Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.
在这里,我们介绍了一系列全面测试,以及标准化的适合在偏远的海洋环境中使用的研究方案。采样协议包括资源的评估提供给微生物群落(溶解的有机碳,颗粒有机物质,无机营养物),以及病毒和细菌群落的全面描述(通过直接的病毒和微生物计数,自身荧光微生物的计数,并施工病毒和微生物宏基因组)。我们使用的方法,其代表包括已经建立的方案和一些发达的最新技术,科学学科的分散字段的组合。用于病毒和细菌群落表征尤其宏基因组测序技术,已经建立了只在最近几年,并且因此仍受到不断改进。这已经导致了各种取样和样品处理过程货币兑换。TLY使用。该组的方法这里介绍提供一个最新的方法来收集并处理环境样品。这些协议涉及的参数产生的信息的最低限度的基本表征和理解病毒和微生物群落动态的基本机制。它提供了易于遵循的准则进行全面的调查和讨论的关键步骤和潜在的注意事项相关的各个技术。
海洋生态系统受到了广泛的导致从养分供应到顶级食肉动物的生物量变化扰动。在过去的十年中,多项研究已经证明了微生物群落的海洋生态系统1-4的重要性。显而易见的是,改变在细菌和病毒群落都与海洋环境5的总体降解有关。这些变化可通过在水体中改变的地球化学可以促进诸如氧气供应或碳再矿化6,7。作为大生物,水化学和微生物活性的反馈回路之间的相互依赖性的结果,可能会加速生态系统退化8的速度。
在20世纪70年代和80年代多次尝试作了解开生物地球化学循环的海洋生态系统9-11。其中这些早期研究的主要挑战是缺乏标准化的方法来测量评估生物地球化学参数。虽然有可用的协议,主要是海水营养盐12,13,碳动态的评估和微生物群落结构受可用的工具和方法进行了限制。与JGOFS EqPac方法相比,夏普等人 14表明第一次的可靠和标准化协议,用于溶解的有机碳(DOC)的浓度评估。到了21世纪初的分析挑战,确定了由此得到很大程度的解决提供给微生物群落的资源和方法已经建立了控制养殖环境微生物群落的特征(见德隆15)。传统的测序方法,当时主要是依靠耕地克隆培养。然而,天然样本的早期环境基因测序发现,大多数微生物的生物多样性已经错过了cultivATION为基础的方法16。在2002年,布赖特巴特等人 17使用鸟枪法测序,首次描述了病毒社区环境海水样品建立的方法进行测序未培养海洋的病毒群体的整个基因组中。
在现有微生物的评估,病毒仍然特别是在深入研究的,因为大多数都难以培养,缺乏普遍保守的标记,如16S核糖体RNA(rRNA)的基因通常用于评估的多样性和社会分析。宏基因组测序方法提供了一种替代的文化依赖性和基因靶向方法分析复杂的病毒性社区。而从海水中产生的第一病毒宏基因组采用Sanger测序17进行测序,下一代测序技术和改进的分子生物学技术的发展导致了在宏基因组研究18快速增加</sUP>。当前的实验室工作流程病毒宏基因组学涉及分离,富集和/或浓度的病毒颗粒中,接着核酸(DNA或RNA)提取,文库制备和测序19-21。
为了进一步对病毒,微生物和生化功能的水生生态系统的现有知识,在各种系统中的比较数据集周围的世界是必不可少的。然而,建立协议已经很大程度上被用于近岸环境与发展容易获得实验设施。因此,缺乏规范场方法阻碍这些跨生态系统的比较。这里我们主要介绍全面测试,以及从标准化的艺术研究的协议状态为适应偏远外地地点使用。这些方法已被证明是成功的在多个研究跨越过去十年5,22和目前使用的各种海洋实验室以及对诺阿珊瑚礁评估和监测计划(RAMP)在整个太平洋4。采样协议包括水化学参数(无机和有机碳含量,无机营养浓度),病毒和微生物丰(直销细菌数,直接的病毒数量,和流式细胞术,以评估自养VS异养比率),以及病毒和微生物群落结构和通过宏基因组分析的代谢潜力(对于综述参见图1)。从此处描述的方法所获得的结果是必需的,以便阐明需要全面表征水生生态系统关键生物地球化学背景参数。
这里介绍的方法将提供一个工具来生成的水生生态系统的病毒和微生物的动态进行了全面评估。它们的目标,量化的可供微生物群落的有机和无机资源的现存量,并以表征所述病毒和微生物群落存在的化妆。下一步量化病毒数量和微生物数量和生物量,基因组序列信息,揭示了他们的群落结构和功能。所有的方法都已经制定或修改,以允许在远程现场位置的应用程序。然而,缺乏控制的实验室设置,本质上创建了一些潜在的错误。在这里,我们讨论每个评估参数相关的一些注意事项。旁边的潜在的污染样品时的操作的一些参数在分析过程中也产生潜在的错误。
溶解有机碳
碳污染可能发生在采样过程(采样下游,或在船上或潜水员的附近),在样品制备过程中(设备或无意操作的污染),而且,即使在存储的样本(其它样品在冷冻含有有机溶剂/挥发物)。以避免污染行为尽可能少的处理步骤可能的各种来源,因为每个样品迁移造成污染的额外来源。样品不应该在没有酸洗或燃烧任何物品接触。最后,指定的存储冷冻专门为不含有挥发性有机物质的样品将确保在较长的贮存期样品的完整性。如果样本不DOC样本的长途旅行期间酸化用浓盐酸中保持冷冻(如描述38-41)可能是适用的替代品。以验证测量精度的DOC共识参考材料,应使用章商务部测量过程中ularly运行。尤其是深层水(> 2,000 m)以下参考文献是在评估的分析机器的性能有价值的,因为它是在其DOC含量42很稳定。
颗粒有机物
除了避免有机碳污染,聚甲醛采样需要特别注意以确保过滤体积的准确性。如果为500毫升的有针对性的体积应偏离任何潜在原因此需要特别指出的来涉及聚甲醛捕获在过滤器将其导出,其中滤液的量。
无机营养
与有机碳的采样,必须注意以各种来源,如船只或废水排放12可能产生的营养物质样品污染。用于有机碳采样为0.8微米的标称孔尺寸的过滤器,可以不排除所有微生物生物量和sh乌尔德因此改变为0.2微米的过滤器对这个过滤步骤。此外,检测限造成养分的样品有问题;特别是在各地的许多珊瑚礁的位置( 例如 ,Cotner 等人 43)的贫营养的地表水。检测限约为0.1左右,0.2和0.1微摩尔/升铵,硝酸盐,亚硝酸盐,和正磷酸盐(参照36,12,37)
显微镜
除了变化的样本图像分析,从显微镜载玻片的集中度进一步得到潜在的错误。例如,图像可能无法聚焦在视场中的一些区域,并且在聚焦于他人。作为高纯度的氧化铝基质过滤器是一个非常严格的过滤器的类型,过滤器下的任何碎屑可能会导致整个滤波器坐在一角度滑动。其结果,图像可以持续聚焦在视场中的各个部分的一个给定的过滤器,再gardless显微镜对准。重新安装过滤器,以确保过滤器的下侧是干净的,可以改善这一点,如果它被观察到。另外,在某些情况下,可能有两个焦平面中的病毒和微生物都可以找到。这是染色的物体在安装时成为从过滤器分离,并上浮到盖玻片,可以使计数不可靠的下面的结果。因此,它总是建议的过程中,检查样品的质量。
流式细胞仪
如用显微镜的样品,也有可能是天然存在的细胞计数需要分析过程的调整样本流之间的差异。例如,这取决于仪器的灵敏度,依稀荧光绿球藻细胞可以低于噪声电平,不会被量化。珠作为内部控制的样品( 例如 ,以确认仪器的RESP账户ONSE到荧光信号是一致的一天又一天(和运行本身的过程中保持稳定)。如果加入到样品中,在已知浓度下,它们也可以作为内部对照,以验证该样品的体积运行。然而,建议始终运行一个先前冷冻的“标准”海水被解冻,并沿与感兴趣的样品染色,以提供额外的生物控制样品的96孔板运行之间处理样品的等分试样。根据位置,海水样品的外观可能彼此非常不同。排序“代表”群体,然后啶显微镜(EM)下观察可以是一个很好的方式,以快速验证浮游植物种群的任一聚球藻或光合真核生物。 绿球藻细胞通常是不可见的电磁下,因为它们消失得太快。除了 叶绿素a, 聚球藻还包含pH值otopigment phycoeurythrin(PE),其在较短波长(540-630纳米)比叶绿素A(660-700 nm)的发射光。当聚球藻细胞兴奋与蓝色/绿色光(470-490纳米),如果在去除光在510纳米波长的所有发射滤光片观看时,就会出现金色的。通过比较,在真核分数看起来红色,当用相同的光波长激发。
病毒宏基因组学
需要注意的是VLP浓度和存储的过程中影响了社会的回收是很重要的。可以发生在过程中的每一步骤的病毒颗粒损失,因此,病毒的纯化和浓缩的协议的选择可以最终影响所得病毒宏基因组44,45,18的观察分类组成和多样性。可以使用TFF 19或化学为基础的絮凝20进行样品浓度。在化学为基础的方法,断定结构延续带电的铁离子结合的天然带负电荷的病毒颗粒形成大的(> 8微米)铁 – 病毒复合物絮凝出来的溶液,并且可以使用8微米的过滤器来回收。随后,铁螯合掉病毒颗粒,并使用镁,抗坏血酸和EDTA,留下浓缩的病毒颗粒用于核酸提取20再溶解。比较这两个电流的方法之后,我们的结论是,氯化铁的方法是耗时少比TFF病毒浓度,但可能会产生一些注意事项。我们发现的铁-病毒即离解和溶解需要2倍,以便使之溶解于抗坏血酸降解之前进行更浓缩镁抗坏血酸-EDTA溶液比报道20。除了这个问题,该协议按大小分级分离纯化病毒颗粒独自一人,用去除0.2微米的过滤微生物污染物。大病毒不通过FILT器( 例如 ,Yang 等人 46),并因此不能在宏基因组进行检测,而另一些细菌活动(McDole,未发表的数据)。这导致细菌污染而歧视大病毒。
但是具体问题也是相关的与TFF集中连接去除微生物。作为氯仿治疗已经显示出以除去氯仿敏感的病毒具有外部脂膜47的一些研究表明,0.22微米的过滤可用于除去大部分的细菌。还应当注意的是,所提出的方法主要针对噬菌体的遗传物质在海洋环境中最丰富的载体。由于噬菌体一般认为不普遍含有脂质48他们对氯仿处理更有抵抗力。据我们所知,一个“包罗万象”的方法并不存在至今。这里介绍的方法是改编自欧在过去10年中R场经验横跨热带到寒带的各种系统的海洋环境。
微生物宏基因组学
宏基因组文库用于微生物( 例如 ,细菌和古细菌)的结构比病毒宏基因组更简单,因为它是更方便地生成所需的文库制备的最低DNA浓度。接头扩增鸟枪文库(LASLs)17,49,50和全基因组扩增基于多重置换扩增(MDA)是两种最常用的方法,以产生足够的DNA测序。使用MDA的微生物宏基因组,以获得更高的DNA浓度有时是必要的。然而,这可能会导致工件中的序列数据,如甲藻minicircles的音量过分放大。 MDA的方法是已知的,以优先扩增单链和环状DNA,产生非定量结果51,52。优化LASLs因此接近50可作为在放大这两个微生物和测序的病毒宏基因组DNA的一个更好的选择。需要注意的是LASLs方法具有多个步骤,需要复杂的设备,并且被限制为双链DNA模板是很重要的。另外,在组织DNA提取试剂盒已经显示从革兰氏阳性和革兰氏阴性生物门提取的DNA,但它并没有被验证为有效的裂解顽固的微生物类群或与其相关的结构( 例如 ,某些古细菌,孢子或真菌孢子) 。因此,一个珠击步骤可能是必要的,从某些微生物获得的DNA。
这些全面的评估,将导致更好地了解病毒和微生物生态系统功能。尽管很少有研究开展的工作,以评估建议的所有参数,许多一直在研究选定的。尼尔森等人 53表明一个连接betwEEN具体的珊瑚礁栖息地和枯竭相对于近海水域既DOC和浮游细菌的浓度。这些浓度的变化是伴随着浮游细菌群落不同的分化。 Dinsdale 等 5表明,增加的人为影响,伴随着微生物细胞和病毒样颗粒的10倍的更高的丰度。周围有人居住的岛屿海域的微生物群落也有较大的异和潜在的病原体5的分数。最后McDole 等 4表明,通过引入microbialization得分,人类活动正在转移能量至所述微生物,在macrobes为代价的。这些研究侧重于特定的微生物和水化学参数,提供了新的见解海洋生态系统的生化结构。结合生态系统监测工作的传统的数据 – 如温度和pH值,鱼类生物量和diversiTY,底栖盖,或接触人体的影响 – 以水化学和微生物的评估,很可能会导致更敏感的环境监测工作,这可能会导致更多的专门针对保护工作。
The authors have nothing to disclose.
We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) | Figure 1 | ||
Filtration setup | Figure 1 | ||
32 – 36 % Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Sci | A508-212 | |
High-density polyethylene (HDPE) container | e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid | ||
Combustion oven (550° C) | |||
60 ml HDPE vials | Fisher Sci | 02-896-2B | |
25 mm GF/F filter | Fisher Sci | 09-874-64 | |
Forceps | Fisher Sci | XX62-000-06 | |
Sterile, non-powdered gloves | Fisher Sci | 19-170-010B | |
Bilge pump | e.g., Thirsty Mate 124PF | ||
20 l collapsible low-density polyethylene carboy | e.g., Reliance Fold A Carrier II | ||
Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges | Amersham | CFP-2-E-9A | |
Platinum-cured silicon tubing for TFF | Cole Parmer | 96440-82 | |
Hose clamps | Cole Parmer | P-68007-23 | |
Peristaltic pump | Cole Parmer | EW-77410-10 | |
Sodium hydroxide (NaOH) solution | Electron Microscopy Sciences | 21162 | |
0.2 µm polycarbonate Track-Etched Membrane filter | Fisher Sci | 09-300-61 | |
8.0 µm polycarbonate Track-Etched Membrane filter | Fisher Sci | 09-300-57 | |
0.22 µm polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVGP01050 | |
0.45 µm polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVHV010RS | |
Synthetic nylon mesh | Sefar | 03-125-37 | |
20 ml plastic scintillation bottle | Fisher Sci | 03-341-72C | |
Clean bucket (10 – 20 L) | |||
32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15714 | |
25 % glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16220 | |
Liquid Nitrogen | |||
0.02 µm high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6002 | |
0.2 µm high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6022 | |
10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain | Invitrogen | S11494 | |
DAPI solution 25 µg ml-1 | Invitrogen | D1306 | |
Molecular grade water | sigma aldrich | W-4502 | |
Ascorbic Acid | Fisher Sci | BP351-500 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Sci | BP399-500 | |
Glycerol | Fisher Sci | G31-500 | |
Microscope slide | Fisher Sci | 12-550-123 | |
Coverslip | Fisher Sci | 12-548-5M | |
Delicate task wipe | Fisher Sci | 06-666A | |
Slide Station with vacuum pump | Figure 3 | ||
DNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.1 | Nucleospin tissue kit |
Proteinase K (20 mg ml-1) | Lifetechnologies | AM2546 | |
200-proof 100% Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15058 | |
Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | EW-45503-88 | |
Cesium chloride (CsCl) | Fisher Sci | bp1595-500 | |
60 ml syringe | Fisher Sci | 13-6898 | |
0.02 µm alumina matrix disposable syringe filter | Fisher Sci | O992613 | |
Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
Ultra – swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 333790 | SW41 Ti Rotor |
DNase I (100 u µl-1) | Calbiochem | 260913 | |
0.5 M EDTA | Fisher Sci | BP2482-500 | |
Formamide | Fisher Sci | BP228-100 | |
Glycogen | sigma aldrich | G-1767 | |
100 % Ethanol (200-proof) | Electron Microscopy Science | 15058 | |
1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0 | Fisher Sci | BP2473-500 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Sci | 02674-25 | |
20 μg ml-1 Proteinase K | Fisher Sci | BP1700-500 | |
Chloroform | Fisher Sci | BP1145-1 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | sigma aldrich | p3803 | |
Isopropanol | Fisher Sci | BP2618-500 | |
50ml Oak Ridge Tube | Fisher Sci | 05-562-16B |