거하고 MEF 단일 층의 상부에 mESCs의 3 ml의 씨앗. 1,000 배 LIF (10 NG / ㎖)의 3 μl를 추가합니다. 인큐베이터에 요리를 돌려줍니다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 얼어 붙은 MESC 클론 유리 병을 빠른 해동 2.1.1-2.1.3에 설명 된대로 세포를 준비합니다.
- ES 세포 유지 보수 및 트립신 매개 통로
참고 : MESC의 합류에 따라 변경 매일 미디어, 또는 분할. 최적의 수확 및 분할 / 재 판 세포 매일.- ES 세포 미디어를 제거하고 PBS의 2 ㎖로 mESCs을 씻는다. PBS를 제거합니다. 0.25 % 트립신의 1 mL를 넣고 3 ~ 5 분 동안 37 ° C에서 배양한다.
- 트립신 세포를 수집하고 15 ㎖의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 적극적 m의 덩어리를 분리시킨 세포 현탁액을 피펫ESCS. 트립신을 중화하기 위해 세포 현탁액에 완전한 ES 세포 미디어 2 ML을 추가합니다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 400 X g에서 스핀 세포. 상층 액을 제거하고 3 ML의 ES 세포 미디어에서 펠렛을 재현 탁.
- 준비 체포 MEF 단일 층을 포함하는 6 - 웰 플레이트에서 용지를 제거합니다. 각 웰에 ES 세포의 미디어 3 ㎖ 중의 (원하는 분할 비에 기초하여) 세포 현탁액의 적절한 양을 추가하는 시드된다. 1,000 배의 LIF의 3 μl를 추가합니다. 이일에 통과 할 수있는 상태가됩니다 6 : 합류 MESC 잘 일을 분할합니다.
- OP9 / OP9-DL1 세포 유지
- OP9 세포의 유리 병을 해동 (단계를 수행 2.1.1-2.1.3 OP9 미디어를 사용)
- 10cm 조직 배양 접시에 7 ML의 OP9 미디어를 추가합니다. 플레이트를 통해 세포를 배포, 드롭 현명한 방식으로 재현 탁 세포의 3 ML을 추가합니다. 배양기에서 하룻밤 세포를 놓습니다.
- 다음날 OP9 세포의 합류를 확인합니다. 요리는 많은 죽은 부동 세포를 포함하는 경우, 레모미디어를했습니다 신선한 OP9 미디어 10 ㎖를 추가합니다. 거의 완전 합류가 관찰되지 않은 경우 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. 네 근처에 합류 OP9 단층 : 분할 1 (트립신을 사용하여).
주 : 플레이트에 대한 이일에 다시 합류 동일한 수준에 도달해야한다. 오버 합류하게 OP9 세포를지지 않도록주의 해주십시오. - 확장 주식으로 OP9 세포의 조기 구절을 동결.
참고 : 우리가 합류 10cm 접시 근처에 하나에서 OP9 세포의 두 병을 동결. 확장 주식의 각각의 바이알에 대해서는 나중에 더 MESC 공동 문화 실험에 사용되는 작업 주식을 만들 전파 될 수있다. 온도 변동에 부정적인 정지의 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 오히려 -80 ° C 냉동고에 비해 액체 질소에 냉동 모든 OP9의 주식을 유지합니다.
3 OP9-DL1 공동 배양 절차
- 공동 배양 준비
- 약 일주 전에 공동 문화의 시작에, MEFs, mESCs 및 OP9 전지 작업 STO 해동CKS. OP9-DL1 세포를 공동 배양 일 8까지 필요하지 않기 때문에, 공동 문화 개시 후 처음 삼일 동안 OP9-DL1 세포를 해동. 유지 또는 필요에 따라 모든 셀을 동결.
- 실험 규모에 기초하여 일 0 공존 배양에서 80 % 합류점에 도달 제조 OP9 세포 단층을 가진 10cm 플레이트의 초기 수를 결정 (예 MESC 클론의 수는 차별화되는 공존 배양 시점의 개수 ) 분석. 4 일 : 공동 문화를 준비하기 위해 한 사이 OP9 세포의 합류 접시 근처에 분할 6 이일을 앞두고 단일 층이 필요합니다 때의.
참고 : 하나는 ESC 클론 당 적어도 하나의 플레이트가 필요합니다. 5 일 경과 6 개의 판을 씨앗에 충분한 세포를 산출한다 0 일에 (아래 설명 참조) 일반적으로, ESC 단일 클론은 단일 플레이트에 시딩. 매일 5 판은 하나의 후속 분석 시점을 가능하게 할 것이다. - OP9 단일 층이 지속적으로 공동 문화의 통과를 위해 필요한 것입니다 때문에,주의 항상 터 유지 보수에 걸릴공동 문화와 병렬로 추가 OP9 배양 플레이트의 적절한 수있다.
- 일 0 : 공동 문화의 개시
- 2.3.1-2.3.4에서와 같이 MESC를 수집합니다. 세포를 계산합니다.
- 각 MESC 클론은 접시 당 OP9 미디어 10ml에 5 × 10 4 MESC를 준비합니다.
NOTE :. 우리가 사용되지 않았지만, 우리는 대안 매체는 α-MEM, 10 % FBS로 이루어진, 5 × 10 β-머 캅토 에탄올이 또한 분화의 공동 배양에 사용하기 위해보고되었다 -5 M 10 참고 - OP9 요리에서 이전 용지를 제거하고 접시에 골고루 세포를 배포 돌보는 요리에 MESC 현탁액의 10 ML을 추가합니다. 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다.
- 주 3 : 미디어 변경
- 인큐베이터에서 요리를 제거하고 현미경으로 관찰한다. 콜로니의 광택을 잃게하고 평평하게 나타납니다 시작해야한다.
- 요리에서 용지를 제거하고 부드럽게 신선한 OP9 10 ㎖를 추가미디어.
- 인큐베이터에 공동 배양 접시를 돌려줍니다. 시각 콜로니 80-90 %의 시각적 중배엽 같은 형태를 표시 ~까지 수행되지 않아야 다음 통로 (5 일)에 대한 OP9 피더 단층 제제의 타이밍을 알리는 일일 중배엽 형 콜로니 형성을 모니터. 5 일째 세포 전사 공정의 최대 연기 2 일이다.
- 제 5 일 : 사전 도금 트립신 매개 통로입니다.
참고 : 최적의 합류 OP9 세포를 사전에 10cm 요리의 적절한 수를 준비합니다. 공동 문화 시각적 단계 3.3.3에 설명 된 기능을 표시하는 경우에만 다음 단계를 진행합니다 (또한 대표 결과 참조).- 공동 배양 접시에서 미디어를 꺼내십시오. 씻어 4 ml의 PBS를 추가합니다. PBS 소용돌이 및 제거합니다. 0.25 % 트립신의 4 mL를 넣고 ~ 5 분 동안 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
- 돌보는 것은까지 과도한 기포를 도입하지 격렬한 피펫 팅함으로써 세포를 트립신의 층을 방해균질 주로 단일 세포 현탁액을 얻을 수있다.
- 전체 OP9 미디어의 4 mL를 넣고 피펫으로 혼합한다. 30 분 동안 인큐베이터에서 비어있는 새 10cm 접시와 장소에 전송 세포 OP9 세포가 접시에 부착 할 수 있도록합니다. 이러한 "도금 전"단계는 공동 배양의 다음 단계로 이송 OP9 세포의 수를 감소시킨다.
- 40 μm의 셀 스트레이너 50 ㎖의 원심 분리기 튜브를 준비합니다.
- 사전 도금 접시에서 비 부착 세포를 수집하고 튜브에 세포 스트레이너를 통해 전달합니다. PBS의 6 ㎖로 가볍게 요리를 세척하고 뒤에 첨부 된 OP9 세포를 떠나, 같은 여과기를 통과.
- 4 ° C에서 400 × g으로 5 분 원심 분리기 세포. 상층 액을 제거하고 완전한 OP9 미디어의 3 ㎖에 펠렛 세포를 재현 탁. 세포를 계산합니다.
- 최적의 합류 OP9 세포 10cm 플레이트에서 용지를 제거합니다.
- 각 분석 시점 들어 OP9 모노에 5 × 105 세포를 시드10 ㎖의 최종 부피의 층을 포함한다.
- 5 NG / ML 인간 재조합 FLT-3L를 추가하고 배양기에서 접시를 놓습니다.
- 8 일 : 조혈 전구 세포 (HPC) 컬렉션
참고 :이 단계를위한 시간들이 될 수 있도록 사전에 OP9 또는 OP9-DL1 세포 단일 층과 6 - 웰 플레이트의 적절한 수를 준비 ~ 80 %의 합류.- 40 μm의 여과기와 50 ㎖의 원심 분리기 튜브를 준비합니다.
- 인큐베이터에서 요리를 제거하고 현미경으로 관찰한다. HPC의 반짝이 클러스터는 느슨하게 OP9 단층에 연결해야합니다. 피펫 OP9 단층과 접시에 기존 미디어를 세척 (그러나 지나치게 방해하지 않음)에 의해 가능한 한이 세포의만큼을 수집합니다. 거품을 방지하기 위해, 항상이 HPC 수집 / 세척 단계에서 피펫의 끝에서 용지의 최소 1 ml에 둡니다.
- 튜브에 40 μm의 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. 만약 모든 HPC의 동일 판에 8 ㎖의 PBS를 추가하고 현미경으로 확인 우리다시 수집. 더 강력한 세척으로 (필요한 경우) PBS로 세척 / 수집 단계를 반복합니다. 이미 동일한 플레이트에서 세포를 함유하는 튜브에 세포 스트레인.
- 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기 세포.
- 5 NG와 OP9 미디어 (판은 5 일에 시드 당) 3 ML의 마스터 믹스를 준비 / ㎖ FLT-3L 1 NG / ml의 IL-7.
- FLT-3L + IL-7 마스터 믹스 OP9 미디어에서 (처리 된 각 10cm 접시 3 ml)에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. OP9 세포와 6 웰 플레이트의 한 우물에 각 판에서 수집 된 세포를 전송합니다.
- , 단구, B 세포 계통 또는 적혈구 세포를 향해 이용시 OP9 세포 상에 수집 된 세포를 시드하기 위해. T 세포를 유도하기 위해, OP9-DL1 세포 단층 상에 세포를 시드.
- 인큐베이터에 6 - 웰 플레이트를 놓습니다.
- 10 일 : 미디어 변경
- 각각 별개 MESC 클론 피더 셀형 combina 대해 15 ml의 원심 분리 튜브를 준비공동 문화 기.
- FLT-3L의 5 겨 / ㎖와 IL-7의 1 겨 / ㎖로 OP9 미디어의 마스터 믹스를 준비합니다. 각 웰에 3 ML을 준비합니다.
- 부드럽게 같은 ESC 복제 피더 세포 유형의 조합을 포함하는 여러 우물에서 미디어를 결합 6 웰 플레이트의 각 웰에서 미디어를 수집합니다.
- 각 웰에 OP9 미디어 마스터 믹스 2 ㎖를 (3.6.2 참조)에 추가합니다.
- 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 동안 400 X g에서 수집 된 미디어. 물론 당 OP9 미디어 마스터 믹스 1 ㎖의 각 펠렛 (볼 경우 매우 작은) (3.6.2 참조) 원래 단계 3.6.3에서 수집을 상층 액을 제거하고 재현 탁.
- 다시 각 웰 미디어가 원래 3 ml의 각 웰에 볼륨을 가져 수집되는 세포에 1 ㎖를 배포합니다. 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.
- 주 12 : 아니 트립신 통로
참고 :이 초 동안 그들은 최적의 시간에 컨 플루 언트 될 수 있도록 사전에 OP9 또는 OP9-DL1 세포를 6 웰 요리의 적절한 수의 준비스탭. 날 (12)은 현상 적혈구, 단핵구, 및 초기 단계의 T 세포의 유세포 분석에 적합하다.- 마스터 믹스 FLT-3L의 5 겨 / ㎖와 IL-7의 1 겨 / ㎖로 OP9 미디어 (공동 문화에 계속 각 웰 3 ㎖) 준비합니다.
- 40 μm의 여과기 (공동 문화의 각 ESC 복제 피더 세포 유형의 조합 일)과 50 ㎖의 원심 분리기 튜브를 준비합니다.
- 적극적으로 잘에 (단일 층을 포함하여) 모든 세포를 해리하는 각도에있는 기존 미디어를 피펫. 단일 세포 현탁액을 닮은 상태가 될 때까지 강력한 피펫 계속합니다.
- 튜브에 스트레이너를 통해 수집 된 세포를 전달합니다. 남아있는 모든 세포를 씻어 수집하기 위해 각 웰에 PBS의 3 ML을 추가합니다. 같은 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. 동일한 클론 ESC 피더 세포 유형 조합을 포함하는 다수의 웰에서 세포 수확기.
- 사용 된 셀 스트레이너를 취소하고 잘 하나에 나누어 상당을 제거 (~ 6 ml)을 원하는에 대한(또는 다른) 유동 세포 계측법은 일에 실시되는 분석한다. 사용하기 전에 얼음이 분주을 저장합니다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기 세포. 상층 액을 제거합니다. 물론 당 마스터 믹스의 3 ㎖에 50 ㎖의 원심 분리기 튜브에서 펠렛을 재현 탁은 다시 시드합니다. 적절한 피더 세포 유형에 각 세포 현탁액을 잘 당 3 mL를 넣고 배양기에서 접시를 놓습니다.
- 주 14 : 미디어 변경
- 3.6 절에 설명 된 단계를 따릅니다.
- 주 16 : 아니 트립신 통로
참고 :이 단계에서 사전에 최적으로 합류 OP9 또는 OP9-DL1 세포를 6 웰 요리를 준비합니다.
참고 : 유동 세포 계측법 B 림프구 및 중간 단계의 T 세포 분석을위한 날 (16)가 이상적입니다.- 3.7 절에 설명 된 단계를 따릅니다.
- 주 18 : 미디어 변경
- 3.6 절에 설명 된 단계를 따릅니다.
- 주 20 : 아니 트립신 통로
주 : 일 20 전유동 세포 계측법에 대한의 이상적인는 T 세포를 개발 최종 단계에 중간 분석.- 3.7 절에 설명 된 단계를 따릅니다. 원하는 경우, 세포에게 과거의 일 (20) 교류 매체의 변화를 차별화 수행하고 더 트립신은 림프구의 확장 속도를 매일 모니터링, 모든 이일 통로 없습니다.
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Representative Results
LIF의 존재 MEFs에 성장하면 mESCs는 미분화 상태로 유지 될 수있다. 이상적인 조건에서, 그들은 위상차 현미경에 빛나는 후광에 둘러싸인 세포의 소형 식민지 (그림 1)로 나타납니다. 이러한 문화는 매일 모니터링해야합니다. 세포의 합류에 따라 미디어가 변경 될 수 있거나 세포를 분리 할 수있다. 이웃 MESC 식민지는 서로의 접점에 와서는 안된다. 미분화 mESCs의 정상적이고 건강한 배양은 시험 관내 T 세포 분화를위한 필수적인 출발점이다. 공 배양을 시작하면, 그것은 세포가 혼잡하지 않고 완전히 합류하는 것이 좋습니다. OP9 단일 층에 세포를 파종 수확 세포의 대부분이 (오히려 피더 세포보다) MESC 그래서입니다. 합류의 주요 차이 일 0에서 차별화 할 수있는 다양한 MESC 클론 사이에서 관찰되는 경우가 TIS에 미리 부착하여 MEFs을 제거하는 가장 좋은 것입니다공동 문화 시드를위한 mESCs를 계산하기 전에 (전체 ES 세포 미디어를 사용하여 단계 3.4.3-3.4.6에서와 같이) 고소 배양 접시.
(2.4 절에 설명 된대로) OP9 세포는 물론 이전에 공동 문화의 개시를 유지해야합니다. 또한,이 OP9 세포를 장기간 배양 및 / 또는 증식 속도의 뚜렷한 증가와 함께 해당 속성의 일부를 잃을 것으로 생각된다 7 일 이후 분할 비율 방지 :. OP9 세포의 유지 보수시 5, 6 주 후에 연속 OP9 문화를 버리고, 이 함정을 피할 수 있도록 도와 줄 것입니다.
공 배양 (일 0, 5, 8, 12, 16)의 초기 셀 시드 및 세포 전사 단계에서, OP9 단층. 합류점의 최적 범위 내에 있어야 2 로우 (도 2A)를 보여준다 높은 (도 2B) 공동 문화의 단층으로 사용하기에 좋습니다 OP9 세포의 합류의 범위 끝입니다. 오버 합류 판의 예를 도시한다우레의 2C. 최적의 합류를 유지하지 않으면 많은 양에서 음으로 공동 문화에 영향을 미칠 수있는, 지방 세포 (그림 2D)의 형성을 유도 할 수 있습니다.
중배엽 형성을 OP9 세포 선호하기 때문에 일 0에서 공동 문화 OP9 세포보다는 OP9-DL1 세포에서 시작됩니다. 세포는 T 세포의 생산을 유도하는 일 8에 시작 OP9-DL1 세포 단일 층에 도금되어 있습니다. 일부 MESC 클론 시각적 공동 문화 (그림 3A-B)의 일 5에 의한 중배엽 같은 식민지의 강력한 양적 (~ 90 %) 형성을 표시하는 동안, 다른 사람은이 단계 (그림 3C-F)에서 지연을 표시 할 수 있습니다. 현미경,이 분석에서 파생 된 중배엽 같은 식민지 가변적 수레 바퀴 또는 분화구 (그림 4A) 또는 육각형 또는 작은 꽃 (그림 4B)를 닮은으로 설명되었다.
게시 된 OP9-DL1 프로토콜은 양적 중배엽의 견적의 규범을 반영하면서공동 문화의 날 (5)에 의해 기는 7 우리는 모든 ESC 클론이 기간 내에 그 규범을 달성 할 것을 찾을 수 있습니다. 이 경우, 우리는 5 일에 매체를 변경하고 "일 오"셀 수확 / 전송 프로토콜을 수행하기 전에 추가 1-2일을 기다립니다. 이러한 지연의 목적은 앞서 전송 될 시각적으로 중배엽 ~ ES 세포의 콜로니를 80 ~ 90 %로 허용하는 것이다. 그것은이 80~90%의 그림은 공동 배양 접시에서 식민지 형태의 간단한 위상차 현미경 검사에 의해 엄격하게 시각적 기준 식별을 반영하고 명확하게 제시하는 것이 중요하다. 그것은 단지 그림 4에 표시된 것과 유사 ESC 식민지의 비율을 의미한다. 그것은 일부 ESC 클론도이 일 지연 후,이 시각 기준에 도달하지 않을 수 있습니다. 전술 한 바와 같은 경우에는, FLK-1 + 세포 유세포 분류 셀을 형성하여 혈액 중배엽 전구체 풍부 할 수있다. 어떤 경우 6,11, SA에 대한애 명칭 편의, 우리는 "시계를 다시"와 "일 5"로 중배엽 같은 식민지 이전의 일을 참조
여러 ESC 클론 병렬로 구분되는 경우, 다른 사람이 뒤쳐 동안 일부 공동 문화가 시간에 일 5 통과 할 수있는 상태가됩니다 수 있습니다. 이 경우에, 느린 클론 다른 잡을 때까지 모든 공동 - 배양의 통과를 지연시키는 것이 바람직하다. 지연은 "시간에"공동 문화에 어떤 해를하지 않는 것,하지만 느린 클론 큰 거래의 후속 차별화의 도움을받습니다.
8 일 (즉, 중배엽 식민지 전송 후 3 일)의 HPC의 출현과 축적을 본다. HPC의 느슨하게 OP9 피더 세포 (그림 5)에 부착되어 세포의 반짝 클러스터로 볼 수 있습니다. 유지하면서 조심 세척 절차는 펫 및 접시에 미디어를 사용하여 분리하고의 HPC를 수집합니다OP9 단층 대부분 그대로 (그림 6A-C). 이것은 아마도 프로토콜의 가장 민감한 기술 공정이다. 그것은 세포층의 중단을 최소화의 HPC의 최대 수확의 원하는 균형을 달성하기 위해 적절한 운동과 미디어 토출 압력을 찾기 위해 약간의 연습이 필요합니다. OP9 단층의 일부가 떨어져 리프트 경우 필터링. 그림 6D가 필요 이상으로 큰 단층 파괴로 이어지는 과도한 피펫 후 단일 층을 표시 한 후 모든 잃은 단층의 대부분이 40 μm의 나일론 망에 캡처되기 때문에 그것은 허용됩니다. 이 세척 단계 동안, 모든 HPC의 수집되었는지 여부를 현미경으로 확인하고, 세정 압력을 조절하는 것이 중요하다.
공동 배양의 진행은 유동 세포 계측법에 의해 모니터링 될 수있다. 특히 ESC의 비 - 적혈구 조혈 자손을 분석하기 위해, 살아있는 CD45 + 세포에 대한 제 1 게이트에 중요하다.분석에서 OP9 세포 밖으로이 단계 스크린, DAPI 또는 다른 핵 염색 염료의 사용은 생존 할 세포의 배제를 할 수있다. 일 12으로 작고 둥근, 빛나는 세포의 여러 클러스터를 볼 수 있어야합니다. 이것은이 단계에서 세포를 카운트 할 필요가 없다. 그러나 우리는 살고, 게이트 유동 세포 계측법 이벤트 카운트가 잘 일 12 공동 문화 당 1-3 × 10 5의 범위에서 전형적으로 그 관찰했다. 유동 세포 계측법은 적혈구를 얻을 것입니다 OP9 단일 층에 차별화 된 라이브 게이트 세포 (CD45의 NEG, TER119 +)와 단핵구 (CD45 +, CD11b를 하이) 계통 (그림 7A)의 분석합니다. CD4 / CD8 더블 네거티브 (Double Negative)의 특성 마커를 공개한다 OP9-DL1 단일 층에 차별화 라이브, CD45 + 세포의 분석 (DN) -1 (CD44 +, CD25의 NEG, CD4의 NEG, CD8의 NEG)와 DN2 (CD44 +, CD25 +, CD4의 NEG, CD8의 NEG) 단계의 T 세포 (그림 7B NG>). 날 (16)에 의해, 배양에서 작은, 라운드, 반짝이 세포의 양의 상당한 증가가있다. OP9-DL1s, DN3 (CD44의 NEG, CD25 +, CD4의 NEG, CD8의 NEG)와 DN4 (CD44의 NEG, CD25의 NEG, CD4의 NEG, CD8의 NEG) 단계에 T 세포 분화 제품 진행에. 일부 DP (CD4 +, CD8 +) T 세포는 16 일 (도 7b)에 의해 부상 시작할 수있다. 의 HPC는 OP9에 세포가, DP T 세포와 하나의 긍정적 인 (SP) CD8 + T 세포 선물을 많은 양의 (가있을 것입니다 OP9-DL1-MESC 공동 문화의 날 (20) 일 (16)에 의해 B 세포 (CD19 +)을 얻었다 시드 도 7B).도 8은 위의 절차의 주요 단계를 요약 한 도면, 및 공 배양 중에 제시된 분석 시점을 제공한다.
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MEF 단일 층 (100X 배율)의 상단에 성장 분화 mESCs (날카로운 식민지)의 그림 1 위상 대비 현미경 이미지.
그림 2 :. OP9 단층 자랄 때의 위상 대비 현미경 이미지 (A) 최저 및 공동 문화 통로 / 시드 (40 배 확대)에 대한 권장 (B) 최고 자랄 수준 오버 합류 OP9 단층 (40 배 배율의 (C) 예. 지방 세포 형성 (포함 된 대형 소포, 셀). (D) 오버 합류 OP9 단층 (200X 배율)).
그림 3 : 위상 대비 microscop공동 문화의 "일 오"에서 중배엽 같은 콜로니 형성 y의 이미지. (A)> 90 % 중배엽 식민지 차별화와 공동 배양 플레이트의 40X와 (B)의 100 배 전망을 제공합니다. 이 판은 5 일 통과를 위해 준비가되어 있습니다. 전송 (C & E, 40 배 배율, D & F, 100X 배율) 전 1~2일의 연기를 필요로 5 일 공동 문화 판 (CF) 예.
그림 4 : 공동 문화의 날 5에서 중배엽 같은 식민지 형성의 다양성의 위상 대비 현미경 이미지 (A) "분화구"또는 언급 된 식민지 형태 (B)에 언급 된 식민지 형태. "수레 바퀴." "스타 버스트"또는 "작은 꽃"(200X 배율) 등.
OP9 단일 층 (40 배 확대)에 작은, 라운드, 반짝의 HPC 클러스터와 8 일 공동 문화 판의 그림 5 단계 대조 현미경 이미지.
그림 6.. 일에 의해 방해를 통해 공동 문화 일 8 HPC의 수집 후 OP9 단층 (AC)의 HPC를 수확주의 세탁 후 OP9 단일 층의 중단 적절한 범위 (D) OP9 단층의 예되었음을 8 HPC 수확 절차.
그림 7 : 대표 유동 세포 계측법 (FACS)는 중 특정 시점에서 분석체외에서 MESC 차별화. (A) 적혈구 (왼쪽), 단핵구 (중간) 및 B 세포에 대한 염색 (오른쪽) 일 12이나 표시 등 (16)에서 MESC-OP9 공동 배양 제품. (B)의 표시된 시점에서 T 세포를 개발하기위한 염색 MESC-OP9-DL1 공동 문화. immunophenotypes에 대한 자세한 설명은 텍스트를 참조하십시오.
MESC-OP9 공동 문화 절차의 단계를 그림 8 다이어그램. (A) 공동 문화의 첫번째 팔일의 주요 셀 전송 단계. 제로 다섯이 표시되어 일에 OP9 세포에 접종 세포의 대략적인 수. (B) 일 8 전송 단계와 세포 계측법 공동 문화의 주요 timepoints에 흐름에 의해 검출 된 것으로 세포 분화 제품. immunophenotypes에 대한 자세한 설명은 텍스트를 참조하십시오.
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Discussion
OP9-DL1 공동 배양 시스템은 줄기 세포에서 혈액 세포 유형의 개발시 각종 유전자 산물의 역할을 연구하기 위해 이용되어왔다. 8,12,13 또한 유전자 조절 DNA의 기능을 연구하기위한 효과적인 모델을 입증 세포 분화 과정. 9,14 시간 및 조혈 많은 기본적인 질문을 해결 실험에서 상당한 비용 절감 효과를 얻을 수있는 전체적인 마우스 모델의 대안으로이 방법을 사용. 그러나 이러한 목적으로이 프로토콜의 적응이 절차에 사용되는 MESC 클론 사이의 잠재적 인 변동성 대해 인식이 필요합니다. 게시 된 프로토콜의 타임 라인이 평균에서 기대할 수있다, 잘 유지, 비 조작 MESC 라인. 7 또한, MESC 복제는 일반적으로 더 높은 품질의 아르와 OP9 공동 문화에 매우 견고하게 수행 키메라 생쥐의 발생으로 선택 . 한편, MESC 클론은 안정로부터 직접 나오는ectopically 통합 형질 전환 유전자를 가진 형질 전환은 평균에서 평균 이하에 이르기까지 초기 분화 효율의 다양한 각도를 표시합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 체외에서 조혈 유도하기 전에 이러한 잠재적 인 차이를 균등하게하는 일 5 통로 단계의 전략적 1-2일 지연을 제공한다.
8 일째 통로는이 프로토콜의 실행은 오류에 대하여 가장 가능성을 가지고있는 단계이다. 인내, 연습과주의 관찰 OP9 단층 중단을 최소화하면서 HPC 수확을 최적화하는 기술을 개발하는 일을 가능하게 할 것이다. 키 5 일 및 8 일 단계 이외에도 중요한 파라미터는 프로토콜에 사용되는 시약 (전술 한 바와 같이 특히 OP9 세포) 세포 배양 세심한 정비 및 특별한주의를 포함한다. 가장 중요한 시약은 FBS이다. FBS의 고유 한 많은이 절차를 지원하기 위해 자신의 능력에 현저하게 달라질 수 있습니다. 여러 많은 O를 테스트해야rder를이 분석에서 강력한 차별화를 낳는 확인합니다.
이 공동 문화 시스템은 한계가있다. 예를 들어,이 모델은 단일 양성 CD4 세포의 분화를 지원하지 않습니다. 이에 대한 한 가지 이유는 OP9 세포에서 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 II 항원 제시 인프라 발현의 부족이다. MHC 클래스 II에 의해 항원의 한 세포 표면 프레젠테이션 CD4 SP 세포의 적절한 발달에 요구된다. 등장 할 CD8 SP 세포가 성숙하고 미성숙 CD8 SP의 흉선 세포 단계의 혼합을 나타냅니다. 한 또한, MESC 성공적으로 이식 마우스로 T 세포 전구 세포를 유도 태아 흉선 기관 배양을 통해 이전에 통과해야합니다. 1 그럼에도 불구하고,이 기술이 입증 된 자사의 절에서 탐험 이전 만 가능했던 혈액과 면역 체계 개발에 모두 세포 및 분자 질문에 대한 강력한 조사 방식으로 약속IVO. 따라서, 따로 실험 동물의 사용을 감소시키는 광범위한 영향을 미칠 것이다 이러한 질문에 대한 빠른 진행, ESC-OP9 공동 배양 시스템의 광범위한 채택을 만드는 새로운 방법을 제공하는 것을.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
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