Abstract
Iboende prosesser av Drosophila pupal utvikling kan skifte og forvrenge øyet epitel på måter som gjør enkelte celle atferd vanskelig å spore under live celle bildebehandling. Disse fremgangsmåter omfatter: retinal rotasjon, cellevekst og organisme bevegelse. I tillegg bretter uregelmessigheter i topologien av epitel, inkludert subtile støt og ofte innført som puppe er forberedt for bildebehandling, gjør det utfordrende å skaffe i fokus bilder av mer enn noen få ommatidia i et enkelt fokusplanet. Arbeidsflyten skissert her remedier disse problemene, noe som gir enkel analyse av cellulære prosesser i løpet av Drosophila pupal øye utvikling. Passende-iscenesatt puppe er ordnet i en bilderigg som enkelt kan monteres i de fleste laboratorier Ubiquitin-DE-cadherin:. GFP og GMR-GAL4 -driven UAS-α-catenin: GFP brukes til å visualisere cellegrensene i øyet epitel 1 -3. Etter dekonvolvering erpåføres fluorescerende bilder tatt på flere fokalplanene maksimumsprojeksjonsbilder generert for hvert tidspunkt og forbedret ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. Justerings algoritmer brukes til raskt å stabilisere overflødig bevegelse, noe som gjør enkelte celle atferd lettere å spore.
Introduction
Forbindelsen Drosophila øye er karakterisert ved den stereotype arrangement av dets ~ 750 ommatidia adskilt av en honeycomb-gitteret av aksessoriske pigmentceller 4,5. Disse pigmentceller er mønstret av en koordinert kombinasjon av begivenheter: lokale celle bevegelser, cellevekst, endringer i cellen form, og apoptose. Live-visualisering av dette Epitel gjør det interessant å studere de molekylære mekanismene som ligger til grunn disse hendelsene i en fysiologisk relevant og uaffisert tredimensjonal sammenheng.
I motsetning til tidligere protokoller 6,7, den teknikk som er beskrevet her innbefatter en effektiv metode for stabilisering av ytre vev bevegelse som ikke kan være koplet fra avbildningsprosessen. Denne metoden forbedrer studier av celle oppførsel i utviklings Drosophila pupal øye epitel - en vev som vokser, roterer, og skift i løpet av bildebehandling. I tillegg motion-stabilisering teknikk debeskrevet her vil være nyttig for å studere celler i andre sammenhenger hvor overflødig bevegelse oppstår.
For å visualisere cellegrensene i Drosophila retinal feltet, ble transgene snørene generert som uttrykker ubi-DE-cadherin: GFP samt UAS-α-catenin: GFP under kontroll av øyet spesifikke driver GMR-GAL4 1-3. Bruken av to GFP-merket membranmarkører tillater visualisering av cellegrensene ved lavere intensitet lys. Dette reduserer vevsskade og fotobleking på gjentatt eksponering for høy energi bølgelengder, som gir økt bildefrekvens og film varighet. Å forbedre effekten av RNAi transgener, UAS-DCR-2 ble også innlemmet i en annen fluesnøre 8.
I en tredje oppdatering fra tidligere protokoller, er en enklere avbildning rigg som er lett å montere i de fleste laboratorier er beskrevet. Denne anordning eliminerer behovet for å ha en spesialisert avbildning rig generert av et universitet er "maskinverksted" eller lignende tjeneste. Denne bilderigg er lik den som brukes til bilde andre pupal vev 9,10.
Presenteres her er en enkel levende-cell imaging protokoll som kan brukes til å vurdere de morphogenetic hendelser som bidrar til øye mønster fra ~ 17-42 timer etter puparium dannelse (hr APF) direkte. Spesielt denne protokollen gjør det mulig å bestemme konsekvensene av å endre genuttrykk under pupal utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 3 viser en oppsummering av den eksperimentelle prosedyre.
1. Vevspreoarerlng
- Å bestemme konsekvensene av endret uttrykk av et gen av interesse, sette opp følgende innlegg duplikat og opprettholde ved 25 ° C: UAS-transgene (menn) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (jomfruelige hunner) NB: For å få kontroll vev kryss UAS-lacZ hanner til GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP kvinner. β-Galactosidase genererer ingen feil i celle atferd i netthinnen.
- Å forbedre effekten av RNAi transgener, menn kryss UAS-RNAi til GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b jomfruelige kvinner.
MERK: Sporadiske feil i celle atferd i retinae uttrykker ektopisk DCR-2 har blitt observert (data ikke vist). Årvåkenhet anbefales hvis du bruker denne tilnærmingen. - Sutvalgte hvite pre-puppe av hensiktsmessige genotyper og plasser i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Hvis puppe uttrykke DCR-2, velger du enten mannlig eller kvinnelig puppe: uttrykk for UAS-DCR-2, et innstikk på X-kromosomet, er sterkere hos menn. Puppe bør sexed på 0 hr APF før pigmentering av pupal tilfelle - gonadene av hannene er synlige som store gjennomsiktige globuser på den laterale sider av puppe (ca. en tredel fra posterior).
- Ruge mikrosentrifugerør inneholder puppe, i en ren plastspiss-boksen ved 25 ° C. For å hindre uttørking av puppe sted en 10 cm to stykke vev, dynket i destillert vann, inn i tip-boksen.
MERK: hvis fuktigheten i tip-boksen blir for høy pupal saken kan bli blaut og vanskelig å dissekere i påfølgende trinn. - Inkuberes i passende tid. Å fange celle atferd assosiert med mønstring av øyet, forberede puppe for bildebehandling på rundt 17 hr APF, 20 hr APF eller 24 timers APF. Se Representative Resultater for videre diskusjon om når spesifikke celle atferd er best observert.
- Legg et stykke fersk dobbeltsidig teip på en svart Sylgard disseksjon parabolen. Plasser en puppe, dorsal side opp, med hodet av puppe levd opp til den tosidige tapen (figur 1A) .Prøv ikke å følge thorax og buk regioner av puppe til dobbeltsidig tape. Med pinsett forsiktig løft og fjern operculum å eksponere pupal hodet. Rive langs siden av pupal tilfelle å eksponere området rundt et øye.
- Fjerne puppe fra teip forsiktig. Hvis puppe forblir tilhenger, påfør en liten mengde destillert vann til krysset mellom pupal sak og tape til å svekke vedheft.
2. Montering
- Konstruer en liten 15 mm 2 ramme fra trekkpapir og slå et hull i middlethat er 5.5 mm i diameter (figur 1B). Fordyp i destillert vann og plasser imidten av et objektglass. Ved hjelp av en 30 cc sprøyte, presse ut en uniform ring av vaselin for å omgi trekkpapir ramme. Sikre at vaselin ringen er marginalt høyere enn bredden av puppe, og at diameteren av ringen er marginalt mindre enn bredden av et dekkglass.
- Legg en liten perle av petroleum gelé direkte på lysbildet, i hullet inn i trekkpapir (figur 1C) .Carefully ordne puppe, på sin side, støttet av vaselin perle (figur 1D).
- Plasser et dekkglass på toppen av vaselin ringen slik at den kontakter epitel over øyet neuroepithelium (figur 1D). Forsiktig komprimere preparatet for å forsegle dekk mot vaselin og generere en liten flat kontaktoverflate mellom pupal øyet regionen og dekkglass.
3. Fluorescens Imaging
- Bilde pupal forberedelse på enfluorescerende mikroskop. Hver 7 min fangst seriesnitt gjennom den apikale domenet av øyet neuroepithelium, i området ved adherens veikryss.
MERK: a) Passende seriesnitt er vanligvis 4-5 per z-stack består av 0,2 mikrometer z-trinn. b) Uregelmessigheter i topologien av epitel, inkludert milde støt og folder, kan gjøre det utfordrende å skaffe i fokus bilder av store regioner av vev. Mens bildebehandling, kan man finne en del av et område av interesse å være i fokus, og en naboregionen å være ute av fokus. Inkludert en liten dråpe med destillert vann mellom pupal øyet og dekk kan eliminere noen akutte vev folder, men ikke den mildt ujevn topologi karakteristisk for de tidlige stadiene av pupal øye morphogenesis. I slike tilfeller oversample vevet ved å utvide z-stack til i-fokus skiver overtas til hele feltet. c) Å fange seriesnitt hvert 7 min bør sette levende-imaging for 3 til 4 timer uten en betydelig reduDette skjer i intensiteten av GFP fluorescens som kan kompromittere bildekvalitet. Kortere tidsintervaller kan redusere den totale tiden for bildebehandling. - Fortsett avbildning i 3 til 4 timer. Ikke bruk en automatisk fokus og tid funksjon som er tilgjengelig på mange fluorescerende mikroskop siden pupal vekst og pumping av hemolymph flytter posisjon av netthinnen og årvåken re-fokusere kreves hver 14-21 min. MERK at bildebehandling utover 4 timer kan bremse eller stoppe morphogenesis av øyet.
- Bruk passende dekonvolvering programvare for å redusere bakgrunns og forbedre kontrasten av serieseksjons bilder. For hver z-stack fil, utføre følgende i LAS AF-programvare (se tabell of Materials): Gå til Verktøy-panelet, velger du 3D Deconvolution og klikk Bruk.
- Generere en maksimal projeksjon (MP) bilde for hvert deconvoluted stabel fil: Naviger til Verktøy-panelet, velger 3D-projeksjon og klikk Bruk.
MERK: Maksimal Projection algoritmen kan mislykkes i å generere en uniformly i fokus bilde for vev som er blitt oversamplede. En teknikk for å skjerpe ut-av-fokus områder er skissert i trinn 5.2.
4. Post-bildebehandling pupal Rescue and Fenotype Verification
- Å ta opp hvorvidt gjenstander ble innført eller puppe skadet under bildebehandling, fjern forsiktig puppe fra bilderigg: ved hjelp av pinsett fjerne dekkglass og overføre puppe til et rent hetteglass med mat. Oppbevares i romtemperatur eller 25 ° C til voksen flue framgår.
- Undersøke nøye fenotype av den voksne øyet og sammenligne med øynene til voksne fluer som kommer ut av den opprinnelige fly korset.
5. Bildebehandling
- Automatisk Bildejustering:
MERK: Det levende Drosophila vev vil skifte og vokse gjennom hele bildeprosessen. Følgelig sentrene av bildene samlet på påfølgende tidspunkter ikke samsvarer med det samme punktet i Drosophila vev. I tilleggHele retinal platen roterer omtrent 30 ° mellom ~ 21 og 23 hr APF. Å fremheve enkelte celle atferd og redusere distraksjoner forårsaket av organisme vekst, justere hver MP image.While dette kan utføres manuelt, bilderedigeringsprogramvaren som brukes her (se tabell of Materials) har innebygde algoritmer som kan fremskynde prosessen.- Fra Fil-fanen i hovedmenyen, åpne Scripts og velg Load Files inn Stack.
- Importere MP bildefiler til last Lag-panelet, og velg OK. Kontroller at Forsøk å Juster Kilde Images alternativet Automatisk ikke er valgt.
MERK: Hvis dette alternativet er valgt, kan programvaren bruker en justeringsalgoritme som forvrenger bildedataene. - Når alle MP filer har lastet inn i Layers-ruten, sørg for at alle bildene er i kronologisk rekkefølge slik at det tidligste tidspunktet er på toppen av laget stabelen. Hvis lagene er ikke i riktig rekkefølge, dra og slippe dem til de er beordretriktig.
- Velg automatisk justering av lag fra Rediger-fanen i hovedmenyen. Velg Flytt, og klikk OK.
- Hvis Auto-Align algoritmen ikke klarer å orientere rammene til en relevant brennpunkt, foreta mindre justeringer ved hjelp av flytteverktøyet.
- Kompositt Sliping:
MERK: Ut-av-fokus regioner i en innledende Mp bilde kan slipes ved 'beskjæring' tilsvarende deconvoluted stabelen i LAS AF programvare. Beskjæring en stabel fil gjør det mulig å manuelt begrense intervallet av en z-stack som er utsatt for maksimal projeksjon algoritme.- Finn Crop-funksjonen i Verktøy-panelet (under fanen Process). Manuelt begrense de innledende og avsluttende skiver slik at de strekker seg bare klebebåndet i utgangspunktet ut-av-fokus-regionen. Klikk Bruk for å generere en ny bunke fil som er optimalisert for denne regionen.
- Generere en ny Maksimal Projection for lokalt optimalisert stabelen og eksport som en TIFF-fil.
- I the bilderedigeringsprogrammet (se tabell of Materials), åpne Scripts (ligger i Fil-fanen i hovedmenyen) og velg Last filer til Stack.
- Importere den første MP bildefilen og lokalt optimalisert MP fil for et bestemt tidspunkt til last Lag-panelet, og velg OK. Kontroller at Forsøk å Juster Kilde Images alternativet Automatisk ikke er valgt.
- Velg begge lag i Lag-panelet, og velg deretter Auto-Blend Layers (ligger i Rediger-fanen i hovedmenyen) for automatisk å maskere de aktuelle områdene i de to bildene, noe som gir et jevnt i-fokus retinal feltet. Lagre dette sammensatt bilde som en TIFF-fil.
- Gjenta trinn 5.2.1 gjennom 5.2.5 for alle suboptimale MP bilder.
- Ytterligere Justeringer: rotere, beskjære og justere nivåene av filmen Layers:
- Med alle lagene valgt, bruker Transform verktøyet (Edit> Free Transform) for å rotere bildene, slik at rygg-ventral aksen av netthinnen er alignedtil y-aksen av videobildet.
- Bruk om nødvendig beskjæringsverktøyet for å redusere synsfeltet til en ønsket størrelse og form.
- Bruk nivåjustering (av enkeltbilder) for å bidra til å forbedre kontrasten mellom cellemembranen og cellelegemet.
- For stilistiske formål og for å understreke spesifikke celle atferd, introdusere falske farger for å markere punkter av interesse i hver ramme.
- Animasjon: konvertere bilder i en film:
- Åpne Animasjon ruten fra Windows-kategorien i hovedmenyen. Velg Gjør Rammer fra Layers fra menyen øverst til høyre hjørne av Animation ruten.
- Legg merke til at lagene er lagt inn i animasjonen ruten i sekvensiell rekkefølge som begynner fra bunnen av stabelen. Å snu rekkefølgen av rammene, først velge alle rammer og velg Reverse Frames fra Animation rutemenyen deretter.
- Velg en ramme forsinkelsestid for hver ramme ved hjelp av rullegardinmenyen under rammen tommelenspiker.
MERK: Rammen forsinkelse for filmer 1 til 4 presentert i denne artikkelen er 0,8 sek. - Fra Fil-fanen i hovedmenyen, åpne Eksport og velg Render Video. Velg QuickTime-eksport i henhold File Options og velge ønsket video format. Under Render Options satt Frame Rate til Custom, skriv en bildefrekvens på 15, og klikk Render.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live-avbildning av pupal øyet er en vellykket strategi for å observere celle atferd som bidrar til mønstring av neuroepithelium. Rollen av spesifikke proteiner kan lett bedømmes ved å uttrykke transgener som modifiserer proteinnivåer under øyet utvikling. For å gjøre dette GMR-GAL4 brukes til å drive transgene uttrykk bak morfogenetisk fure. Dette har fordelen av å ikke perturbing tidligere hendelser som etablerer øyet feltet i løpet av de to første larve instars. I tillegg bruker mange RNAi transgener krever betydelig tid til å effektivt redusere protein nivåer (data ikke vist). Derfor kjører RNAi transgener med GMR-GAL4 driver linje gjør ofte tredje larve stadium øye utvikling og vrenging av øyet plater under metamorfose å fortsette uskadd og reduserer proteinnivåer først senere, under pupal øye morphogenesis. Hvis larveutvikling er imidlertid opprørt av en svært effektiv RNAi transgen, fly kors kanopprettholdes ved 18 ° C for å redusere transgene ekspresjon og pupper overført til 25 ° C ved 0 hr APF. Å ta opp effekten av RNAi transgenet uttrykk, avskrift eller protein nivåer bør vurderes i scene-matchet puppe ved hjelp av standard teknikker (f.eks kvantitativ-PCR, immunfluorescens, immunoblotting).
Under larveutvikling, er fotoreseptorlidelser kjerner av hver Ommatidium rekruttert som en bølge som reiser fra bakre til fremre side av øyet plate 11. Denne utviklings gradient ble beholdt i pupal øyet. Faktisk, når avbildes på 22.5 hr APF, fordelingen av GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b retinae var markert mer moden i bakre region (figur 2). Fenotypen til disse retinae var sammenlignbar med den til villtype-stammer flue (data ikke vist). Tradisjonelt pupal øye morphogenesis er beskrevet i henhold til utviklings tid (f.ekshr APF). Men på grunn av den kraftige utviklings gradient vi foreslår beskriver øye mønster etter følgende hendelser:
1 ° innpakning (figur 2 og Movie 1): I utgangspunktet så mange som åtte celler direkte kontaktet fotoreseptorlidelser bunter. To celler - vanligvis de fremre og bakre celler - ble rekruttert som primærvalg (1 ° s). Disse 1s raskt omringet fotoreseptorlidelser bunter, koble til hverandre for å danne stabile veikryss. Udifferensierte interommatidial celler (ICS) lå i en uorganisert måte mellom hver ommatidial gruppering. Samtidig med en ° celle rekruttering, apoptose beskjæres ca 5% av IC basseng som beskrevet tidligere (ikke kommentert i Movie 1) 12.
IC interkalering (figur 2 og Movie 2): Som en ° s pakket og forseglet om hver fotoreseptor bunt, lokal cell bevegelser omorganisert ICs gruppert på dorsal og ventral sider av hver Ommatidium. ICS Pilgrim fra flere (vanligvis to) rader i en enkelt rad. Målet posisjon bevegelige ICs kan trygt spådd i villtype vev ved å observere retnings projeksjon av store 'cellulære utvidelser'. Veksten av en ° celler ledsaget og trolig bidratt til IC interkalering 13. Mange ICs vil gå på å differensiere som sekundære celler (2 ° s) (ikke vist).
3 ° konkurranse (figur 2 og Movie 3): Etter innskyting, tre ICs konkurrerte om å okkupere tertiær (3 °) nisje. I dette dynamiske slaget, celler ofte okkupert 3 ° nisje for så lite som 5 til 10 minutter før de ble fordrevet. Til slutt en enkelt celle etablert en stabil 3 ° nisje.
Endelig beskjæring (figur 2 og Movie 4): En bølge av apoptose 3,15-18 redusert antall kretser til det minimum som kreves for å effektivt generere en ryddig sekskantede IC gitter over sammensatt øye 5,14: tre 3 ° s og seks 2 ° s rundt hver Ommatidium. Som tidligere nevnt, vanligvis de overskytende ICs liggende nærmest busten ble eliminert ved apoptose 7. Vi observerte celledød samtidig med IC interkalering og 3 ° nisje etablering og foreslå at beskjæring av overflødige celler bidratt til effektivisering av disse hendelsene. I tillegg ble subtil reposisjonering av bust organules ofte observert som ICs ble beskjæres.
Figur 1:. Pupal disseksjon og imaging (A) operculum fjernes fra en Drosophila puppe (her vist ved 23 hr APF) å utsette hodet av enNimal. Prikket linje representerer et stykke dobbeltsidig tape. (B) Illustrasjon av den enkle levende bilderigg. (C og D) Med hodet avdekket, er puppe plassert på ca 35 ° hviler på vaselin perle. (D) høyere forstørrelse av en puppe plassert på toppen av vaselin perle. Plasseringen av dekkglass og målsetting er illustrert (ikke trukket til skala). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: En gradient av utvikling over hele pupal øyet. (A) Et enkelt bilde av en pupal øye avbildes ved 22,5 timers APF. Adherens veikryss er merket av DE-Cad: GFP og αCat: GFP. Boxed regionen er kommentert i (C). (B) Illustrasjoner av mid-scenen og fullt mønstrede ommatidia, på 24 og 41 timers APF hhv. To 1 ° s (blå) omringe en sentral gruppering av fire kjegleceller (hvite). Med 41 timers APF mønstring av interommatidial celler (lys grå) er fullført: tre 3 ° s okkupere alternative hjørner og en enkelt 2 ° skjemaer på hver side av sekskanten. Tre bust organules (mørk grå) omgir hver Ommatidium. (C) Merking av et lite område av øyet (fra A). To 1 ° celler (eksempler pseudo-farget lys blå) utvides til å omringe hver fotoreseptor bunt. ICs (grønn, gul, rød og mørk blå) intercalate til enkle rekker. På hvert alternativ toppunkt tre celler konkurrere (skissert i rosa) for å okkupere 3 ° nisje (farget oransje). Se filmer 1-4 å observere disse hendelsene utfolder seg. Klikk her for å se en større versjon av denne figure.
Figur 3:. Oppsummering av den eksperimentelle prosedyren Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1 :. Primær innpakning en ° celler er valgt fra bassenget av celler som omgir hver nystartede Ommatidium. Som to 1 ° s omkranser hver Ommatidium og koble til, adherens veikryss raskt danne (rosa linjer). De rette en °: 1 ° celle veikryss utvide og 1 ° s begynner å vokse, isolerende fotoreseptorlidelser bunter fra de omkringliggende kretser. Utgangspunktet fotoreseptorene gløde brightly, tett GFP merking forseggjort adherens veikryss. Morfologiske endringer gradually trekke disse fotoreseptorlidelser veikryss under planet for bildebehandling og X-formede overgangene mellom hvert sett med fire apikale membran celler oppå hverandre Ommatidium blir tydeligere. Originalbilder på venstre; pseudo-farging og merknader introdusert i paneler på høyre. Eye avbildes fra 21 hr APF.
Movie 2 :. Interommatidial celle intercalaction De interommatidial celler (ICS) uthevet i rødt, blått, gult og grønt i utgangspunktet danne en kvadrant som skiller en dorsal (øverst) og ventral (nederst) Ommatidium med en avstand på to celler. De røde og gule ICs strekke ventralt og dorsally henholdsvis (fra t = 42 min), ta kontakt med target 1 ° s med 56 min. De blå og grønne ICs også utvide å målrette motsatt Ommatidium. 'Nye' 1 °: IC veikryss raskt utvide sidelengs. 112 min opprinnelige kvadranten av ICs har fullt interkalert å generate en enkelt rad av celler. Originalbilder på venstre; pseudo-farging og merknader introdusert i paneler på høyre. Eye avbildes fra 23 hr APF.
Movie 3 :. Tertiær konkurranse på alternative hjørnene to eller tre celler (skissert i rosa) konkurrerer om å okkupere 3 ° nisje. Vises til "push" sine naboer til side, celler genererer store utvidelser som kommer mot motsatt ommatidia. Opptar 3 ° nisje (farget oransje) er ofte flyktig og celler enten trekke tilbake eller blir skjøvet ut av posisjon av sine naboer. Ved slutten av denne 217 min film, synes etablert mange 3 ° nisjer. Originalbilder på venstre; pseudo-farging og merknader introdusert i paneler på høyre. Eye avbildes fra 23 hr APF.
Movie. 4: Slutt Kutting Celler i nærheten av bust organules fjernes ved apoptose. Eksempler er markert med rødt, rødt, gult og blått. I løpet av bildebehandling, fjerning av celler igjen bare ett 2 ° langs hver horisontale armen til IC sekskant. Beskjæring av overflødige celler på de diagonale sider av IC sekskanten ble ikke fanges opp i denne filmen. I denne genotype mindre feil i plasseringen av bustgrupper ble ofte observert (sammenlign med figur 2B). To av de tre bustgrupper manøvreres inn i hjørne nisjer under avbildning: re-posisjonering syntes å lettes ved fjerning og flytting av tilgrensende kretser. Originalbilder på venstre; pseudo-farging og merknader introdusert i paneler på høyre. Eye avbildes fra 26 hr APF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrivelsen av vill type utvikling (over) danner grunnlag for sammenligninger av mønstrings hendelser i RNAi eller høyekspresjonsystemer genotyper. Sammenligninger av levende vev utvikling er uvurderlig når man skal avgjøre hvilke celle atferd er regulert av et protein av interesse. Videre, og som ikke er beskrevet her, live cell imaging gjør en til å gjøre kvalitative og / eller kvantitative beskrivelser av rollen av et gen av interesse i hendelsene som mønster øyet. Etter 30-32 timers APF fleste pigmentceller har kjøpt stabile posisjoner og apoptose har luket overflødige celler fra retinal feltet. Etter dette er det bare små endringer observert som pigment cellene vedta sine karakteristiske former: 3 ° s blitt sekskantet, og som en ° s subtilt utvide, bredden av nabo rektangulære 2 ° celler avtar. Påfølgende generasjon av pigment og glassmateriale sannsynlig vanskeliggjør vellykket avbildning av adherens veikryss.
Selv om en valuable strategi, må flere fallgruver tas i betraktning når bildebehandling live pupal øyet. Først fjerner fremre pupal tilfelle gjør dyret spesielt utsatt for dehydrering, overoppheting og skade under montering og bildebehandling. Fornærmelser som disse kan forvirre data ved å indusere atypisk vev utvikling som ikke er relevant for den genotype som undersøkes. For det andre protokollen beskrevet her krever at et dekkglass foreta direkte kontakt med pupal hodet epitel. Vi har observert at retinal utvikling boder hvis overdreven trykket er brukt når presser dekk mot øyet. Faktisk eksogen mekaniske krefter har vært vist i andre systemer for å påvirke utviklingsprosesser inkludert vevsarkitektur 19,20. Av disse grunner er det viktig å meget forsiktig plassere dekkglasset mot øyet. I tillegg bør avbildes puppe bli reddet fra bilderigg og lov til å fremstå som voksne: gjenstander introdusert under avbildning kanofte bli detektert ved å sammenligne den avbildede øyne av disse voksne med øyne av alderstilpassede fluer fra den opprinnelige korset. Videre må data fra flere bildebehandlings økter sammenlignes for å kontrollere celle atferd. Endelig bør standard immunofluoresence brukes til å bestemme hvorvidt anordningen, størrelsen og antall celler i fase-matchet vev er de samme.
Ektopisk DCR-2 blir ofte brukt for å forbedre effekten av RNAi. Men i nærvær av ektopisk DCR-2, IC interkalering, stabilisering av 3 ° nisje og apoptose ble tidvis avbrutt (data ikke vist). Dermed DCR-2 uttrykk bør brukes med forsiktighet.
Protokollen er beskrevet her benytter GFP til etiketten adherens veikryss og vurdere morphogenesis av pigmentceller i pupal øyet. Denne strategien kan lett modifiseres til andre formål (for eksempel for å vurdere fotoreseptor morphogenesis). For en dobbel-merking tilnærming, ekstra UAS transgener som etikett andre cellulære komponenter av interesse (f.eks sekretær blemmer, endoplasmatisk retikulum, nucleus) med ikke-GFP-koder kan bli innarbeidet. Men intensiteten og holdbarheten av disse transgener vil kreve vurdering: RFP, DsRed og mCherry, for eksempel, har vist seg å være dårlige etiketter for bildebehandling pupal øye for de lengre perioder som kreves for å fange pigment celle mønster (data ikke vist). Hvis undersøke raske celle atferd (f.eks sekresjon) protokollen som er beskrevet her kan lett endres for konfokalmikroskopi av egnede fluorescerende proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
