Abstract
Processos inerentes de Drosophila desenvolvimento pupal pode mudar e distorcer o epitélio olho nas maneiras que fazem comportamento célula individual difícil de controlar durante imagens de células vivas. Estes processos incluem: rotação da retina, crescimento celular e movimento do organismo. Além disso, as irregularidades na topologia do epitélio, incluindo colisões sutis e dobras muitas vezes apresentado como o pupa é preparado para a imagem latente, fazer-se um desafio para adquirir imagens com foco de mais do que alguns ommatidia em um único plano focal. O fluxo de trabalho descrito aqui remédios esses problemas, permitindo uma fácil análise de processos celulares durante Drosophila desenvolvimento pupal olho. Apropriadamente pupas-staged estão dispostos em uma plataforma de imagiologia que podem ser facilmente montados na maioria dos laboratórios de Ubiquitina-DE-caderina:. GFP e GMR-GAL4 UAS -driven-α-catenina: GFP são utilizados para visualizar os limites da célula no epitélio do olho 1 -3. Após deconvolution éaplicado a imagens fluorescentes capturados em múltiplos planos focais, as imagens de projecção máximos são gerados para cada ponto de tempo e aumentada utilizando software de edição de imagem. Algoritmos de alinhamento são usados para estabilizar rapidamente movimento supérfluo, fazendo com que o comportamento das células individuais mais fácil de controlar.
Introduction
O composto do olho de Drosophila é caracterizada por a disposição dos seus estereotipado ~ 750 ommatidia separadas por um favo de mel-reticulado de células de pigmento acessório 4,5. Estas células de pigmento são modeladas por uma combinação coordenada de eventos: movimentos locais de células, crescimento de células, alterações na forma da célula, e a apoptose. Visualização vivo deste epitélio permite estudar os mecanismos moleculares subjacentes a esses acontecimentos num contexto tridimensional fisiologicamente relevante e não perturbada.
Em contraste com os protocolos anteriores 6,7, a técnica descrita aqui incorpora um método eficiente para estabilizar o movimento tecidos estranhos que não pode ser desacoplado do processo de imagiologia. Este método aumenta a estudos de comportamento de células no desenvolvimento de Drosophila epitélio pupa olho - um tecido que cresce, gira, e deslocamentos ao longo da imagem. Além disso, a estabilização de movimento técnica dedescrito aqui será útil para estudar as células em outros contextos em que ocorre o movimento estranho.
Para visualizar os limites das células no campo de retina de Drosophila, mosca linhas transgénicas foram geradas que expressam ubi-DE-caderina: GFP, bem como UAS-α-catenina: GFP sob o controlo do controlador do olho GMR-GAL4 específico 1-3. A utilização de dois marcadores de membrana GFP permite a visualização de limites da célula com menor intensidade de luz. Isso minimiza o dano tecidual e fotodegradação na exposição repetida a comprimentos de onda de alta energia, permitindo uma maior taxa de quadros e duração do filme. Para melhorar a eficácia de transgenes RNAi, UAS-DCR-2 também foi incorporada uma segunda linha de fly 8.
Numa terceira actualização de protocolos anteriores, um equipamento de imagem simples que pode ser facilmente montado na maioria dos laboratórios é descrito. Este aparelho elimina a exigência de ter uma imagem r especializadaig gerado por uma universidade "máquina shop 'ou serviço similar. Este equipamento de imagem é semelhante ao utilizado para a imagem de outros tecidos pupa 9,10.
É apresentado aqui um protocolo de imagens ao vivo de células simples que pode ser usado para avaliar directamente os eventos morfogenéticas que contribuem para a modelação do olho de ~ 17 e 42 horas após a formação pupário (hr APF). Especificamente, este protocolo permite que se determinar as conseqüências de modificar a expressão de genes durante o desenvolvimento de pupa.
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Protocol
A Figura 3 mostra um resumo do procedimento experimental.
1. Preparação do Tecido
- Para determinar as consequências de expressão modificada de um gene de interesse, configure o seguinte cruzamento em duplicado e mantida a 25 ° C: UAS-transgene (machos) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; NOTA + / SM5-TM6b (fêmeas virgens): Para obter o controle cruzado tecido UAS-lacZ machos para GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: fêmeas GFP. β-galactosidase não gera defeitos no comportamento de células na retina.
- Para melhorar a eficácia de transgenes RNAi, cross UAS-RNAi machos para GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b fêmeas virgens.
NOTA: defeitos ocasionais no comportamento de células que expressam em retinas foram observados ectópica DCR-2 (dados não mostrados). Vigilância é recomendado se usar essa abordagem. - Seleito branco pré-pupas de genótipos adequados e coloque em 1,5 ml microtubos. Se as pupas expressar DCR-2, selecione pupas macho ou fêmea: expressão de UAS-DCR-2, uma inserção no cromossomo X, é mais forte nos machos. As pupas devem ser sexados a 0 hr APF antes de pigmentação do caso de pupa - as gônadas dos machos são visíveis como grandes globos translúcidos nas laterais da pupa (cerca de um terço do posterior).
- Incubar microtubos contendo pupas, em um plástico ponta-box limpo a 25 ° C. Para evitar a dessecação de lugar pupas a 10 cm2 pedaço de tecido, embebido em água destilada, em ponta-box.
NOTA: se a umidade na ponta-box se torna muito alto o caso de pupa pode ficar encharcado e difícil de dissecar em etapas subsequentes. - Incubar por tempo apropriado. Para capturar comportamentos celulares associados a padronização do olho, preparar pupas para geração de imagens em torno de 17 horas APF, 20 horas ou 24 horas APF APF. Veja resultados representativos para uma discussão mais aprofundada sobre quando os comportamentos específicos de células são melhor observados.
- Coloque um pedaço de fita dupla face fresco em um Sylgard preto dissecção prato. Posicione um lado pupa, dorsal para cima, com a cabeça do pupa aderida à fita (Figura 1A) de dupla face .Try a não aderirem a região torácica e abdominal da pupa à fita dupla face. Com uma pinça cuidadosamente levantar e remover o opérculo para expor a cabeça de pupa. Rasgar ao longo do lado da caixa de pupa para expor a área em torno de um olho.
- Remova cuidadosamente a pupa da fita adesiva. Se a pupa permanece aderente, aplique uma pequena quantidade de água destilada para a junção entre o caso de pupa e fita adesiva para enfraquecer a aderência.
2. Montagem
- Construa um pequeno 15 mm 2 moldura de papel mata-borrão e perfurar um buraco no middlethat é de 5,5 mm de diâmetro (Figura 1B). Mergulhe em água destilada e colocar emo centro de uma lâmina de microscópio. Usando uma seringa de 30 cc, esprema um anel uniforme de vaselina para cercar o quadro de papel mata-borrão. Certifique-se de que o anel de vaselina é marginalmente maior do que a largura da pupa e que o diâmetro do anel é ligeiramente menor que a largura de uma lamela de cobertura.
- Adicionar uma pequena gota de vaselina directamente sobre a lâmina, no furo perfurado para o papel absorvente (Figura 1C) .Carefully providenciar a pupa, por seu lado, apoiado pelo rebordo vaselina (Figura 1D).
- Coloque uma lamela em cima do anel de vaselina para que ele contata o epitélio acima do neuroepithelium olho (Figura 1D). Gentilmente comprimir a preparação para selar a lamela contra a vaselina e gerar uma pequena superfície de contato plana entre a região dos olhos pupa e lamela.
3. Imagem de Fluorescência
- Imagem a preparação de pupa usando ummicroscópio fluorescente. Cada 7 min captura secções em série através do domínio apical do neuroepitélio olho, na região das junções aderentes.
NOTA: a) cortes seriados apropriados são geralmente 4-5 por z-stack composta de 0,2 um z-passos. b) Irregularidades na topologia do epitélio, incluindo colisões leves e dobras, pode tornar-se um desafio para adquirir imagens com foco de grandes regiões do tecido. Enquanto imagem, pode-se encontrar parte de uma área de interesse para ser em foco, e uma região vizinha de estar fora de foco. Incluindo uma pequena gota de água destilada entre o olho pupa e lamela pode eliminar algumas dobras de tecido aguda, mas não a característica topologia levemente desigual dos estágios iniciais da morfogênese olho de pupa. Nesses casos sobreamostra o tecido através do alargamento do z-stack até em foco fatias são adquiridos para todo o campo. c) A captura de cortes seriados a cada 7 min deve habilitar live-imagiologia por 3 a 4 horas sem uma redu significativasç ã o da intensidade da fluorescência da GFP que pode comprometer a qualidade da imagem. Intervalos de tempo mais curtos pode reduzir o tempo total da imagem. - Continuar imagiologia por 3 a 4 horas. Não use um foco automático e função do tempo que está disponível em muitos microscópios fluorescentes desde que o crescimento de pupa e bombeamento da hemolinfa move a posição da retina e vigilante re-focagem é necessária a cada 14-21 min. NOTA que a imagem para além das 4 horas podem retardar ou parar a morfogênese do olho.
- Use software deconvolution apropriado para reduzir o fundo e aumentar o contraste das imagens de cortes de série. Para cada arquivo z-stack, faça o seguinte no software LAS AF (ver Tabela de Materiais): Vá até o painel Ferramentas, selecione Deconvolution 3D e clique em Aplicar.
- Gerar imagem para cada arquivo de pilha deconvoluídos uma projeção máxima (MP): Vá até o painel Ferramentas, selecione Projeção 3D e clique em Aplicar.
NOTA: O algoritmo de máxima de projeção pode falhar para gerar um uniformely imagem em foco para o tecido que foi oversampled. Uma técnica para afiar as regiões fora de foco é descrito na etapa 5.2.
4. Pós-Imaging Resgate Pupal e Verificação Fenótipo
- Para avaliar se os artefatos foram introduzidos ou a pupa prejudicado durante o exame, retire cuidadosamente a pupa da plataforma de imagem: usando uma pinça retire a lamela e transferir a pupa para um frasco limpo de alimentos. Guarde-o em temperatura ambiente ou 25 ° C até que a mosca adulta emerge.
- Examine cuidadosamente o fenótipo do olho adulto e comparar com os olhos de moscas adultas emergentes da cruz fly inicial.
5. Processamento de Imagem
- Alinhamento automático Image:
NOTA: O tecido Drosophila ao vivo vai mudar e crescer ao longo do processo de imagem. Consequentemente, os centros de imagens recolhidas nos sucessivos pontos de tempo pode não corresponder ao mesmo ponto no tecido Drosophila. Além disso, oToda disco retinal gira cerca de 30 ° entre ~ 21 e 23 hr APF. Para realçar os comportamentos de células individuais e reduzir as distrações causadas pelo crescimento do organismo, alinhe cada MP image.While esta pode ser realizada manualmente, o software de edição de imagem usada aqui (ver Tabela de Materiais) tem algoritmos internos que podem acelerar o processo.- Na guia Arquivo do menu principal, Scripts Abrir e selecione Carregar arquivos em Stack.
- Importe os arquivos de imagem MP no painel Layers de carga e selecione OK. Certifique-se de que a tentativa de alinhar automaticamente Fonte opção Imagens não está marcada.
NOTA: Se esta opção for selecionada, o software pode utilizar um algoritmo de alinhamento que distorce os dados da imagem. - Uma vez que todos os arquivos MP ter carregado no painel de Layers, certifique-se que todas as imagens estão em ordem cronológica de tal forma que o ponto de tempo mais próximo está no topo da pilha de camadas. Se as camadas não estão na ordem correta, arraste e solte-os até que eles são ordenadoscorretamente.
- Selecione Auto-Align Layers na guia Editar do menu principal. Escolha Reposition e clique em OK.
- Se o algoritmo Auto-Align não consegue orientar os quadros para um ponto focal relevante, fazer pequenos ajustes usando a ferramenta Move.
- Afiação Composite:
NOTA: regiões Fora de foco de uma imagem inicial MP pode ser aguçado por «culturas 'a pilha deconvoluídos correspondente no software LAS AF. Recorte de uma pilha permite um arquivo para restringir manualmente o intervalo de uma pilha-z que é submetido ao algoritmo de projecção máxima.- Localize a função de corte no painel Ferramentas (na guia Processos). Restringir manualmente as fatias iniciais e finais, que abrangem apenas o cinto de adesão no interior da região inicialmente fora de foco. Clique em Aplicar para gerar um novo arquivo de pilha que é otimizado para esta região.
- Gerar uma nova projeção máxima para a pilha otimizado localmente e exportação como um arquivo TIFF.
- Em the software de edição de imagem (ver Tabela de Materiais), Scripts abertas (localizadas na guia Arquivo do menu principal) e selecione Carregar Arquivos na Pilha.
- Importe o arquivo de imagem inicial MP e arquivo otimizado localmente MP para um ponto determinado momento no painel Layers de carga e selecione OK. Certifique-se de que a tentativa de alinhar automaticamente Fonte opção Imagens não está marcada.
- Selecione as duas camadas nas camadas painel e em seguida, escolha Mesclar camadas automaticamente (localizado na guia Editar do menu principal) para mascarar automaticamente as regiões apropriadas das duas imagens, produzindo uma forma uniforme em foco campo da retina. Salve esta imagem composta como um arquivo TIFF.
- Repita os passos 5.2.1 através de 5.2.5 para todas as imagens subótimas MP.
- Outros Ajustes: girar, cortar e ajustar os níveis das camadas de filmes:
- Com todas as camadas selecionadas, use a ferramenta Transform (Edit> Free Transform) para girar as imagens, de modo que o eixo dorso-ventral da retina está alinhadopara o eixo y do quadro de filme.
- Se necessário, use a ferramenta de corte para reduzir o campo de visão para um tamanho e forma desejados.
- Use de ajuste do nível (de quadros individuais) para ajudar a aumentar o contraste entre a membrana celular e do corpo da célula.
- Para efeitos estilísticos e enfatizar comportamentos de células específicas, apresentar falsa cor para destacar pontos de interesse em cada quadro.
- Animação: transformar as imagens em um filme:
- Abra o painel de Animação a partir da guia do Windows do menu principal. Selecione Criar Quadros de Camadas no menu localizado no canto superior direito do painel de Animação.
- Note-se que as camadas são adicionadas ao painel de animação em ordem sequencial começando a partir do fundo da pilha. Para inverter a ordem dos quadros, primeiro selecione todos os quadros e, em seguida, selecione Inverter quadros a partir do menu do painel Animação.
- Selecione um tempo de retardo de imagem para cada quadro usando o menu suspenso abaixo do polegar quadroprego.
NOTA: O atraso de quadro para Movies 1-4 apresentada neste artigo é de 0,8 segundos. - Na guia Arquivo do menu principal, aberta Exportar e selecione Acabamento em Vídeo. Escolha QuickTime Export sob Opções de arquivo e selecione um formato de vídeo desejado. Sob rendem Opções definir Frame Rate para personalizada, insira uma taxa de quadros de 15, e clique em Render.
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Representative Results
Vivo-imaging do olho de pupa é uma estratégia bem-sucedida para observar o comportamento de células que contribuem para a padronização do neuroepithelium. O papel das proteínas específicas pode ser facilmente avaliada através da expressão de transgenes que modificam os níveis de proteína durante o desenvolvimento do olho. Para fazer isso GMR-GAL4 é utilizado para conduzir a expressão do transgene por trás do sulco morfogenética. Isto oferece a vantagem de não perturbar eventos anteriores que estabelecem o campo ocular durante as duas primeiras fases larvares. Além disso, muitos transgenes RNAi exigir bastante tempo para efetivamente reduzir os níveis de proteína (dados agora apresentados). Daí condução transgenes RNAi com a linha de motorista GMR-GAL4 muitas vezes permite que terceiro olho desenvolvimento instar larval e eversão dos discos de olho durante a metamorfose para continuar incólume e reduz significativamente os níveis de proteína só mais tarde, durante a morfogênese olho de pupa. Se o desenvolvimento larval é, contudo, perturbado por um altamente eficiente transgene RNAi, voar cruzes podemser mantida a 18 ° C para reduzir a expressão do transgene e pupas transferidas para 25 ° C a 0 h APF. Para lidar com a eficácia de RNAi níveis de expressão do transgene, transcrição ou de proteína deve ser avaliado em correspondência de estágio de pupa, utilizando técnicas convencionais (ex-PCR quantitativa, imunofluorescência, immunoblotting).
Durante o desenvolvimento larval, os núcleos fotorreceptoras de cada omatídeo são recrutados como uma onda que viaja a partir do posterior para o lado anterior do disco olho 11. Este gradiente de desenvolvimento foi retido no olho de pupa. Na verdade, quando fotografado de 22,5 hr APF, padronização da GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b retinae foi marcadamente mais maduro na região posterior (Figura 2). O fenótipo destas retinas era comparável à das estirpes de moscas do tipo selvagem (dados não mostrados). Tradicionalmente morfogênese olho pupa é descrita de acordo com o tempo de desenvolvimento (por exemplo,hr APF). No entanto, devido ao gradiente de desenvolvimento pronunciado propomos descrever padrões olho de acordo com os seguintes eventos:
1 ° de embrulho (Figura 2 e Filme 1): contactado Inicialmente até oito células diretamente os pacotes fotorreceptoras. Duas células - geralmente as células anteriores e posteriores - foram recrutados como primárias (1 ° S). Estes 1s rapidamente cercaram os feixes fotorreceptoras, conectando-se uns aos outros para formar junções estáveis. Células indiferenciadas interomatidiais (ICs) estava em uma forma desordenada entre cada agrupamento ommatidial. Concomitante com 1 ° recrutamento celular, apoptose podadas aproximadamente 5% da piscina IC como descrito anteriormente (não anotada em filme 1) 12.
IC intercalação (Figura 2 e Filme 2): Como os 1 ° s embalados e selados sobre cada pacote de fotorreceptores, ce locaismovimentos ll reorganizou os ICs agrupados nos lados dorsal e ventral de cada omatídeo. Os ICs intercalados de múltipla (geralmente duas) linhas em uma única linha. A posição alvo de ICs móveis poderia ser previsto no tecido do tipo selvagem, observando a projeção direcional de grandes extensões de celulares ''. O crescimento das células 1 ° acompanhado e provavelmente contribuiu para intercalação de IC 13. Muitos ICs vai continuar a diferenciar como células secundárias (2 ° S) (não mostrado).
3 ° competição (Figura 2 e Filme 3): Na sequência de intercalação, três ICs competiram para ocupar o terciário (3 °) nicho. Nesta batalha dinâmica, as células freqüentemente ocuparam o nicho de 3 ° para tão pouco como 5 a 10 minutos antes de ser deslocado. Eventualmente, uma única célula estabeleceu uma estável 3 ° nicho.
Poda final (Figura 2 e Filme 4): Uma onda de apoptose 3,15-18 reduziu o número de ICs para o mínimo necessário para gerar de forma eficiente um puro hexagonal malha IC através do olho composto 5,14: três 3 ° s e seis 2 ° s em torno de cada omatídeo. Como observado anteriormente, geralmente aqueles que encontram-se em excesso CIs mais próximo das cerdas foram eliminados por apoptose 7. Observamos concomitante morte celular com IC intercalação e 3 ° estabelecimento nicho e propor que a poda de excesso de células contribuíram para a eficiência destes eventos. Além disso, re-posicionamento sutil de organules cerdas foi muitas vezes observado como ICs foram podadas.
Figura 1:. Dissecção de pupas e de imagem (A) O opérculo é removido de um pupa Drosophila (aqui mostrado em 23 horas APF) para expor a cabeça de um animal. A linha pontilhada representa um pedaço de fita dupla face. (B) Ilustração do simples equipamento de show-imaging. (C e D) Com a cabeça exposta, a pupa é posicionado a cerca de 35 ° descansando no talão de vaselina. (D) imagem Maior ampliação de uma pupa posicionado no topo do talão de vaselina. A posição da lamela e objetiva são ilustrados (não estão em escala). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Um gradiente de desenvolvimento em todo o olho de pupa. (A) Uma única imagem de um olho de pupa fotografado de 22,5 hr APF. Junções aderentes são rotulados por DE-Cad: GFP e αCat: GFP. Encaixotado região é anotado em (C). (B) Ilustrações de meados de palco e totalmente modelado ommatidia, às 24 e 41 horas, respectivamente APF. Dois 1 ° s (azul) cercar um grupo central, com quatro células cone (branco). Por 41 hr APF a padronização de células interomatidiais (cinza claro) é completo: três 3 ° s ocupar vértices alternados e um único 2 ° formas cada lado do hexágono. Três cerda organules (cinza escuro) cercam cada omatídeo. (C) Anotação de uma pequena região do olho (a partir de A). Dois 1 ° células (exemplos luz azul pseudo-colorido) expandir-se para cercar cada pacote de fotorreceptores. ICs (verde, amarelo, vermelho e azul escuro) intercalada em linhas individuais. Em cada vértice alternativa três células competir (esboçado no rosa) para ocupar o 3 ° nicho (de cor laranja). Veja Filmes 1-4 para observar esses eventos se desenrolando. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figure.
Figura 3:. Resumo do procedimento experimental por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1 :. 1 ° acondicionamento primário células são seleccionadas a partir do conjunto de células que rodeiam cada omatídeo incipiente. Como dois 1 ° s cercar cada omatídeo e se conectar, conexões aderentes formar rapidamente (linhas de rosa). As retas 1 °: 1 ° junções celulares expandir e 1 ° s começam a crescer, isolante bundles fotorreceptoras dos ICs circundantes. Inicialmente, os fotorreceptores brilhar intensamente, GFP densa marcação elaborados junções aderentes. Morfológica muda gradually desenhar esses cruzamentos fotorreceptoras abaixo do plano de imagem e cruzamentos em forma de X entre cada conjunto de quatro células cone apicais em cima de cada omatídeo se tornam mais claras. As imagens originais na esquerda; pseudo-coloração e anotações introduzidas em painéis sobre a direita. Eye fotografada a partir de 21 h APF.
Filme 2 :. intercalaction célula interomatidiais As células interomatidiais (ICs) destacados em vermelho, azul, amarelo e verde, inicialmente, formar um quadrante separar uma dorsal (superior) e ventral (parte inferior) omatídeo por uma distância de duas células. Os ICs vermelhas e amarelas esticar ventrally e dorsal, respectivamente (a partir de t = 42 min), fazendo contato com a meta de 1 ° s por 56 min. Os ICs azuis e verdes semelhante estender para alvejar omatídeo oposto. 'Novas' de 1 °: junções IC rapidamente expandir lateralmente. Em 112 min quadrante original da ICs tem totalmente intercalados aos geNerate uma única linha de células. As imagens originais na esquerda; pseudo-coloração e anotações introduzidas em painéis sobre a direita. Eye fotografada a partir de 23 hr APF.
Filme 3 :. competição Terciário No vértices alternados duas ou três células (esboçado no rosa) competem para ocupar o 3 ° nicho. Aparecendo a "empurrar" os seus vizinhos de lado, as células geram grandes extensões que chegam para ommatidia oposto. Ocupando o 3 ° nicho (de cor laranja) é muitas vezes fugaz e células quer retratar ou são empurrados para fora da posição por seus vizinhos. Até o final deste filme 217 min, muitas 3 ° nichos apareça estabelecida. As imagens originais na esquerda; pseudo-coloração e anotações introduzidas em painéis sobre a direita. Eye fotografada a partir de 23 hr APF.
Movie 4:. final Poda células na vizinhança de organules cerdas são removidos por apoptose. Exemplos são destacadas em roxo, vermelho, amarelo e azul. Ao longo de imagiologia, remoção de células deixou apenas um 2 ° ao longo de cada braço horizontal do hexágono IC. Poda de excesso de células nas laterais diagonais do hexágono IC não foi capturado neste filme. Neste genótipo foram frequentemente observados pequenos erros no posicionamento dos grupos de cerdas (compare com a Figura 2B). Dois dos três grupos de cerdas manobrado em nichos de canto durante o exame: re-posicionamento parecia ser facilitada pela remoção e circulação de ICs vizinhos. As imagens originais na esquerda; pseudo-coloração e anotações introduzidas em painéis sobre a direita. Eye fotografada a partir de 26 horas APF.
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Discussion
A descrição de desenvolvimento do tipo selvagem (acima) constitui a base para a comparação de padrões de eventos em RNAi ou genótipos superexpressão. Comparações de desenvolvimento do tecido vivo são de valor inestimável para determinar precisamente quais os comportamentos celulares são regulados por uma proteína de interesse. Além disso, e não descrita aqui, imagem de células vivas permite que se faça descrições qualitativas e / ou quantitativas da função de um gene de interesse em que os eventos padrão a olho. Por 30-32 hr APF maioria das células de pigmento adquiriram posições estáveis e apoptose tem podado excesso de células a partir do campo da retina. Depois disso, apenas as mudanças subtis são observados como as células de pigmento adoptar as suas formas características: a 3 ° s hexagonal e tornar-se, como um ° s subtilmente expandir, a largura dos vizinhos rectangulares 2 ° células diminui. Geração subsequente de pigmento e material de lentes provável dificulta uma imagem com qualidade de junções aderentes.
Embora um valestratégia uable, várias armadilhas deve-se ter em mente quando imagens do olho de pupa ao vivo. Em primeiro lugar, remover o caso de pupa anterior torna o animal particularmente vulneráveis à desidratação, superaquecimento e danos durante a montagem e de imagem. Insultos como esses podem confundir dados por induzir o desenvolvimento do tecido atípica que não é relevante para o genótipo em exame. Em segundo lugar, o protocolo descrito aqui requer que uma lamela de vidro fazer contato direto com o epitélio cabeça de pupa. Temos observado que o desenvolvimento da retina baias se a pressão excessiva é aplicada ao empurrar a lamela contra o olho. Com efeito exógeno forças mecânicas têm sido mostrados em outros sistemas de influenciar processos de desenvolvimento, incluindo a arquitetura do tecido 19,20. Por estas razões, é importante colocar gentilmente a lamela contra o olho. Além disso, pupas trabalhada deve ser resgatado do equipamento de imagem e permitiu a emergir como adultos: artefatos introduzidos durante a imagem podemuitas vezes ser detectados através da comparação do efeito de olhos fotografada destes adultos com olhos de moscas da mesma idade da cruz inicial. Além disso, dados de múltiplas sessões de formação de imagens devem ser comparados para verificar os comportamentos de células. Finalmente, imunofluorescência padrão devem ser utilizados para determinar se o arranjo, o tamanho e número de células no tecido de correspondência de fase são os mesmos.
Ectópica DCR-2 é frequentemente usado para melhorar a eficácia de RNAi. No entanto, na presença de ectópica DCR-2, intercalação de IC, a estabilização de 3 ° nicho e apoptose foram ocasionalmente quebrado (dados não mostrados). Assim DCR-2 expressão deve ser usada com cautela.
O protocolo descrito aqui utiliza GFP ao rótulo adherens cruzamentos e avaliar a morfogênese de células de pigmento no olho de pupa. Esta estratégia pode ser facilmente modificado para outros fins (por exemplo, para avaliar fotorreceptores morfogênese). Para uma abordagem de dupla marcação, UA adicionalS transgenes que rotulam outros componentes celulares de interesse (por exemplo, vesículas secretário, retículo endoplasmático, núcleo) com marcas não-GFP poderia ser incorporado. No entanto, a intensidade e longevidade desses transgenes exigirá uma avaliação: RFP, DsRed e mCherry, por exemplo, têm-se revelado rótulos pobres para geração de imagens do olho de pupa para os longos períodos necessários para capturar padronização de células de pigmento (dados não mostrados). Se investigar comportamentos celulares rápidas (por exemplo, secreção) o protocolo aqui descrito pode ser facilmente modificado para microscopia confocal de proteínas fluorescentes adequados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
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