Abstract
Inhärenten Prozesse der Drosophila Puppenentwicklung können sich verschieben und verdrehen die Augen Epithel in einer Weise, die einzelnen Zellverhalten schwer in lebenden Zellen zu verfolgen, zu machen. Diese Prozesse umfassen: Netzhautrotation, das Zellwachstum und organismischen Bewegung. Zusätzlich Falten Unregelmäßigkeiten in der Topologie des Epithels, einschließlich feinen Unebenheiten und oft eingeführt, wie die Puppe zur Abbildung hergestellt, es schwer machen, in unscharfe Bilder von mehr als ein paar Ommatidien in einer einzigen Brennebene zu erwerben. Der Workflow skizzierten Heil diese Fragen, was eine einfache Analyse zellulärer Prozesse bei Drosophila Puppenaugenentwicklung. Passenderstufigen Puppen sind in einem bildgebenden rig, die leicht in den meisten Labors montiert werden kann angeordnet Ubiquitin-DE-Cadherin. GFP und GMR-GAL4 -driven UAS-α-Catenin: GFP werden verwendet, um Zellgrenzen im Auge Epithel 1 visualisieren -3. Nach Dekonvolution istFluoreszenzbildern mit mehreren Fokusebenen erfasst angewendet werden maximale Projektionsbilder für jeden Zeitpunkt erzeugt und verstärkt mit einer Bildbearbeitungssoftware. Alignment-Algorithmen verwendet werden, um schnell zu stabilisieren flüssige Bewegung, so dass einzelne Zelle Verhalten leichter zu verfolgen.
Introduction
Die Verbindung Drosophila Auge wird durch die stereotype Anordnung seiner ~ 750 Ommatidien von einem Wabengitter von Zubehörpigmentzellen 4,5 getrennt sind. Lokale Zellbewegungen, Zellwachstum, die Veränderungen in der Zellform und Apoptose: Diese Pigmentzellen werden durch eine koordinierte Kombination von Ereignissen gemustert. Live-Anzeige dieser Epithel ermöglicht es, die molekularen Mechanismen, auf denen diese Ereignisse in einem physiologisch relevanten und gelassen dreidimensionalen Kontext zu untersuchen.
Im Gegensatz zu bisherigen Protokolle 6,7, die Technik hier skizzierten umfasst ein effizientes Verfahren zum Stabilisieren von äußerem Gewebe Bewegung, die nicht entkoppelt von dem Abbildungsprozess sein kann. Dieses Verfahren verbessert die Untersuchungen des Zellverhaltens in dem Entwicklungs Drosophila Puppenauge Epithel - einem Gewebe wächst dreht und verschiebt sich im Laufe der Bildverarbeitung. Neben der Bewegungsstabilisierungstechnik dehier beschrieben wird zur Untersuchung von Zellen in anderen Zusammenhängen, wo Fremdbewegung auftritt.
Um Zellgrenzen in der Netzhautfeld Drosophila sichtbar zu machen, wurden transgene Fliegenlinien erzeugt, die ubi-DE-Cadherin Ausdruck: GFP sowie UAS-α-Catenin: GFP unter Kontrolle des Auges spezifischen Treiber GMR-GAL4 1-3. Die Verwendung von zwei GFP-markierten Membranmarker erlaubt die Visualisierung von Zellgrenzen zu niedrigeren Lichtintensität. Dies minimiert Gewebeschäden und Photobleaching auf wiederholte Exposition gegenüber Hochenergiewellenlängen, so dass erhöhte Bildrate und Filmdauer. Zur Verbesserung der Wirksamkeit der RNAi-Transgene, UAS-DCR-2 wurde auch in eine zweite Fliege Linie 8 eingearbeitet.
In einem dritten Update von früheren Protokollen wird ein einfacher Bild rig, die leicht in den meisten Labors zusammengesetzt beschrieben. Diese Vorrichtung vermeidet die Erfordernis, eine spezielle Abbildungs r habenig von einer Universität "Werkstatt" oder ähnlichen Dienst generiert. Diese Bild rig ist ähnlich wie die Bild anderen Puppen Gewebe 9,10 verwendet.
Präsentiert hier ist eine einfache Live-Cell-Imaging-Protokoll, das verwendet werden kann, um direkt bewerten die morphogenetischen Ereignisse, die zu Augen Strukturierung von ~ 17 bis 42 Stunden nach der Pupariumbildung (hr APF) beitragen. Insbesondere ermöglicht es dieses Protokoll, um die Konsequenzen der Modifizierung Genexpression während Puppenentwicklung zu bestimmen.
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Protocol
3 zeigt eine Zusammenfassung der experimentellen Verfahren.
1. Gewebepräparation
- Um die Folgen der veränderten Expression eines Gens von Interesse, die folgende Quer in zweifacher Ausfertigung zur Ermittlung und Pflege bei 25 ° C: UAS-Transgen (Männer) X GMR-GAL4; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (jungfräulichen Weibchen) HINWEIS: Um Kontrollgewebe Quer UAS-lacZ erhalten Männchen zu GMR-GAL4; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP Frauen. β-Galactosidase erzeugt keine Mängel in den Zellverhalten in der Netzhaut.
- Um die Wirksamkeit der RNAi Transgenen zu verbessern, Männchen Quer UAS-RNAi, um GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b jungfräulichen Weibchen.
HINWEIS: Gelegentliche Fehler in das Zellverhalten in retinae Ausdruck Eileiter DCR-2 beobachtet (Daten nicht gezeigt). Wachsamkeit ist empfehlenswert, wenn mit diesem Ansatz. - Select weiß Pre-Puppen von geeigneten Genotypen und in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wenn die Puppen zum Ausdruck DCR-2, wählen Sie entweder männlich oder weiblich Puppen: Ausdruck der UAS-DCR-2 ist ein Einsatz auf dem X-Chromosom, ist stärker bei Männern. Puppen sollten bei 0 h APF vor Pigmentierung der Puppenhülle sexed werden - die Keimdrüsen der Männchen sind so groß scheinenden Kugeln auf den Seiten der Puppe (etwa ein Drittel aus dem hinteren) sichtbar.
- Mikrozentrifugenröhrchen, die Puppen in einem sauberen Plastikspitze-Box bei 25 ° C inkubieren. Um Austrocknung der Puppen Ort verhindern, dass ein 10 cm 2 Gewebestück, in destilliertem Wasser eingeweicht, in die Spitze-Box.
HINWEIS: Wenn die Luftfeuchtigkeit im Tip-Box zu hoch wird die Puppenhülle kann matschig und schwer in den nachfolgenden Schritten zu sezieren werden. - Inkubieren für angemessene Zeit. Zur Erfassung Zelle Verhalten mit Mustern des Auges verbunden sind, vorzubereiten Puppen für die Bildgebung bei rund 17 Stunden APF, 20 Stunden oder 24-Stunden-APF APF. Siehe Repräsentative Ergebnisse für die weitere Diskussion auf, wenn bestimmte Zelle Verhaltensweisen am besten beobachtet.
- Legen Sie ein Stück frischen doppelseitigem Klebeband auf einem schwarzen Sylgard Dissektion Gericht. Positionieren Sie eine Puppe, Rückenseite nach oben, mit dem Kopf der Puppe mit dem doppelseitigen Klebeband (1A) eingehalten .try nicht, den Brust- und Bauch Regionen der Puppe mit dem doppelseitigen Klebeband haften. Mit einer Pinzette vorsichtig anheben und entfernen Sie das Operculum, den Puppenkopf aus. Reißen entlang der Seite der Puppenhülle um den Bereich um ein Auge aus.
- Entfernen Sie vorsichtig die Puppe vom Klebeband. Wenn die Puppe haften bleibt, geben Sie eine kleine Menge von destilliertem Wasser zu dem Übergang zwischen der Puppenhülle und Klebeband, um die Haftung zu schwächen.
2. Montage
- Konstruktion eines kleinen 15 mm 2 Rahmen aus Löschpapier und ein Loch in der middlethat ist 5,5 mm im Durchmesser (1B). Tauchen Sie ein in destilliertem Wasser und indie Mitte eine Mikroskop-Objektträger. Mit einem 30-ml-Spritze, Squeeze-out eine einheitliche Ring Vaseline das Löschpapier Frame zu umgeben. Sicherzustellen, daß die Vaseline Ring geringfügig höher ist als die Breite der Puppe und daß der Durchmesser des Rings geringfügig kleiner als die Breite eines Deckglases ist.
- Fügen Sie eine kleine Raupe aus Vaseline direkt auf den Objektträger, in das Loch in das Löschpapier (1C) gestanzt .Carefully ordnen Sie die Puppe auf die Seite, von der Vaseline Wulst (1D) unterstützt.
- Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des Vaseline Ring, so dass er in Kontakt mit dem Epithel über dem Auge Neuroepithel (1D). Komprimieren Sie vorsichtig die Vorbereitung auf das Deckglas gegen die Vaseline verschließen und erzeugen einen kleinen flachen Kontaktfläche zwischen dem Puppenaugenbereich und dem Deckglas.
3. Fluoreszenz-Imaging
- Bild des Puppenvorbereitung mit einFluoreszenzmikroskop. Alle 7 min Abscheidung Serienschnitte durch den apikalen Domäne des Auges Neuroepithel, in den Bereich der Adhärenzverbindungen.
HINWEIS: a) geeignete Serienschnitte sind in der Regel 4-5 pro Z-Stapel von 0,2 um z-Schritten zusammen. b) Unregelmäßigkeiten in der Topologie des Epithels, einschließlich milde Beulen und Falten, kann es schwierig sein Scharf Bilder von großen Gewebebereiche zu erwerben. Während Bildgebung kann ein Teil eines Bereichs von Interesse zu finden, um in-Fokus, und eine Nachbarregion zu out-of-Fokus. Einschließlich ein kleines Tröpfchen destilliertes Wasser zwischen dem Puppen Auge und Deck einige akute Gewebefalten aber nicht beseitigen die leicht unebenen Topologie Eigenschaft der frühen Stadien der Puppenauge Morphogenese. In diesen Fällen überabzutasten das Gewebe durch die Verlängerung der Z-Stapel, bis Scharf Scheiben werden für den gesamten Bereich erworben. c) Aufnahme von Serienschnitten alle 7 min sollten Live-Bildgebung für 3 bis 4 Stunden ohne signifikante redu aktivierenction in der Intensität der GFP-Fluoreszenz, die die Bildqualität beeinträchtigen können. Kürzere Zeitintervalle können die Gesamtzeit der Bildgebung zu reduzieren. - Weiter Bildgebung für 3 bis 4 Stunden. Verwenden Sie keinen Autofokus und Zeitfunktion, die auf vielen Fluoreszenz-Mikroskope zur Verfügung steht, da Puppen Wachstum und Pumpen der Hämolymphe bewegt sich die Position der Netzhaut und wachsam Neuausrichtung benötigt jede 14 bis 21 min. Beachten Sie, dass Bildgebung über 4 Stunden kann verlangsamen oder zum Stillstand Morphogenese des Auges.
- Verwenden Sie geeignete Entfaltungssoftware Hintergrund zu verringern und den Kontrast der seriellen Schnittbilder. Für jede Z-Stapel-Datei, führen Sie das folgende in LAS AF Software (siehe Tabelle der Werkstoffe): Wechseln Sie zum Werkzeugfenster, wählen Sie 3D Dekonvolution und klicken Sie auf Übernehmen.
- Erzeugen Sie eine maximale Projektion (MP) für jeden entfaltet Stack-Datei: Navigieren Sie zu der Werkzeugleiste, wählen Sie 3D-Projektion und klicken Sie auf Übernehmen.
Hinweis: Die maximale Projektionsalgorithmus kann fehlschlagen, ein einheitliches erzeugenly Bild in-Fokus für Gewebe, die überabgetastete hat. Ein Verfahren zum Schärfen von out-of-focus-Regionen in Schritt 5.2 beschrieben sind.
4. Post-Bildgebung Pupal Rettungs- und Phänotyp Verification
- Um Adresse, ob Artefakte eingeführt wurden oder die Puppe während der Bildgebung zu Schaden, entfernen Sie vorsichtig die Puppe von der Bild rig: mit einer Pinzette entfernen Sie die Deckglas und übertragen Sie die Puppe in eine saubere Phiole von Lebensmitteln. Bei einer Raumtemperatur oder 25 ° C, bis die erwachsene Fliege auftaucht.
- Sorgfältig prüfen, den Phänotyp der erwachsenen Auge und im Vergleich zu den Augen der erwachsenen Fliegen, die aus dem ursprünglichen Flug Kreuz.
5. Bildverarbeitung
- Automatische Bildausrichtung:
HINWEIS: Die Live Drosophila Gewebe verschieben und zu wachsen in der gesamten Abbildungsprozesses. Folglich sind die Mitten der Bilder gesammelt zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkte nicht auf den gleichen Punkt in der Drosophila Gewebe entsprechen. Neben dergesamte Retina Scheibe dreht sich um 30 ° zwischen ~ 21 und 23 h APF. Um einzelne Zelle Verhaltensweisen hervorheben und Ablenkungen durch organismal Wachstum zu reduzieren, richten Sie jeden MP image.While dies kann manuell durchgeführt werden, die Bildbearbeitungs-Software verwendet hier (siehe Tabelle der Materialien) verfügt über eine integrierte Algorithmen, die den Prozess zu beschleunigen kann.- Von der Registerkarte Datei im Hauptmenü geöffnet Scripts und wählen Sie Dateien in Stapel laden.
- Importieren Sie die MP-Bilddateien in das Panel laden Layer und wählen Sie OK. Stellen Sie sicher, dass der Versuch, die Bilder-Option Quelle automatisch ausrichten nicht aktiviert ist.
HINWEIS: Wenn diese Option aktiviert ist, kann die Software eine Alignment-Algorithmus, der die Bilddaten verfälscht verwenden. - Sobald alle MP-Dateien in die Ebenen-Fensterbereich geladen werden, um sicherzustellen, dass alle Bilder in chronologischer Reihenfolge, so dass der früheste Zeitpunkt ist an der Spitze des Schichtstapels. Wenn die Schichten nicht in der richtigen Reihenfolge per Drag & Drop, bis sie bestellt werdenrichtig.
- Wählen Ebenen automatisch ausrichten auf der Registerkarte Bearbeiten des Hauptmenüs. Wählen Sie neu positionieren und klicken Sie auf OK.
- Wenn die Auto-Align-Algorithmus nicht den Rahmen zu einem relevanten Schwerpunkt zu orientieren, stellen kleinere Anpassungen mit dem Verschieben-Werkzeug.
- Verbundschleif:
HINWEIS: Out-of-Schwerpunktregionen eines anfänglichen Bild MP kann durch "Abschneiden" der entsprechende entfaltet Stack in LAS AF Software geschärft werden. Zuschneiden eines Stack-Datei ermöglicht es, den Abstand eines Z-Stapel, der dem Maximum Projektion-Algorithmus unterzogen wird manuell zu beschränken.- Suchen Sie die Crop-Funktion in der Werkzeugleiste (unter der Registerkarte Prozess). Manuell begrenzen die ersten und letzten Schichten, so dass sie nur das Haftband im anfänglich außerhalb des Fokusbereichs zu überspannen. Klicken Sie auf Übernehmen, um einen neuen Stapel-Datei, die für diese Region optimiert ist zu generieren.
- Generieren Sie ein neues Maximum Projektion für die lokal optimierte Stack und Export als TIFF-Datei.
- In the Bildbearbeitungs-Software (siehe Tabelle der Materialien), offene Scripts (in der Registerkarte Datei des Hauptmenüs befindet) und wählen Sie Dateien in Stapel laden.
- Importieren Sie die anfängliche Bild MP-Datei und vor Ort optimiert MP-Datei für einen bestimmten Zeitpunkt in das Panel laden Layer und wählen Sie OK. Stellen Sie sicher, dass der Versuch, die Bilder-Option Quelle automatisch ausrichten nicht aktiviert ist.
- Wählen Sie beide Schichten in der Ebenen-Fensterbereich und wählen Sie Ebenen automatisch überblenden (in der Registerkarte Bearbeiten des Hauptmenüs befindet), um die entsprechenden Bereiche der beiden Bilder automatisch zu maskieren, wodurch eine gleichmäßig im Fokus der Netzhaut ein. Sichern Sie das Bild Verbund als TIFF-Datei.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1 bis 5.2.5 für alle suboptimalen MP Bilder.
- Weitere Einstellmöglichkeiten: drehen, zuschneiden und stellen Sie die Pegel der Film-Schichten:
- Mit all den Schichten gewählt, verwenden Sie das Transformieren-Werkzeug (Edit> Free Transform), um die Bilder zu drehen, so dass der dorsal-ventralen Achse der Netzhaut ist ausgerichtetzu der y-Achse des Films Rahmen.
- Verwenden Sie gegebenenfalls die Freistellungswerkzeug, um das Sichtfeld auf die gewünschte Größe und Form zu reduzieren.
- Verwenden Pegeleinstellung (von Einzelbildern), die zur Verbesserung Kontrast zwischen der Zellmembran und Zellkörper.
- Für stilistischen Zwecken und an spezifische Zellverhalten zu betonen, stellen Falschfarben zu Sehenswürdigkeiten in jedem Bild zu markieren.
- Animation: Konvertieren Sie die Bilder in einen Film:
- Öffnen Sie das Animationsfenster aus dem Windows-Register des Hauptmenüs. Wählen Stellen Frames von Schichten aus dem Menü in der oberen rechten Ecke des Animationsbereich entfernt.
- Man beachte, dass die Schichten der Animationsfenster in sequentieller Reihenfolge, beginnend von der Unterseite des Stapels hinzugefügt. Um die Reihenfolge der Frames umgekehrt, zunächst alle Bilder auswählen und dann umge Frames aus dem Animationsfenster Menü.
- Wählen Sie eine Bildverzögerungszeit für jedes Bild mit Hilfe der Dropdown-Menü unten am Rahmen DaumenNagel.
HINWEIS: Die Frame-Verzögerung für Filme 1 bis 4 in diesem Papier ist 0,8 Sekunden. - Von der Registerkarte Datei im Hauptmenü geöffnet Export und wählen Sie Video Render. Wählen Sie Quicktime-Export unter Dateioptionen und wählen Sie das gewünschte Videoformat. Unter Render Optionen eingestellt Frame Rate auf Benutzerdefiniert, geben Sie eine Bildrate von 15, und klicken Sie auf Render.
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Representative Results
Live-Bildgebung des Puppen Auge ist eine erfolgreiche Strategie zur Zelle Verhaltensweisen, die Strukturierung der Neuroepithel beitragen beobachten. Die Rolle von spezifischen Proteinen kann leicht durch Expression von Transgenen, die während der Entwicklung des Auges Protein-Ebene ändern zu bewerten. Um dieses GMR-GAL4 tun wird zur Expression des Transgens hinter dem morphogenetischen Furche fahren. Dies bietet den Vorteil, nicht zu stören früheren Veranstaltungen, die das Auge Bereich in den ersten beiden Larvenstadien zu etablieren. Neben vielen RNAi Transgene erfordern viel Zeit, um Protein-Ebene wirksam zu reduzieren (Daten nicht gezeigt). Daher fahren RNAi Transgene mit der GMR-GAL4 Fahrer ermöglicht oft dritten Larvenstadium der Entwicklung des Auges und Eversion der Augenscheiben während der Metamorphose, um fortzufahren unversehrt und reduziert Protein-Ebene erst später, während der Puppenaugen Morphogenese. Wenn Larvenentwicklung wird jedoch von einem hocheffizienten RNAi Transgen gestört, fliegen Kreuze könnenbei 18 ° C gehalten werden, um die Transgenexpression und Puppen bis 25 ° C bei 0 h APF übertragen reduzieren. Um die Wirksamkeit der RNAi Transgen-Expression, Transkript oder Protein-Ebene befassen sollte im Stadium angepassten Puppen Verwendung von Standardverfahren beurteilt werden (zB quantitativer PCR, Immunfluoreszenz, Immunoblot).
Während Larvenentwicklung werden die Photorezeptorkerne jedes Ommatidium als eine Welle, die von der hinteren zur vorderen Seite des Auges Scheibe 11 wandert rekrutiert. Das Entwicklungsgefälle in der Puppen Auge behalten. In der Tat, wenn sie bei 22,5 h APF, Strukturieren der GMR-GAL4, UAS-DCR-2 abgebildet werden; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b retinae war deutlich reifer im Seitenzahnbereich (Abbildung 2). Der Phänotyp dieser Netzhäute war vergleichbar mit der von Wildtyp-fly-Stämme (Daten nicht gezeigt). Traditionell Puppenaugen Morphogenese ist nach Entwicklungszeit beschrieben (zBhr APF). Aufgrund des ausgeprägten Entwicklungsgefälle schlagen wir vor, beschreiben Augen Strukturierung nach folgenden Ereignissen:
1 ° Verpackung (Abbildung 2 und Film 1): Zunächst bis zu acht Zellen direkt Kontakt zu den Photorezeptor-Bundles. Zwei Zellen - in der Regel die vorderen und hinteren Zellen - wurden als Primärfarben (1 ° s) rekrutiert. Diese 1s schnell umkreist die Photorezeptor-Bundles, miteinander verbinden, um eine stabile Verbindungsstellen zu bilden. Undifferenzierte interommatidial Zellen (ICs) lag in einer unorganisierten Art und Weise zwischen den einzelnen Ommatidien Gruppierung. Gleichzeitig mit 1 ° Zellrekrutierung, Apoptose geschnitten ca. 5% des IC-Pool, wie zuvor beschrieben 12 (nicht im Film 1 kommentierte).
IC-Einlagerung (Abbildung 2 und Movie 2): Da die 1 ° s eingewickelt und über jedes Fotorezeptor Bündel versiegelt, lokale cell Bewegungen reorganisiert die ICs an den dorsalen und ventralen Seiten jedes Ommatidium gruppiert. Die aus mehreren lagert ICs (gewöhnlich zwei) Zeilen in einer einzigen Zeile. Die Zielposition der Bewegung ICs getrost in Wildtyp-Gewebe durch die Beobachtung der Richtungs Projektion der großen "zelluläre Erweiterungen" vorhergesagt werden. Das Wachstum der 1 ° Zellen begleitet und wahrscheinlich IC Einlagerung 13 beigetragen. Viele ICs wird weitergehen, um als Sekundärzellen (2 ° s) zu unterscheiden (nicht dargestellt).
3 ° Wettbewerb (Abbildung 2 und Movie 3): Nach der Einlagerung, konkurrierten drei ICs, um die tertiäre (3 °) Nische zu besetzen. In diesem dynamischen Schlacht besetzten Zellen häufig die 3 ° Nische für so wenig wie 5 bis 10 Minuten, bevor sie verschoben wird. Schließlich eine einzelne Zelle wurde eine stabile 3 ° Nische.
Schluss Beschneiden (Abbildung 2 und Film 4): Ein Anstieg der Apoptose 3,15-18 reduziert die Anzahl der ICs auf das für eine ordentliche hexagonalen Gitter IC effizient zu erzeugen über das Facettenauge 5,14 Mindest: drei 3 ° s und sechs 2 ° s um jeden Ommatidium. Wie zuvor angemerkt, in der Regel die überschüssige ICs Nähe zu den Borsten, wurden von Apoptose 7 eliminiert. Wir beobachteten Zelltod gleichzeitig mit IC Einlagerung und 3 ° Nische Einrichtung und schlagen vor, Beschneiden von überschüssigen Zellen für die Effizienz der Veranstaltungen beigetragen. Zusätzlich wurde subtile Neupositionierung Borsten organules oft beobachtet, wie ICs wurden beschnitten.
Abb. 1: Pupal Präparation und bildgebenden (A) Die Kiemendeckel wird aus einer Drosophila-Puppe (hier bei 23 h APF gezeigt) entfernt, um den Kopf des ein aussetzennimal. Gepunktete Linie ein Stück doppelseitiges Klebeband. (B) Illustration der einfachen Live-Bildgebung rig. (C und D) Mit Kopf ausgesetzt ist, wird die Puppe an auf der Vaseline Wulst etwa 35 ° ruhen positioniert. (D) Eine stärkere Vergrößerung Bild eines Puppe Spitze der Vaseline Wulst positioniert. Die Position des Deckglases und objektiv dargestellt (nicht maßstabsgetreu). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2: Ein Gradient von Entwicklung in der Puppen Auge. (A) Ein einzelnes Bild eines Puppenaugen bei 22,5 h APF abgebildet. GFP und αCat:: Adhärenzverbindungen durch DE-Cad beschriftet GFP. Eingerahmt Bereich in kommentierten (C). (B) Abbildungen der Mitte der Bühne und voll gemusterten Ommatidien, 24 und 41 h APF auf. Zwei 1 ° s (blau) umgeben eine zentrale Gruppierung von vier Zapfen (weiß). Mit 41 h APF der Strukturierung interommatidial Zellen (hellgrau) ist komplett: drei 3 ° s besetzen alternative Knoten und eine einzige 2 ° bildet jede Seite des Sechsecks. Drei Borsten organules (dunkelgrau) umgeben jeden Ommatidium. (C) Annotation von einem kleinen Bereich des Auges (von A). Zwei 1 ° Zellen (Beispiele Pseudo-Farblicht blau) zu erweitern, um jeden Photorezeptor Bündel zu umgeben. ICs (grün, gelb, rot und blau) interkalieren in einzelne Zeilen. Bei jeder Alternative Vertex drei Zellen konkurrieren (der im Rosa umrissen), um die 3 ° Nische (orangefarben) zu besetzen. See Movies 1-4, um diese Ereignisse zu beobachten Entfaltung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses figur anzeigene.
Abb. 3: Zusammenfassung der Versuchsdurchführung Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Film 1 :. 1 ° Primärverpackungszellen werden aus dem Pool der Zellen, um jede junge Ommatidium ausgewählt. Als zwei 1 ° s umkreisen einander Ommatidium und schließen, Adhärenzverbindungen schnell bilden (rosa Linien). Die geraden 1 ° 1 ° Zellverbindungen zu erweitern und 1 ° s beginnen zu wachsen, isolierende Photorezeptor Bündel aus den umliegenden ICs. Zunächst werden die Photorezeptoren hell leuchten, dichte GFP Markierung aufwendige Adhärenzverbindungen. Morphologische Veränderungen gradual ziehen diese Photorezeptor-Übergänge unter der Ebene der Bilderzeugung und X-förmigen Übergängen zwischen jedem Satz von vier Scheitel Zapfen oberhalb jedes Ommatidium klarer werden. Originalbilder auf der linken Seite; Pseudo-Färbung und Anmerkungen in Form von Tafeln auf der rechten Seite eingeführt. Augen von 21 Stunden APF abgebildet.
Movie 2 :. Interommatidial Zell intercalaction Die interommatidial Zellen (ICs) markiert in rot, blau, gelb und grün bilden zunächst einen Quadranten Trennung eines dorsalen (oben) und ventralen (unten) Ommatidium durch einen Abstand von zwei Zellen. Die roten und gelben ICs strecken ventral und dorsal bzw. (von t = 42 min), den Kontakt mit Ziel 1 ° s 56 min. Die blauen und grünen ICs entsprechend verlängern, um gegen Ommatidium Ziel. 'Neu' 1 °: IC Kreuzungen schnell seitlich zu erweitern. Bei 112 min die ursprüngliche Quadranten ICs hat voll eingelagerten zu generate eine einzige Reihe von Zellen. Originalbilder auf der linken Seite; Pseudo-Färbung und Anmerkungen in Form von Tafeln auf der rechten Seite eingeführt. Augen von 23 Stunden APF abgebildet.
Movie 3 :. Tertiäre Wettbewerb Bei alternativen Eckpunkte zwei oder drei Zellen (der im Rosa umrissen) konkurrieren um die 3 ° Nische zu besetzen. Scheinbar "Push" ihre Nachbarn beiseite, Zellen erzeugen große Erweiterungen, die zu entgegengesetzten Ommatidien erreichen. Besetzung des 3 ° Nische (orangefarben) ist oft flüchtig und Zellen, die entweder zurückziehen oder werden von ihren Nachbarn aus der Position gedrückt. Bis zum Ende dieser 217 min Film, viele 3 ° Nischen scheinen etabliert. Originalbilder auf der linken Seite; Pseudo-Färbung und Anmerkungen in Form von Tafeln auf der rechten Seite eingeführt. Augen von 23 Stunden APF abgebildet.
Movie. 4: Endgültige Pruning Zellen in der Nähe der Borsten organules durch Apoptose entfernt. Beispiele sind in lila, rot, gelb und blau markiert. Im Laufe der Bildverarbeitung, die Entfernung von Zellen links nur einer 2 ° entlang jeder horizontalen Arm des IC Sechseck. Beschneiden von überschüssigen Zellen auf den diagonalen Seiten der IC Sechs nicht in diesem Film festgehalten. In diesem Genotyp kleinere Fehler in der Platzierung von Borstengruppen wurden häufig beobachtet (vergleiche 2B). Zwei der drei Borstengruppen in Nischen Ecke manövriert während der Bildgebung: Neupositionierung schien durch die Entfernung und die Bewegung der benachbarten ICs erleichtert werden. Originalbilder auf der linken Seite; Pseudo-Färbung und Anmerkungen in Form von Tafeln auf der rechten Seite eingeführt. Augen von 26 Stunden APF abgebildet.
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Discussion
Die Beschreibung der Wildtyp-Entwicklung (siehe oben) ist die Basis für Vergleiche der Strukturierung Ereignisse in RNAi oder Überexpression Genotypen. Vergleiche von lebenden Gewebeentwicklung sind von unschätzbarem Wert, wenn genau zu bestimmen, welcher Zellverhalten werden durch ein Protein von Interesse reguliert. Weitere und hier nicht beschrieben, ermöglicht Live Cell Imaging eine qualitative und / oder quantitative Beschreibungen der Rolle eines Gens von Interesse in den Ereignissen, die Muster das Auge zu machen. Mit 30 bis 32 h APF meisten Pigmentzellen haben stabile Positionen erworben und Apoptose überschüssige Zellen aus der Netzhautfeld beschnitten. Anschließend werden nur feine Veränderungen beobachtet, da die Pigmentzellen ihre charakteristischen Formen annehmen: Die 3 ° S werden hexagonal und als 1 ° s subtil expandieren, wobei die Breite der benachbarten rechteckigen 2 ° Zellen abnimmt. Nachfolgende Generation von Pigment und Linsenmaterial wahrscheinlich behindert erfolgreiche Bildgebung Adhärenzverbindungen.
Obwohl ein valuable Strategie, müssen mehrere Fallstricke im Hinterkopf bei der Abbildung des Live-Puppen Auge zu tragen. Zuerst das Entfernen der vorderen Puppenhülle macht das Tier besonders anfällig für Austrocknung, Überhitzung und Verletzungen bei der Montage und Imaging. Beleidigungen wie diese können Daten durch Induktion atypischen Gewebeentwicklung, die nicht relevant für den Genotyp untersuchten verwechseln. Zweitens ist die hier beschriebene Protokoll erfordert, dass ein Deckglas in direkten Kontakt mit dem Puppenkopf-Epithel. Wir haben beobachtet, dass die Netzhautentwicklung Stände, wenn übermäßiger Druck ausgeübt wird, beim Schieben des Deckglases vor dem Auge. Tatsächlich exogene mechanische Kräfte haben in anderen Systemen gezeigt, dass Entwicklungsprozesse beeinflussen, einschließlich Gewebearchitektur 19,20. Aus diesen Gründen ist es wichtig, ganz sanft legen Sie das Deckglas vor die Augen. Darüber hinaus sollten abgebildet Puppen von der Bild rig gerettet werden und darf als Erwachsene entstehen: Artefakte während der Bildgebung eingeführt könnenoft durch Vergleich des abgebildeten Auge dieser Erwachsenen mit den Augen von alters entfernt von der ursprünglichen Quer detektiert werden. Ferner müssen die Daten aus mehreren Bilderzeugungseinheiten verglichen werden, um Zellverhalten zu überprüfen. Schließlich sollte Standard Immunofluoreszenz verwendet, um zu bestimmen, ob die Anordnung, Größe und Anzahl von Zellen in der Stufe angepassten Gewebe gleich sind.
Ektopische Dcr-2 wird häufig verwendet, um die Wirksamkeit von RNAi zu verbessern. Jedoch in Gegenwart von ektopischen Dcr-2 IC Interkalation Stabilisierung des 3 ° Nische und Apoptose wurden vorübergehend gestört (Daten nicht gezeigt). So sollte Dcr-2-Expression mit Vorsicht angewendet werden.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet GFP zu Label Adhärenzverbindungen und bewerten Morphogenese von Pigmentzellen in der Puppen Auge. Diese Strategie könnte leicht für andere Zwecke modifiziert werden (zB auf Photorezeptor Morphogenese bewerten). Für eine Doppelmarkierungsansatz zusätzliche UAS-Transgene, die anderen zellulären Komponenten von Interesse (zB Sekretärin Vesikel, Endoplasmatischen Retikulum, Zellkern) mit nicht-GFP-Tags zu kennzeichnen könnte integriert werden. Doch die Intensität und die Langlebigkeit dieser Transgene werden Bewertung erforderlich: RFP, DsRed und mCherry beispielsweise haben sich als schlechte Etiketten zur Abbildung des Puppen Auge für die längere Zeit benötigt, um Pigmentzellmusterungs erfassen (Daten nicht gezeigt). Wenn die Untersuchung schnellen Zellverhalten (zB Sekretion) die hier beschriebene Protokoll könnte leicht für die konfokale Mikroskopie von geeigneten fluoreszierenden Proteinen modifiziert werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
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