Abstract
תהליכים מובנים של פיתוח גלמי תסיסנית יכולים להזיז ולעוות את האפיתל עין בדרכים שהופכות את התאים בודד התנהגות קשה לעקוב אחר במהלך הדמיה תא חי. תהליכים אלה כוללים: סיבוב ברשתית, צמיחת תאים ותנועת האורגניזם. בנוסף, אי סדרים בטופולוגיה של האפיתל, כולל בליטות ועדינות קפלים לעתים קרובות הוצגו כגולם מוכן להדמיה, לעשות את זה מאתגר לרכוש תמונות בפוקוס של יותר מכמה האומטידיה במישור מוקד אחד. העבודה המתוארת כאן תרופות נושאים אלה, המאפשר ניתוח קל של תהליכים תאיים במהלך התפתחות העין גלמי דרוזופילה. גלמים כראוי מבוימים מסודרים במתקן הדמיה שניתן להרכיב בקלות ברוב המעבדות יוביקוויטין-DE-Cadherin:. GFP וGMR-GAL4 -driven UAS-α-קטנין: GFP משמשים כדי לחזות גבולות תא באפיתל העין 1 -3. לאחר deconvolution הואפנה לתמונות ניאון שנתפסו במטוסי מוקד מרובים, תמונות הקרנה מקסימליים נוצרות עבור כל נקודת זמן ומשופרת באמצעות תוכנת עריכת תמונות. אלגוריתמי יישור משמשים לייצוב תנועה מיותרת במהירות, מה שהופך קלה יותר בודדת התנהגות תא כדי לעקוב אחר.
Introduction
מתחם עין תסיסנית מאופיינת בהסדר הסטריאוטיפי של ~ 750 האומטידיה מופרדת על ידי חלת דבש-סריג של תאי פיגמנט אבזר 4,5. תאי פיגמנט אלה הם בדוגמת ידי שילוב מתואם של אירועים: תנועות תא מקומיות, צמיחת תאים, שינויים בצורת תא, ואפופטוזיס. הדמיה חיה של אפיתל זה מאפשר לאדם לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס אירועים אלה בהקשר תלת ממדים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ומוטרד.
בניגוד לפרוטוקולים קודמים 6,7, הטכניקה המתוארת כאן משלבת שיטה יעילה לייצוב תנועת רקמות זרות שלא יכול להיות מנותק מתהליך ההדמיה. שיטה זו משפרת את המחקרים של התנהגות תא באפיתל פיתוח תסיסנית העין גלמים - רקמה שגדלה, מסתובבת, ומשמרות במהלך ההדמיה. בנוסף de טכניקת תנועה-ההתייצבותscribed כאן יהיה שימושי לחקר תאים בהקשרים אחרים שבם תנועה זרות מתרחשת.
כדי להמחיש את גבולות תא בתחום רשתית דרוזופילה, קווים לטוס מהונדסים נוצרו המבטאים UBI-DE-Cadherin: GFP, כמו גם UAS-α-קטנין: GFP בשליטה של נהג עין ספציפית GMR-GAL4 1-3. השימוש בשני סמני קרום מתויג GFP מאפשר ההדמיה של גבולות תא באור בעוצמה נמוך יותר. זה ממזער את הנזק וphotobleaching רקמה בחשיפה חוזרת ונשנית לאורכי גל באנרגיה גבוהה, במסגרת שיעור מוגברת המאפשר ומשך סרט. כדי לשפר את היעילות של transgenes RNAi, UAS-DCR-2 שולב גם לקו זבוב שני 8.
בעדכון שלישי מפרוטוקולים קודמים, מתקן הדמיה פשוט שמורכב בקלות ברוב המעבדות מתואר. מנגנון זה מבטל את הדרישה ליש לי r הדמיה מיוחדIG שנוצר על ידי 'חנות המכונה "של אוניברסיטה או שירות דומה. אסדת הדמיה זו דומה לזה המשמש לרקמות גלמים אחרות תמונת 9,10.
מוצג כאן הוא פרוטוקול הדמיה פשוט לחיות תאים שיכולים לשמש כדי להעריך באופן ישיר את אירועי המוךפו"גנטי שתורמים לדפוסי עין מ~ 17-42 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF hr). באופן ספציפי, פרוטוקול זה מאפשר לאדם לקבוע את ההשלכות של שינוי ביטוי גנים בזמן התפתחות גלמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
איור 3 מראה סיכום של ההליך ניסיוני.
1. רקמות הכנה
- כדי לקבוע את ההשלכות של ביטוי שונה של גן של עניין, הקימו את הצלב בכפולות הבא ולשמור על 25 מעלות צלזיוס: UAS-transgene (זכרים) X GMR-GAL4; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: GFP; הערה + / SM5-TM6b (נקבות בתולה): לקבלת צלב רקמת השליטה UAS-lacZ זכרים לGMR-GAL4; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: נקבות GFP. β-galactosidase לא מייצר פגמים בהתנהגות תא ברשתית.
- כדי לשפר את היעילות של transgenes RNAi, UAS-RNAi צלב זכרים לGMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: GFP; נקבות בתולה + / SM5-TM6b.
הערה: פגמים אקראיים בהתנהגות תא ברשתיות להביע DCR-2 מחוץ לרחם נצפו (מידע לא מוצג). ערנות מומלצת אם שימוש בגישה זו. - Sנבחרים טרום גלמים לבנים של גנוטיפים מתאימים ומקום בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge. אם הגלמים להביע DCR-2, בחר גלמים או זכר או נקבה: הביטוי של כטב"מ-DCR-2, להוסיף על כרומוזום X, הוא חזק יותר בגברים. יש דחף מיני של גלמים ב0 APF שעות לפני פיגמנטציה של המקרה גלמי - בלוטות המין של גברים נראים כמו גלובוסים שקופים גדולים בצדדים לרוחב של הגולם (כשליש מאחורי).
- דגירה צינורות microcentrifuge המכילים גלמים, בקצה-קופסא פלסטיק נקייה של 25 מעלות צלזיוס. כדי למנוע התייבשות של מקום גלמים 10 סנטימטר 2 פיסת הרקמה, שהושרה במים מזוקקים, לקצה התיבה.
הערה: אם את לחות בקצה התיבה הופכת גבוהה מדי במקרה גלמי עשוי להיות רטוב וקשה לנתח בשלבים הבאים. - דגירה של הזמן מתאים. כדי ללכוד התנהגויות תא הקשורים לדפוסי עין, להכין גלמים עבור הדמיה בכ -17 שעות APF, APF 20 שעות או 24 שעות APפ ראה נציגי תוצאות לדיון נוסף בכאשר התנהגויות תא מסוימות הם נצפו הטובים ביותר.
- מניחים נייר דבק דו-צדדי טרי על צלחת לנתיחה sylgard השחור. מקם צד גולם, גב למעלה, עם ראש הגולם דבק בקלטת (איור 1 א) דו-צדדי .Try לא לדבוק בית החזה ובטן אזורים של הגולם לקלטת דו צדדית. עם מלקחיים בזהירות להרים ולהסיר את operculum לחשוף את ראש גלמים. לקרוע בצד של המקרה גלמי לחשוף את האזור סביב עין אחת.
- הוצא בעדינות את הגולם מהנייר דבק. אם הגולם נשאר חסיד, להחיל נפח קטן של מים מזוקקים לצומת בין המקרה וקלטת גלמים להחליש הידבקות.
2. הרכבה
- לבנות 15 מ"מ 2 מסגרת קטנה מנייר סופג ואגרוף חור בmiddlethat הוא 5.5 מ"מ קוטר (איור 1). לטבול במים מזוקקים ומקום במרכז שקופיות מיקרוסקופ. באמצעות מזרק 30 סמ"ק, לסחוט טבעת אחידה של וזלין להקיף את מסגרת נייר הסופג. ודא שטבעת וזלין היא גבוהה במעט מהרוחב של הגולם ושקוטרה של הטבעת הוא שולי פחות מהרוחב של להחליק את המכסה.
- הוסף חרוז קטן של וזלין ישירות לשקופית, בחור מנוקב לנייר הסופג (איור 1 ג) .Carefully לארגן הגולם, בצד שלה, נתמך על ידי חרוז וזלין (1D איור).
- מניחים coverslip על גבי טבעת וזלין כדי שאנשי קשר זה אפיתל מעל neuroepithelium העין (1D איור). בעדינות לדחוס ההכנה לאטום את coverslip נגד וזלין וליצור קשר משטח שטוח קטן בין אזור עין גלמים וcoverslip.
3. דימות פלואורסצנטי
- תמונת הכנת גלמים באמצעותמיקרוסקופ פלואורסצנטי. כל לכידת 7 דקות קטעי סדרתי דרך תחום הפסגה של neuroepithelium העין, באזור של צמתים adherens.
הערה: א) סעיפים סידוריים מתאימים הם בדרך כלל 4-5 לZ- המחסנית מורכבת מ0.2 מיקרומטר z-שלבים. ב) אי סדרים בטופולוגיה של האפיתל, כולל בליטות וקפלים עדינים, יכול לעשות את זה מאתגר לרכוש תמונות בפוקוס של אזורים הגדולים של רקמה. בעוד הדמיה, ניתן למצוא חלק משטח של עניין להיות בפוקוס, ואזור סמוך ליהיה מחוץ לפוקוס. כולל טיפה קטנה של מים מזוקקים בין העין וcoverslip גלמים יכולים לחסל כמה קפלי רקמה חריפים אך לא אופייני טופולוגיה המעטה אחידה של המוקדמים של המורפוגנזה עין גלמי השלבים. במקרים אלה oversample הרקמה על ידי הרחבת Z- המחסנית עד בפוקוס פרוסות נרכשות עבור כל השדה. ג) לכידת קטעי סדרתי כל דקות 7 צריכה לאפשר חי הדמיה במשך 3 עד 4 שעות ללא redu משמעותיction בעוצמת הקרינה GFP שעלולה לפגוע באיכות תמונה. -מרווחי זמן קצרים יותר עשויים להפחית את הזמן הכולל של הדמיה. - המשך הדמיה במשך 3 עד 4 שעות. אין להשתמש בפוקוס אוטומטי ופונקצית זמן שנגיש בהרבה מיקרוסקופי ניאון מאז צמיחה ושאיבה של hemolymph גלמים מעבירה את העמדה של הרשתית וערנית נדרשת כל דקות 14-21 התמקדות מחדש. הערה הדמיה שמעבר 4 שעות עשויים להאט או לעכב המורפוגנזה של העין.
- השתמש בתוכנת deconvolution מתאימה כדי להפחית את הרקע ולשפר את הניגודיות של תמונות סעיף סדרתי. עבור כל קובץ Z- מחסנית, בצע את הפעולות הבאות בתוכנת LAS AF (ראה טבלה של חומרים): נווט ללוח כלים, בחר 3D Deconvolution ולחץ על החל.
- צור תמונת היטל מרבי (MP) עבור כל קובץ ערימת deconvoluted: נווט ללוח כלים, בחר הקרנת 3D ולחץ על החל.
הערה: אלגוריתם ההקרנה המרבי עלול להיכשל כדי ליצור אחידly תמונה בפוקוס לרקמות שכבר oversampled. טכניקה לחידוד אזורים מחוץ למוקד מתוארת בשלב 5.2.
4. פוסט-ההדמיה גלמי הצלה והפנוטיפ אימות
- כדי לטפל באם החפצים הוכנסו או הגולם נפגע במהלך הדמיה, להסיר בזהירות את הגולם מאסדת ההדמיה: באמצעות מלקחיים להסיר את coverslip ולהעביר את הגולם לבקבוקון נקי של מזון. לאחסן בטמפרטורת חדר או 25 מעלות צלזיוס עד הזבוב הבוגר עולה.
- לבחון היטב את הפנוטיפ של העין מבוגרת ולהשוות לעיניים של זבובים בוגרים מתעוררים מן הצלב לטוס המקורי.
עיבוד 5. תמונה
- יישור תמונה אוטומטי:
הערה: רקמת תסיסנית חי תעבור ולגדול לאורך כל תהליך ההדמיה. כתוצאה מכך, המרכזים של תמונות שנאספו בנקודות זמן רצופות אולי לא מתאים לאותה הנקודה ברקמת דרוזופילה. בנוסףדיסק רשתית כל סבב כ -30 מעלות בין ~ 21 ו -23 APF שעות. כדי להדגיש התנהגויות תא בודדות ולהפחית הסחות דעת שנגרמה על ידי גידול האורגניזם, ליישר כל MP image.While זה יכול להתבצע באופן ידני, תוכנת עריכת תמונות משמשת כאן (ראה טבלה של חומרים) יש אלגוריתמים מובנים שיכול לזרז את התהליך.- בכרטיסייה הקובץ של התפריט הראשי, סקריפטים פתוחים וקבצים טען בחרו לסטאק.
- לייבא קבצי תמונת MP ללוח השכבות טען ובחר אישור. ודא כי הניסיון יישר אפשרות תמונות המקור באופן אוטומטי לא נבחר.
הערה: אם אפשרות זו נבחרת, התוכנה יכולה להשתמש באלגוריתם יישור שמעווה את נתוני תמונה. - ברגע שכל קבצי MP שנטענו לתוך חלונית השכבות, לוודא שכל התמונות הן בסדר כרונולוגי, כך שנקודת הזמן המוקדמת ביותר היא בחלק העליון של שכבת המחסנית. אם השכבות אינן בנכונה כדי, גרור ושחררו אותם עד שהם הזמינובצורה נכונה.
- בחר שכבות Auto-Align מכרטיסיית עריכה של התפריט הראשי. בחר מיקום מחדש ולחץ על אישור.
- אם האלגוריתם האוטומטי היישור נכשל כדי לכוון את המסגרות למוקד רלוונטי, לבצע התאמות קטין באמצעות כלי הזזה.
- חידוד Composite:
הערה: אזורי Out-of-פוקוס של תמונת MP ראשונית ניתן חידדו על ידי 'חיתוך' ערימת deconvoluted המקבילה בתוכנת LAS AF. חיתוך קובץ ערימה מאפשר להגביל את המרווח של Z- מחסנית כי הוא נתון אלגוריתם ההקרנה המקסימאלי באופן ידני.- אתר את פונקצית היבול בלוח כלים (תחת לשונית התהליך). באופן ידני להגביל את הפרוסות הראשוניות וסופיים כך שהם מקיפים את חגורת ההידבקות רק בתוך האזור תחילה מחוץ לפוקוס. לחץ על החל כדי ליצור קובץ ערימה חדש שעבר אופטימיזציה לאזור זה.
- צור הקרנה המרבית חדשה לערימה מותאמת באופן מקומי ויצוא כקובץ TIFF.
- בהתוכנת דואר עריכת תמונות (ראה טבלה של חומרים), סקריפטים פתוחים (הממוקמים בכרטיסיית הקובץ של התפריט הראשי) וטען בחר קבצים לתוך סטאק.
- לייבא את הקובץ הראשוני תמונת MP וקובץ MP מותאם באופן מקומי לנקודת זמן מסוימת ללוח השכבות טען ובחר אישור. ודא כי הניסיון יישר אפשרות תמונות המקור באופן אוטומטי לא נבחר.
- בחר בשני השכבות בשכבות חלונית ולאחר מכן בחר 'שכבות Auto-Blend (הממוקם בכרטיסיית עריכה של התפריט הראשי) כדי להסוות באופן אוטומטי האזורים המתאימים של שני התמונות, מניב להתמקד ב- אחיד שדה רשתית. להציל את התמונה מורכבת זו כקובץ TIFF.
- חזור על שלבים 5.2.1 באמצעות 5.2.5 לכל תמונות MP הכי המוצלחות.
- התאמות נוספות: לסובב, לחתוך, ולהתאים את הרמות של שכבות הסרט:
- עם כל השכבות שנבחרה, להשתמש בכלי המרה (Edit> Free Transform) כדי לסובב את התמונות כך שהציר הגבי-הגחון של הרשתית מיושרלציר y של מסגרת הסרט.
- במידת צורך, להשתמש בכלי החיתוך כדי לצמצם את שדה הראייה לגודל וצורה רצויים.
- השתמש בהתאמת רמה (של מסגרות בודדות) כדי לעזור לשפר את הניגוד שבין קרום התא ותא בגוף.
- למטרות סגנוני ולהדגיש התנהגויות תא מסוימות, להציג את הצבע כוזב כדי להדגיש נקודות עניין בכל מסגרת.
- אנימציה: להמיר את התמונות לסרט:
- פתח את חלונית האנימציה מכרטיסיית Windows של התפריט הראשי. בחר הפוך מסגרות משכבות מהתפריט הממוקם בפינה הימנית העליונה של חלונית האנימציה.
- שים לב שהשכבות מתווספות לחלונית האנימציה בסדר רציף החל מתחתית הערימה. כדי להפוך את הסדר של המסגרות, בחר תחילה את כל המסגרות ולאחר מכן בחר הפוכה מסגרות מתפריט חלונית אנימציה.
- בחר עיכוב מסגרת זמן לכל מסגרת באמצעות התפריט הנפתח מתחת לאגודל המסגרתמסמר.
הערה: עיכוב המסגרת לסרטים 1 עד 4 שהוצגו במאמר זה הוא 0.8 שניות. - בכרטיסייה הקובץ של התפריט הראשי, היצוא פתוח ובחרו לדקלם וידאו. בחר QuickTime יצוא תחת אפשרויות קובץ ובחר בפורמט וידאו רצוי. תחת לדקלם אפשרויות להגדיר מסגרת שיעור מותאמת אישית, הזן במסגרת שיעור של 15, ולחץ על לדקלם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live-הדמיה של העין גלמים היא אסטרטגיה מוצלחת להתבונן התנהגויות תא שתורמים לדפוסים של neuroepithelium. תפקידם של חלבונים מסוימים ניתן להעריך בקלות על ידי להביע transgenes שמשנה את רמות חלבון במהלך פיתוח העין. כדי לעשות GMR-GAL4 זה משמש לנהוג ביטוי transgene מאחורי תלם המוךפו"גנטי. זה מציע את היתרון של לא perturbing אירועים קודמים שלהקים את שדה עין במהלך שני instars הזחל הראשון. בנוסף transgenes RNAi רב דורש זמן משמעותי להפחית ביעילות את רמות החלבון (הנתונים מוצגים כעת). לפיכך נוהג transgenes RNAi עם קו נהג GMR-GAL4 לעתים קרובות מאפשר פיתוח שלישי זחל עין instar וeversion של דיסקי העין במהלך המטמורפוזה כדי להמשיך ללא פגע ומפחית באופן משמעותי את רמות חלבון רק מאוחר יותר, במהלך המורפוגנזה עין גלמים. אם התפתחות זחל מופרעת על ידי עם זאת transgene RNAi יעיל ביותר, לטוס צלבים יכוליםיישמר על 18 מעלות צלזיוס כדי להפחית את ביטוי transgene וגלמים הועבר ל -25 מעלות צלזיוס ב0 APF שעות. כדי לטפל ביעילות של רמות ביטוי transgene, תעתיק או חלבון RNAi צריך להיות מוערך בגלמי בהתאמה שלב תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית (למשל כמותי-PCR, immunofluorescence, immunoblotting).
במהלך התפתחות זחל, ליבות קולטי האור של כל אומטידיום מגויסות כמו גל שנוסע מאחורי לצד קדמי של דיסק עין 11. השיפוע ההתפתחותי הזה נשמר בעיני גלמים. ואכן, כאשר צילמו ב22.5 שעות APF, דפוסים של GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: GFP; רשתיות-TM6b SM5 + / היו ניכר יותר בוגרות באזור האחורי (איור 2). הפנוטיפ של רשתיות אלה היה דומה לזה של זנים לטוס wild-type (מידע לא מוצג). באופן מסורתי המורפוגנזה עין גלמים מתוארת לפי זמן התפתחותי (למשלשעות APF). עם זאת, בגלל השיפוע התפתחותיים המובהק אנו מציעים מתארים דפוסי עין על פי האירועים הבאים:
1 ° אריזה (איור 2 וסרט 1): בשלב הראשון כמה שרק שמונה תאים ישירות פנתה לחבילות קולטי האור. שני תאים - בדרך כלל התאים הקדמי ואחוריים - גויסו כפריימריס (1 ° ים). 1s אלה במהירות הקיף את חבילות קולטי האור, חיבור זה לזה כדי ליצור צמתים יציבים. תאים שלא עברו התמיינות interommatidial (ICs) שכבו באופן לא מאורגן בין כל קבוצת ommatidial. בד בבד עם 1 ° גיוס תא, אפופטוזיס גזם כ -5% מבריכת IC כפי שתואר לעיל (לא מבוארת בסרט 1) 12.
עיבור IC (איור 2 וסרט 2): כ1 ° s עטופה וחתומה על כל חבילת קולטי אור, ce המקומיתנועות ll ארגנו מחדש את שבבי חולק הצדדים הגב וגחון של כל אומטידיום. שבבי intercalated ממספר (בדרך כלל שתיים) שורות לשורה אחת. מיקום היעד של מעגלים משולבים נעים ניתן לנבא בביטחון ברקמה מהסוג בר על ידי התבוננות ההקרנה כיוונית של 'הרחבות סלולריות' גדולות. צמיחה של התאים 1 ° ליוותה וסביר תרמה לIC עיבור 13. שבבים רבים ילכו על להבדיל כמו תאים משניים (2 מעלות s) (לא מוצג).
3 ° תחרות (איור 2 וסרט 3): בעקבות עיבור, שלושה שבבים התחרו לכבוש את הנישה שהיישונים (3 מעלות). בקרב דינמי זה, תאים לעתים קרובות כבשו את הנישה 3 מעלות עבור קטן כמו 5 עד 10 דקות לפני שנעקר. בסופו של תא בודד שהוקם 3 ° נישה יציבה.
גיזום סופי (איור 2 ו -4 סרט): זינוק של אפופטוזיס 3,15-18 צמצם את מספר השבבים למינימום הנדרש כדי ליצור סריג IC משושה מסודר ביעילות על פני עין המורכבת 5,14: שלוש 3 מעלות s ושש 2 מעלות s סביב כל אומטידיום. כפי שצוין קודם לכן, בדרך כלל אלה שבבים עודפים שוכבים קרוב ביותר לזיפים בוטלו על ידי אפופטוזיס 7. אנו נצפו במקביל המוות של תאים עם עיבור IC ו -3 מעלות הקמת נישה ומציעים גיזום שתאים עודפים תרמו ליעילותם של אירועים אלו. בנוסף, מיצוב מחדש עדין של organules זיפים היה לעתים קרובות כפי שנצפה שבבים היו גזם.
איור 1:. נתיחת גלמים והדמיה () operculum יוסר מגולם דרוזופילה (המוצג כאן בשעה 23 APF) כדי לחשוף את ראשnimal. קו מקווקו מייצג נייר דבק דו-צדדי. אילוסטרציה (B) של המתקן חי-הדמיה הפשוטה. (C ו- D) עם הראש חשוף, הגולם ממוקם על כ -35 מעלות במנוחה על החרוז וזלין. (ד) תמונה בהגדלה גבוהה יותר של גולם ממוקם על גבי חרוז וזלין. המיקום של coverslip ומטרתם מאוירים (לא נמשך לקנה מידה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: שיפוע של פיתוח על פני העין גלמים. תמונה אחת של העין גלמים צילמו ב22.5 APF שעה (). צמתים Adherens מסומנים על ידי DE-Cad: GFP וαCat: GFP. האזור התאגרף הוא מבואר ב( C). (ב) איורים של אמצע הבמה והאומטידיה באופן מלא בדוגמת, בשעה 24 ו- 41 שעות APF בהתאמה. שתי 1 ° s (כחול) להקיף קיבוץ של ארבעה תאי קונוס (לבן) מרכזי. ב -41 שעות APF הדפוסים של תאי interommatidial (אפור בהיר) הושלם: שלוש 3 מעלות s לכבוש קודקודים חלופיים וצורות 2 מעלות בודדות מכל צד של המשושה. שלושה זיפי organules (אפור כהה) מקיף את כל אומטידיום. ביאור (C) של אזור קטן של העין (מ). שני 1 ° תאים (דוגמאות תכלת פסאודו-צבעוני) להרחיב להקיף כל חבילת קולטי אור. intercalate שבבים (ירוק, צהוב, אדום וכחול כהה) לשורות בודדות. בכל קודקוד חלופי שלושה תאים להתחרות (שתואר בורוד) לכבוש 3 ° הנישה (כתום). ראה סרטים 1-4 להתבונן אירועים אלה מתרחשים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של figur זהדואר.
איור 3:. סיכום של ההליך ניסיוני אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1:. גלישה יסודי 1 ° תאים שנבחרו מהמאגר של תאים המקיפים את כל אומטידיום הצעיר. כשתי 1 ° s להקיף כל אומטידיום ולהתחבר, adherens צמתים במהירות יוצרים (קווים ורודים). ישר 1 °: צמתים תא 1 ° להרחיב ו1 ° s מתחילה לגדול, בידוד חבילות קולטי אור מהשבבים שמסביב. בתחילה הקולטני האור לזהור בבהירות, GFP הצפוף סימון צמתים adherens משוכללים. מורפולוגיים משנה גראdually לצייר צמתים קולטי אור אלה מתחת למטוס של הדמיה וצמתים בצורת X בין כל סט של ארבעה תאי קונוס הפסגה על גבי כל אומטידיום יתבהר. תמונות מקוריות על שמאל; פסאודו-צביעה וביאורים הוכנסו לפנלים בצד ימין. עין צילמה מ -21 APF שעות.
סרט 2:. Intercalaction תא Interommatidial תאי interommatidial (ICs) מסומן באדום, כחול, צהוב וירוק בתחילה טופס רבע הפרדת גב (למעלה) ואומטידיום הגחון (התחתון) על ידי מרחק של שני תאים. השבבים האדומים וצהובים למתוח ventrally וdorsally בהתאמה (מt = 42 דקות), יצירת קשר עם היעד של 1 ° ידי 56 דק '. שבבים הכחולים וירוקים דומים להאריך למקד אומטידיום ההפוך. 1 ° 'החדש': צמתים IC להרחיב במהירות רוחבית. ב112 דק 'ברבע המקורי של שבבים יש intercalated באופן מלא לgenerate שורה אחת של תאים. תמונות מקוריות על שמאל; פסאודו-צביעה וביאורים הוכנסו לפנלים בצד ימין. עין צילמה מ -23 APF שעות.
הסרט 3:. תחרות תיכונית בקודקודים חלופיים שתיים או שלושה תאים (המפורטים בורוד) להתחרות לכבוש 3 ° הנישה. מופיע ל'דחיפה 'שכניהם בצד, תאים לייצר הרחבות גדולות שמגיעות לכיוון האומטידיה ההפוכה. כובש 3 ° הנישה (כתום) הוא לעתים קרובות חולף ותאים או לחזור בו או נדחפים ממקום על ידי שכניהם. בסופו של סרט 217 דקות זה, רב 3 ° נישות מופיעות הוקמה. תמונות מקוריות על שמאל; פסאודו-צביעה וביאורים הוכנסו לפנלים בצד ימין. עין צילמה מ -23 APF שעות.
Movie 4:. סופי גיזום תאים בקרבת organules זיפים יוסרו על ידי אפופטוזיס. דוגמאות מודגשות בסגול, אדום, צהוב וכחול. במהלך ההדמיה, הסרת התאים השאירה רק אחד 2 מעלות לאורך כל זרוע אופקית של המשושה IC. גיזום של תאים עודפים על הצדדים האלכסוניים של המשושה IC לא נכבש בסרט הזה. בגנוטיפ זה טעויות קטנות במיקום של קבוצות זיפים נצפו לעתים קרובות (השווה עם תרשים 2B). שתיים משלוש קבוצות זיפים תמרנו לנישות פינה במהלך הדמיה: מיצוב מחדש נראה שהקל על ידי ההסרה ותנועה של מעגלים משולבים שכנים. תמונות מקוריות על שמאל; פסאודו-צביעה וביאורים הוכנסו לפנלים בצד ימין. עין צילמה מ -26 APF שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תיאור התפתחות wild-type (לעיל) מהווה את הבסיס להשוואות של אירועי דפוסים בRNAi או גנוטיפים ביטוי יתר. השוואות של פיתוח רקמת חיה הן לא יסולא בפז בעת קביעה בדיוק אילו התנהגויות תא מוסדרות על ידי חלבון של עניין. יתר על כן, ולא תאר כאן, הדמיה תא חי מאפשרת לאדם להפוך את התיאורים איכותיים ו / או כמותית של תפקידו של גן של עניין באירועים שדפוס עין. על ידי 30-32 שעות APF רוב תאי פיגמנט רכשו עמדות יציבה ואפופטוזיס גזם תאים עודפים משדה הרשתית. בעקבות זאת, רק שינויים קלים הם נצפו כתאי פיגמנט לאמץ צורות האופייניות שלהם: 3 מעלות s להיות משושה ו, כ1 ° s עדינות להרחיב, הרוחב של 2 מעלות התאים מלבניים השכנים יורד. הדור הבא של פיגמנט וחומר עדשה סביר צידניות הדמיה מוצלחת של צמתים adherens.
למרות valאסטרטגית uable, כמה חסרונות יש לזכור כאשר ההדמיה עין גלמים החי. ראשית, להסיר את מקרה גלמים הקדמי הופך את בעלי החיים פגיעים במיוחד להתייבשות, התחממות יתר, ופגיעה במהלך ההרכבה והדמיה. עלבונות כגון אלה יכולים לבלבל את הנתונים על ידי גרימת פיתוח רקמות לא טיפוסי שאינו רלוונטי לגנוטיפ בבחינה. שנית, הפרוטוקול המתואר כאן דורש שcoverslip זכוכית ליצור קשר ישיר עם אפיתל ראש גלמים. ראינו כי התפתחות רשתית דוכנים אם לחץ מוגזם מיושם כאשר דוחפים את coverslip נגד עין. ואכן אקסוגניים כוחות מכאניים הוכחו במערכות אחרות כדי להשפיע על תהליכים התפתחותיים כוללים ארכיטקטורת רקמת 19,20. מסיבות אלה חשוב למקם את coverslip נגד עין מאוד בעדינות. בנוסף, גלמים צילמו צריכים להינצל מאסדת ההדמיה ואפשרו להתגלות כמבוגרים: חפצים הציגו במהלך ההדמיה יכוליםלעתים קרובות להיות מזוהה על ידי השוואה צילמה את העין של המבוגרים האלה בעיניים של גיל בהתאמה זבובים מהצלב המקורי. יתר על כן, הנתונים מפגישות הדמיה מרובות יש להשוות לאמת התנהגויות תא. לבסוף, יש להשתמש immunofluoresence הסטנדרטי כדי לקבוע אם ההסדר, הגודל ומספר התאים ברקמה בהתאמה במה הם אותו הדבר.
DCR-2 מחוץ לרחם משמש לעתים קרובות כדי לשפר את היעילות של RNAi. עם זאת, בנוכחות DCR-2 מחוץ לרחם, עיבור IC, ייצוב של הנישה ואפופטוזיס 3 ° שובשו מדי פעם (מידע לא מוצג). כך DCR-2 ביטוי יש להשתמש בזהירות.
הפרוטוקול המתואר כאן מנצל GFP לתווית adherens צמתים ולהעריך המורפוגנזה של תאי הפיגמנט בעיני גלמים. אסטרטגיה זו יכולה בקלות להיות שונה למטרות אחרות (לדוגמא כדי להעריך המורפוגנזה קולטי אור). לגישה כפול תיוג, UA נוסףtransgenes S שתווית רכיבים אחרים הסלולר של עניין (למשל שלפוחית מזכירה, reticulum endoplasmic, גרעין) עם תגים שאינם GFP יכולה להיות משולבת. עם זאת העצמה ואריכות הימים של transgenes אלה ידרשו הערכה: RFP, DsRed וmCherry, למשל, הוכיח להיות תוויות עניות הדמיה עין גלמים לתקופות ממושכות הנדרשות כדי ללכוד דפוסי תא פיגמנט (מידע לא מוצג). אם חוקר התנהגויות תאים מהירות (למשל הפרשה) הפרוטוקול המתואר כאן יכול בקלות להיות שונה למיקרוסקופיה confocal של חלבוני ניאון מתאימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
