Abstract
여기에서 우리는 원격 해양 환경에서 사용되도록 철저히 테스트하고 잘 표준화 연구 프로토콜의 시리즈를 소개합니다. 샘플링 프로토콜은 미생물 군집 (용존 유기 탄소, 입자 성 유기 물질, 무기 영양소)에 이용 가능한 자원의 평가, 직접 바이러스와 미생물 카운트를 통해 바이러스 및 세균 지역 사회의 포괄적 인 설명 (autofluorescent 미생물의 열거를 포함하며, 바이러스 및 미생물 metagenomes의 건설). 우리는 이미 확립 된 프로토콜 및 개발 최신 기술의 일부를 포함하는 과학 분야의 분산 필드를 나타내는 방법의 조합을 사용한다. 바이러스 성 및 세균성 커뮤니티 특성화에 사용되는 특히 metagenomic 시퀀싱 기술은 단지 최근에 설립되고, 따라서 여전히 지속적인 개선을 실시한다. 이것은 샘플링 및 시료 처리 절차 CURREN 다양하게되었다TLY 사용. 여기에 제시된 방법의 세트를 수집하고 환경 시료를 처리하는 최신 방법까지를 제공합니다. 이러한 프로토콜 주소 매개 변수 특성 및 바이러스와 미생물 군집 역학의 기본 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 정보의 최소를 얻을 수 있습니다. 그것은 포괄적 인 설문 조사를 수행하는 지침을 따르 쉽게 제공하고 각 기술에 관련된 중요한 단계 및 잠재적주의 사항에 대해 설명합니다.
Introduction
해양 생태계는 정점 육식 동물의 바이오 매스에 영양 가용성의 변경을 초래할 섭동의 광범위한을 실시한다. 지난 10 년간 여러 연구는 해양 생태계 1-4에서 미생물 군집의 중요성을 증명하고있다. 이는 박테리아 및 바이러스 사회의 변화가 밀접 해양 환경 (5)의 전반적인 분해와 관련된 것을 알 수있다. 이러한 변경 사항은 산소 가용성 또는 탄소 재석 회화 6,7로 물 열에서 변경된 지구 화학에 의해 촉진 될 수있다. 대형 생물, 화학 물 및 미생물 활성 피드백 루프 사이의 상호 의존성의 결과 생태계 열화 (8)의 속도를 가속 할 수있다.
1970 년대와 80 년대 여러 시도는 해양 생태계 9-11에서 생지 화학 순환을 해명 하였다. 이들 초기 연구의 주된 과제 중 하나는 부족했다표준화 된 접근 방식의 평가 생지 화학적 매개 변수를 측정합니다. 주로 해수 영양분 12, 13에 사용 가능한 프로토콜,이 있었지만, 탄소 역학의 평가 및 미생물 군집 구조가 사용할 수있는 도구와 방법으로 제한되었다. JGOFS EqPac 방법의 비교를 통해, 샤프 등. (14)는 처음으로 용존 유기 탄소 (DOC) 농도 평가를위한 안정적이고 표준화 된 프로토콜에 대한 제안했다. 2000 년대 초반으로 분석 과제 따라서 대부분 해결되었다 미생물 지역 사회 가용 자원을 결정하고 (드롱 15 참조)를 설립했다 통제 문화 환경에서 미생물 군집의 특성을 접근합니다. 이 때 기존의 시퀀싱 방법은 크게 재배 클론 배양에 의존. 자연 시료의 초기 환경 유전자 염기 서열은 미생물 생물 다양성의 대부분 cultiv 놓친했다, 그러나, 계시ATION 기반의 방법 (16). 2002 년 Breitbart 등. 17 교양 해양 바이러스 공동체 전체 게놈 시퀀싱하는 방법을 확립 해수 환경 시료에서 바이러스 커뮤니티를 설명하기 위해 처음 샷건 서열 분석을 사용 하였다.
대부분의 문화 어렵다으로 기존의 미생물 평가 내에서 바이러스는 여전히, 특히 아래에 연구 된 유지하고는 16S 리보솜 RNA (rRNA의) 일반적으로 다양성과 지역 사회 프로파일을 평가하기 위해 사용되는 유전자로 보편적으로 보존 된 마커 부족하다. metagenomic 시퀀싱 방법은 복잡한 바이러스 커뮤니티를 분석하기위한 배양 의존적 유전자 타겟팅 방법에 대한 대안을 제공한다. 해수로부터 생성 제 바이러스 metagenomes는 생거 시퀀싱 (17)를 사용하여 서열화 동안, 차세대 시퀀싱 기술 및 향상된 분자 기술의 개발이 연구 metagenomic 18가 급증하게되었다 19-21 이어 바이러스 입자의 분리, 농축, 및 / 또는 농축을 포함한다.
세계가 필수적입니다 주위에 다양한 시스템에서 데이터 세트를 비교, 수중 생태계에서 바이러스, 미생물, 생화학 적 기능에 대한 기존 지식을 발전합니다. 그러나, 기존 프로토콜은 대부분 쉽게 접근 실험실 시설과 가까운 해안 환경을 위해 개발되었다. 따라서, 표준화 된 필드 방법의 부족이 교차 생태계 비교를 방해한다. 여기에서 우리는 철저한 테스트를 소개하고 잘 원격 현장에서 사용할 수 있도록 기술 연구 프로토콜의 상태에서 적응을 표준화. 이러한 방법은 지난 십 5,22에 걸쳐 여러 연구에서 성공적으로 입증 된 현재 NOAA뿐 아니라 다양한 해양 실험실에서 사용하는리프 평가 및 태평양 4 전반에 걸쳐 모니터링 프로그램 (RAMP). 샘플링 프로토콜은 물 화학 매개 변수 (무기 및 유기 탄소 농도, 무기 영양소 농도), 바이러스 및 미생물 풍부하게 포함 (직접 세균 수, 직접 바이러스 수를하고, 종속 영양 비율 대 독립 영양 생물을 평가하기 위해 유동 세포 계측법), 바이러스 성 및 미생물 군집 구조와 metagenomic 분석을 통해 대사 전위 (개요는 그림 1 참조). 여기에 기술 된 방법에서 얻은 결과를 종합적 생태계를 특성화하는 데 필요한 키 생지 배경 파라미터를 규명하기 위해 요구된다.
Protocol
악기 1. 준비
- 여과 설치 준비
- (0.5 ~ 0.6 M; 최종 액 5 L를 만들기 위해 4.75 L 증류수로 250 ml의 32~36% 염산을 추가) 5 %의 염산 (HCL) 솔루션을 준비합니다. 최대 2 주 동안 고밀도 폴리에틸렌 용기 (HDPE)에이 용액을 보관.
- 잠재적 용존 유기 탄소 (DOC) 오염 물질을 거머리 5 % 염산 용액에 24 시간 동안 (필터 제외) 샘플과 접촉하는 모든 부분을 남겨주세요. 각 샘플링 이벤트 후에 탄소 오염을 방지하기 위해 약 30 ml의 5 % HCl 용액으로 모든 부 및 플러시 라인 린스 (예를 들면, 가스 연기, 오일, 보트, 모기 스프레이부터).
- 사전 연소 알루미늄 호일에 싸여 또는 직전에 사용하는 때까지 덮인 모든 샘플링 항목을 유지합니다.
- Precombust 25mm의 GF / 12 시간 동안 550 ° C에서 머플로 알루미늄 호일로 싸서 F 필터는 모두 탄소를 휘발하고, 세척 건조에 저장할사용할 때까지 넣습니다. 항상 미리 연소시켜 두었던 필터를 처리하는 산 세정 집게 멸균 비 분말 장갑을 사용한다.
- 바이러스 성 Metagenome 샘플링 재료의 준비
- 철저하게 네 (20) L 축소 저밀도 폴리에틸렌 carboys 네 (20) L 고밀도 폴리에틸렌 양동이와 10 %의 표백제와 뚜껑을 씻는다.
- 그 후 모든 항목은 다음 증류 및 샘플 물에 배와 원주와 carboys를 다시 봉인 씻어.
- 다음과 같은 프로토콜 및 필터가 지난 5 일 사용하지 않은 선제 경우 청소에 따라 각 사용 후 세척 접선 흐름 필터 (TFF).
- 세척 양동이에 물 5 L에 수산화 나트륨 펠렛 50g을 녹인다.
- 그림 3에 따라 튜브에 젖은 TFF를 부착하고 조립한다.
- 시스템을 통해 NaOH로 세척 솔루션의 일부를 이동없이 배압 30 RPM ~에 연동 펌프를 실행합니다. 세척이 리턴 라인에서 흘러되면, 버킷 씻어 전송 이동솔루션의 순환을 완료합니다.
- TFF의 하류 복귀 라인에 클램프를 배치하여 시스템에 배압을 적용한다. 이 여액 라인 씻어 솔루션을 강제로. 과도한 시간 (5 분) TFF의 외부 범람하고 여액을 저하 TFF 나타내는 것을 생성한다.
- NaOH 용액의 모든 라인에있을 때까지 시스템을 실행. 그런 다음 시스템에서 배압, 실행 솔루션을 제거하고 폐기합니다.
- 반환 및 여과 액 라인에서 흐르는 물의 pH가 7 ~ 8 때까지 배압에서 물을 실행하여 TFF를 씻어.
- 연동 펌프 및 TFF에서 튜브를 제거합니다. 저장 TFF를 봉인. TFF는 다음 사용 때까지 젖은 남아 있는지 확인합니다.
2. 샘플 컬렉션
참고 : 전송하는 동안 수집 된 모든 샘플은 멋진을 저장해야합니다 (4 ℃ 가능한 경우) 및 추가 처리 할 때까지 직사광선에 노출되지.
- 샘플링탄소, 영양소, 현미경, 유동 세포 계측법, 미생물 메타 지노믹스에 대한
- (4 L 샘플 물 결과) 샘플링 이벤트 당 두 개의 하타 Niskin 채 단위를 가져 가라. 단지 (하강을 방지 할 수 그렇지 않으면 갇힌 공기를) 잠수하기 전에 샘플링 혈관을 엽니 다.
- 각 사이트에서 양단을 열고 물을 통해 극성 축을 따라 실린더를 이동시킴으로써 샘플 물 샘플링 용기 내부를 세척.
- 샘플을 가지고주의 깊게 샘플링 컨테이너를 닫습니다. 확인 샘플링 사이트가 오염을 방지하기 위해 보트와 다이버의 상류 측에 확인하십시오.
- 바이러스 성 메타 지노믹스에 대한 샘플링
- 대상 사이트에 20 L의 상자 속에 든 대형 유리 병에 빌지 펌프를 탑재합니다.
- 해당 원주와 각 대상 지역 및 밀봉 상자 속에 든 대형 유리 병에 상자 속에 든 대형 유리 병을 목표로 빌지 펌프 흡입구를 입력합니다.
- 각 샘플링 사이트에서 필터링되지 않은 해수의 4 carboys (모두 함께 80 L)를 수집합니다.
3. 삼프도리아제작 준비
NOTE는 : 오염의 가능성을 최소화하기 DOC 시작하여, 여기에 제시된 순서로 샘플을 처리한다. 전체 절차 분말 무료 장갑을 사용합니다.
- 용존 유기 탄소 (DOC)
- 마운트 여과 세트의 각각의 슬롯에 두 나누어 하타 Niskin 채 단위의 하나. 각각의 필터 홀더에 이르게 출구 튜브를 연결합니다. 하타 Niskin 채 장치에 압축 공기 (0.2 바) 튜브를 연결합니다 (그림 2 참조).
- 필터 홀더에 필터를 삽입하기 전에 샘플을 물 100㎖로 모든 라인을 플러시. 산 집게를 세척하여 필터 홀더에 25mm 사전 연소 GF / F 필터를 놓습니다. 각 DOC 병을 씻어 샘플링 물 여과 약 20 ml로 3 회 모자.
- 샘플링 물 40 ㎖ (~ 2 / 3 전체)로 병을 채 웁니다. 전송시 발생할 수있는 오염이나 손실이 오는 경우 백업을 가지고 DOC 샘플의 최소 중복에 수집합니다.
- F분석 할 때까지 -20 ° C에서 똑바로 서 reeze 샘플링 병.
- 입자상 유기 물질 (POM)
- 500 ml의 총 DOC 샘플을 수집하는 동안 통과 것을 포함하여, GF / F 필터를 통과 할 때까지 수집 된 DOC 샘플 필터링을 계속 한 후.
- 나사를 풀고 인라인 필터 홀더.
- 사전 연소 알루미늄 호일의 사각형 내부에 집게와 장소 필터를 사용하여 POM 분석을위한 필터를 제거, 상단 측이 자체의 설정 접은 포장.
- 원소와 동위 원소 분석을 할 때까지 저장 -20 ° C에서 필터를 동결.
- 무기 영양소
- 각 필터 홀더에 0.2 μm의 트랙 에칭 필터를 놓습니다. 필터 카세트를 다시 연결합니다.
- 각 20 ml의 플라스틱 섬광 병을 샘플링 물로 3 회 씻어. 어깨 (~ 18 ㎖)에 각각의 병을 채 웁니다.
- 나중에 분석 할 때까지 -20 ℃에서 동결.
- MicroscopY (SYBR 골드 및 DAPI)
- 필터 홀더를 벗어.
- 두 개의 마이크로 원심 튜브에 각각 물 1 ㎖를 수집합니다.
- (나중에 SYBR 골드 염색) 분취 중 하나에 66 μl의 32 % 파라 포름 알데히드를 추가합니다. 해당 다른 12 μl의 25 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)를 추가 (나중에 DAPI 염색을 위해).
- 부드럽게 혼합하고, 샘플 어둠 속에서 실온에서 적어도 15 분 동안 "수정"할 수 있습니다.
- 유동 세포 계측법
- 파편과 큰 진핵 세포를 제외 할 필터 홀더 중 하나에 8.0 μm의 폴리 카보네이트 필터를 놓습니다.
- 1 ml의 샘플과 각각의 샘플링 사이트에서 2 크리오 바이알 (cryovial)을 채우기 위해 샘플링을 통해 물을 전달합니다.
- 각 cryovial (최종 농도 = 0.125 %)에 25 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)의 5 μl를 추가합니다.
- 섞어 유리 병을 반전.
- 샘플을 실온에서 15 ~ 30 분 동안 고정 할 수 있습니다. 30 분을 초과하지 마십시오.
- 액체 질소에 플래시 동결 샘플.
- -80 ° C에서 나에 Liqui에 보관 샘플사이토 흐름을 분석 할 때까지 D 질소 건조한 화주.
- 미생물 Metagenomic 샘플
- 라인 필터 홀더에서 제거합니다.
- 직접 각각의 라인에 0.22 μm의 원통형 필터를 탑재합니다.
- 각 사이트에서 하타 Niskin 채 단위 모두의 샘플 물을 나머지 필터는 하나의 필터를 통해 (필터 당 3 ~ 4 L 총).
- 여과 후 공기로 채워진 깨끗한 10 ML의 주사기를 사용하여 각각의 필터에서 남아있는 물을 밀어 넣습니다.
- 다시 원래의 포장에 필터를 삽입하고 실험실 테이프로 패키지를 밀봉.
- -20 ° C에서 개별적으로 포장 필터를 저장합니다.
- 바이러스 성 Metagenomic 샘플
- 어떤 샘플이 환경에 의해 손실 또는 오염되어 있는지 확인하는 즉시 세척 양동이에 바이러스 metagenome 샘플을 전송합니다.
- 종래 농도 19 파편 및 세포 물질을 제거하기 위해 큰 기공 크기의 나일론 메쉬 (25 내지 100 μm의)을 이용하여 프리 필터.
- 시료 통에 전달 라인을 배치하고, 싱크대 실행 복귀하고 여액 라인을 떠나,도 3에 도시 된 바와 같이 TFF를 설정.
- 연동 펌프 및 샘플 물 1-2 L과 수평 라인을 켭니다.
- , 사이클을 완료하는 배압의 0.7 줄을 추가하는 샘플 통에 리턴 라인을 놓습니다.
- 해수를 집중하는 동안, 레벨 등의 상단까지 샘플 저수지는 떨어진다. 수위 및 표백 세척, 트리플 세척 tripour 비커에 양동이에 유입 라인, 전송 농축 이하로 떨어지면 집중하고 계속합니다.
- 저장조 비이커가 비어 있으면 tripour에서 회수, 펌프 속도를 높이고 라인을 통해 전체 샘플을 밀어 배압 제거.
- 어떤 바이러스 계통을 차별하지 않으면 서 대부분의 박테리아를 제거하기 위해 0.45 μm의 원통형 필터를 통해 농축을 전달합니다.
- 모든 150 ml의 후 0.45 μm의 원통형 필터를 변경합니다. 0.45 μm의-FIL 수집50 ㎖ 튜브에이 많았다 바이러스 성 집중한다.
- 잔류 세균을 제거하기 위해 여과 바이러스 농축 각각 50 mL를 클로로포름 250 μl를 추가합니다. 후속 처리까지 4 ° C에서 수직, 혼합 반전 및 저장.
- 0.45 μm의 필터를 건조 및 3.6.5와 3.6.6 단계에 설명 된대로 저장합니다.
현미경 샘플 4. 처리
주 : 잠재적 인 오염 또는 실행 사이의 생물학적 잔류를 방지하기 위해 95 % 에탄올 다음 10 % 표백제와 필터 타워를 씻어. 가능하면 프로세스 현미경 샘플 1 시간 이내 및 노출 얼룩과 스테인드 필터를 피하기가 점등합니다.
- 산
- 1X PBS의 4.9 ml의 10 % 아스 코르 빈산 100 μl를 추가하고 철저하게 섞는다.
- 100 % 글리세린 5 mL를 넣고 잘 섞는다.
- 필터는 -20 ° C에서 0.02 μm의 알루미나 매트릭스 일회용 주사기 필터, 나누어지는 및 저장을 사용하여 마운트합니다.
- SYBR골드 염색
- microcentrifuge 관에서 2 % 최종 농도의 파라 포름 알데히드로 고정 각 샘플의 500 μL 나누어지는 피펫.
- 각각의 분취 액을 1,000 배 SYBR 골드 솔루션의 0.5 μl를 추가합니다.
- 부드럽게 샘플을 혼합하고 10 분 동안 어둠에 넣어.
- 진공 펌프 시스템의 각 필터 스탠드에 환상 폴리 프로필렌 지원 반지와 0.02 μm의 알루미나 매트릭스 필터를 놓고 필터 타워를 (그림 4)를 연결합니다. 이러한 필터는 이중 다공성을 가지고 0.02 μm의 필터, 필터 스탠드 플라스틱면이 위로에 배치되어 있는지 확인합니다.
- 진공 펌프가 꺼진 상태에서 필터에 균등하게 분산되어 샘플을 보장하기 위해 0.02 μm의 여과 바이러스 무료 물 2 ㎖와 함께, SYBR 염색 시료의 500 μl를 추가합니다.
- 손상 바이러스와 미생물이 필터링되는 일을 방지 할 이하 1 bar의 부압을 생성하기 위해 진공 펌프를 켭니다.
- 전체 샘플 가고 허용를 통해.
- (DOC 사용 된 것과 동일하지 쌍) 집게를 사용하여 조심스럽게 필터가 건조하기 위해 닦아 필터링 타워에서 각 필터를 제거하고 섬세한 작업을 통해 전달합니다.
- 현미경 슬라이드에 마운트의 피펫 10 μL 및 마운트의 드롭 스테인드 샘플을 포함하는 건식 필터를 배치합니다.
- 커버 슬립을 추가하기 전에 10 μL 각 필터의 상단에 마운트 추가합니다.
- 부드럽게 아래로 커버 슬립을 누릅니다. 가능하면 공기 거품을 제거하고 커버 슬립의 움직임 옆으로 피하기 위해보십시오.
- -20 ° C에서 slidebox 및 저장에있는 장소 슬라이드.
- DAPI 염색
- 각 필터 스탠드에 환상 폴리 프로필렌 지원 반지와 0.2 μm의 알루미나 매트릭스 필터를 놓고 필터 타워를 연결합니다.
- 진공 펌프가 꺼진 상태에서, 사용 된 각 타워에 0.02 μm의 여과 바이러스 무료 물 2 ㎖를 추가합니다.
- 총 볼륨 O의 결과로 각각의 타워에 글루 타르 알데하이드로 고정 된 샘플의 피펫 1 ml의,F 각 필터 타워 3 ㎖.
- 이하 1 bar의 부압을 생성하는 진공 펌프의 전원을 켭니다.
- 0.2 μm의 알루미나 매트릭스 필터로 전체 샘플을 필터링합니다.
- 조심스럽게 집게 (DOC 사용 된 것과 동일하지 쌍)를 사용하여 필터링 타워에서 필터를 제거합니다.
- 바로 옆 필터를 유지 페트리 접시에 100 μL 드롭 DAPI 솔루션 [25 ㎍ / ㎖의]에 필터를 넣고 15 분 동안 샘플 염색을 할 수 있습니다. 염색 과정에서 빛을 피하십시오.
- 15 분 후, 얼룩에서 필터를 제거 섬세한 작업을 통해 전달할 닦아 건조하고 다시 필터를 유지, 0.02 μm의 여과 바이러스 무료 물 100 μL 강하로 전송 바로 옆, DAPI 얼룩 남아 씻어 1 분. 한번 세척을 반복합니다.
- SYBR 골드 샘플에 기재 한 바와 같이 현미경에 장착 필터는 동일한 방식으로 밀어 넣습니다.
5. DNA 추출
- 미생물 Metagenomic DNA
- RT에서 적어도 20 분 동안 원통형 필터를 해동.
- 10 ML의 주사기를 사용하여 필터에 남아있는 해수를 제거합니다. 표백 및 멸균 캡을 이용하여 원통형 필터의 하단부를 모자.
- 각 필터의 경우, 360 μL의 T1 "미리 용해"를 혼합 버퍼 50 μL 테 K, 다음 필터로 혼합물을 피펫. 열린 끝을 모자.
- 55 ° C에서 회전 오븐 O / N (또는 적어도 2 시간)에서의 용해 반응을 부화.
- 캡 중 하나를 제거하고 200 μL의 B3 "용해"를 추가 사전를 Lyse 샘플에 필터로 버퍼. 다시 캡 필터 및 70 ° C에서 10 내지 20 분 동안 오븐에서 회전 혼합물을 배양한다.
- 거꾸로 필터로 액체를 흡입하여 3 ML의 주사기를 사용하여 원통형 필터에서 전체 볼륨의 압축을 풉니 다.
- 새로운 미세 원심 분리 튜브에 용해 샘플을 추방, 100 % 에탄올 200 μL를 추가합니다.
- 잘 혼합 스핀에 전체 샘플을로드제조 업체의 프로토콜에 의해 지시 된대로 열은 계속 진행.
- 형광 계 분석을 이용하여 DNA 정량화.
- 해양 바이러스 성 메타 지노믹스
- 정화 및 파지 입자를 집중 (터버 등의 수정. 19)
- 1.7 g / ml의 용액을 제조 해수 CsCl과 녹인 1.5 g / ㎖ 1.35 g / ㎖, 1.2 g / ㎖ (용액 1 ㎖를 칭량하여 보정). 사용하기 전에 0.02 μm의 필터를 사용하여 각 부분을 필터링합니다.
참고 : 각 부분의 밀도가 솔루션을 사용하기 전에 세 개의 유효 숫자 정확하다는 것을 확인하고, 사용하기 전에 0.02 μm의 필터로 모든 솔루션을 필터링 할 수 있습니다. 사용 해수 또는 해수 각각 낮추거나 밀도를 증가시키기 CsCl과 포화. - 모든 시약이 진행하기 전에 바이러스가없는 것을 확인하기 위해 4.2 절에 기술 된 바와 같이 결합 시약 1 ㎖에서 현미경 슬라이드를 확인합니다.
- 바이러스 TFF 농축액 45 ml의에 9g CsCl과 추가1.12 g / ㎖의 최종 농도. 냉장 웹 기반 협동 학습 단계 구배를 설정하는 동안.
- 1.7 g / ml의 용액을 시작하면 연속적으로 혈청 학적 피펫을 사용하여 각 튜브에 서서히 밀도가 낮은 부분마다 순차적으로 1 ㎖를 추가합니다. 각각의 메 니스 커스 (meniscus)의 레벨을 표시하고 분수 사이 pycnoclines가 방해되지 않도록. 더 세부 사항에 대한 동반자 용지를 참조 (임 등. 2014).
- 혈청 학적 피펫 부하 ~ 83,000 XG에 6 튜브와 원심 분리기에 각각 샘플의 7.5 ml를 2 시간 동안 4 ° C로.
- 방해하지 않고 밀도 구배는 회 전자를 언로드 단지 3 ML의 주사기에 18 G 바늘 이전에 표시 1.5 g / ml의 밀도 층 (그림 5) 아래의 튜브를 관통. 정제 VLP를 1.5 ml의를 그려 새로운 microcentrifuge 관에 전송합니다. 모든 샘플에 대해 반복합니다.
- , 정제 된 VLP를 클로로포름의 0.2 볼륨을 추가 적극적으로 믹스, 실온에서 10 분 동안 배양한다.
- 추가 150# 181; 각각의 microcentrifuge 관에 10 배 DNase의 버퍼의 L.
- 5 분 동안 16,000 XG에 스핀, 수성 상을 수집. 클로로포름은 microcentrifuge 관의 바닥에 있지 집계를하는 경우, 더 DNase의 버퍼를 추가 혼합하고 반복합니다.
- 다음 15 분 동안 65 ° C에서 배양하여 DNase의 활성을 불 활성화,의 DNase I (최종 농도 = 2.5 유닛 / μL)를 첨가하고, 2 시간 동안 37 ° C에서 배양한다.
- 1.7 g / ml의 용액을 제조 해수 CsCl과 녹인 1.5 g / ㎖ 1.35 g / ㎖, 1.2 g / ㎖ (용액 1 ㎖를 칭량하여 보정). 사용하기 전에 0.02 μm의 필터를 사용하여 각 부분을 필터링합니다.
- 바이러스 유사 입자로부터 DNA 추출 (VLP를)
- 균등 두 세척 및 멸균 오크 리지 튜브에 각 샘플에서 정제 된 VLP를 수영장.
- 0.2 M EDTA, 0.01 볼륨 0.5 M EDTA, 포름 아미드 1 볼륨, 10 μL 글리코겐 (10 ㎎ / ㎖) 0.1 볼륨 2 M 트리스 - 염산 (PH 8.5)를 추가합니다. 잘 섞어 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 새 볼륨을 참조하면, 2 볼륨 RT 100 % 에탄올을 추가합니다. 혼합하고 30 분 동안 4 ° C에서 배양한다.
- 4 & #에서 60 분 동안 17,200 XG에서 오크 리지 튜브를 회전시켜 펠렛의 DNA176; C.
- 상층 액을 제거합니다. 혈청 피펫을 사용하여 빙냉 70 % 에탄올로 두 번 DNA 펠렛을 씻는다.
- 모든 에탄올 (필요한 경우 간단히 다시 회전), 덮개를 제거하고>을 실온에서 15 분 동안 자연 건조 펠렛을 할 수 있습니다.
- 1X TE 완충액 (pH 8.0) 567 μL의> 15 분 동안 DNA 펠렛을 재현 탁. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 재 부유 DNA의 567 μl를 전송합니다.
- 단백질 분해 효소 K의 3 μL (20 ㎍ / ㎖) (65 ° C 사용하기 전에에서 미리 따뜻한) 10 % SDS를 30 μl를 추가, 철저하게 혼합하고 56 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
- 5 M NaCl을 100 ㎕를 첨가하고 잘 섞는다. 미리 예열 CTAB NaCl 용액, 소용돌이의 80 μl를 추가하고 65 ° C에서 10 분 동안 품어.
- 2 분 동안 16,000 XG에서 클로로포름, 소용돌이, 스핀의 양의 0.2 부분을 추가합니다. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다.
- 24 : 페놀 클로로포름 이소 아밀 (25)의 동일한 볼륨을 추가 한 솔루션, 소용돌이가 혼합,2 분 동안 16,000 XG에 스핀. 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 뜨는을 전송합니다.
- 2 분 동안 16,000 XG에서 클로로포름, 소용돌이, 스핀의 동일한 볼륨을 추가합니다. 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 뜨는을 전송합니다.
- 상청액 분획을 이소프로판올 0.7 부피를 추가하고 DNA를 침전 적어도 30 분 동안 -20 ° C에서 배양한다.
- 4 ° C에서 20 분 동안 16,000 XG에서 회전시켜 DNA를 펠렛. 상층 액을 피펫과 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 500 μL로 두 번 펠렛을 씻는다.
- 16,000 XG에서 스핀과 튜브에 남아있는 에탄올을 제거합니다. 15 분 동안 펠렛을 공기 - 건조.
- 실온에서 적어도 5 분간 용출 버퍼 (5 mM 트리스, 산도 7.5) 또는 트리스 - EDTA의 pH 8.0의 50 μL로 재현 탁 DNA 펠릿.
- 고감도 형광 계 분석을 이용하여 DNA 정량화.
- 정화 및 파지 입자를 집중 (터버 등의 수정. 19)
Representative Results
현미경 사용
현미경 샘플들은 그들이 원하는 품질의 보장 즉시 분석되어야한다있다. 풍부하고 세균 커뮤니티 크기 분포를 측정하기 위해, DAPI 슬라이드가 표면 형광 현미경으로 검사한다 (도 6A) (여기 / 방출. 461분의 358 nm의 McDole 외 2012 참조). 세포 수 및 치수는 이미징 소프트웨어 (예 ImagePro 또는 ImageJ에)를 사용하여 수집 될 수있다. 모든 셀은 다음의 방정식을 사용하여 반구형 캡과 실린더의 형상을 가질 가정함으로써 유도되는 길이와 폭 측정 셀 볼륨 (V)에서 :
V = π / 4 × W 2 (L - / 3 승)
L은 길이와 W가 어디 각 셀의 23.4의 폭이다. 미생물 바이오 매스이어서 FO 이전에 설정된 크기 의존 관계를 이용하여 추정 될 수있다R 해양 미생물 군집 (24). 일반적으로 해양 박테리아는 0.1-4 μm의에서 길이 다양하지만, 일부 지역에서는 ~ 8 μm의 최대 이동합니다.
DAPI로 염색 필터 (0.2 μm의 참조)은 박테리아가 표시됩니다 동안, SYBR 골드 스테인 (0.02 μm의)에 사용되는 필터는 박테리아와 바이러스를 포함한다. 바이러스 풍부를 측정하는 미생물과 동일한 프로토콜을 따른다 그러나 325-375 nm 인 여기 사용되며 발산 최대 537 nm의 (도 6B)에있다.
정량적 데이터를 생성하기 위해 샘플링 볼륨은 원래 샘플 바이러스 풍부에 따라 조정할 필요가있다. 올바른 볼륨이 가장 좋은 물을 주어 몸 경험적으로 결정되는 필터링합니다. 바이러스의 다양한 농도로 함유하는 샘플을 현미경 사진의 예는도 7에 도시되어있다.
이전의 연구 결과는 미생물에 그 바이러스를 제안비율 (VMR)는 일반적으로 산호초 시스템의 약 6의 평균 (놀즈 게시되지 않은 데이터)와, 수생 시스템 25-29에서 1-50 범위와의 사이에 3, 20.
유동 세포 계측법
직접 카운트 및 미생물 군집의 크기 추정 이외에, 유동 세포 계측법을 통해 종속 영양 세균에 독립 영양의 비의 평가는 상기 수집 된 샘플로부터 (도 8에 주어진 출력 계측법 예시 흐름)를 추출 할 수있다. 전체 박테리아 세포의 수를 결정하기 위해, 샘플은 SYBR 그린 I 염색되고 30분의 530 대역 통과 필터와 광전자 증 배관은 검출을 위해 사용된다. 엽록소 및 phycoerytherin (42분의 585 대역 통과 필터) (다시 675-735 nm의 범위의 결과로 다시 LP 거울에) 채널은 흠 샘플에서 독립 영양 생물의 풍부를 계산하는 데 사용됩니다. 종속 영양 미생물의 풍부, 비에서 독립 영양 수를 확인하려면스테인드 부분은 다음 SYBR 염색 총 수 (McDole 등. 제출)에서 차감된다.
바이러스 성 메타 지노믹스
바이러스 메타 지노믹스 커뮤니티 구조와 기능을 결정하기 위해 전체 게놈 서열 정보를 이용하여, 바이러스의 생태 배양 독립적 분자 접근법을 이용한다. 메타 지노믹스는 글로벌 스케일 (30)에 복잡성과 지방 17에서 바이러스 성 지역 사회의 다양성에 대한 우리의 이해를 증진하고있다. 바이러스 성 metagenomic 데이터의 분석을위한 생물 정보학 도구의 광범위한 배열의 최근 발전은 메타 지노믹스의 렌즈를 통해보다 포괄적 인 뷰 virosphere의 허용, 전산 병목 현상을 감소했다.
여기에 제시된 방법은, 농도를 파편 및 세포 물질을 제거하기 위해 메쉬 큰 기공 크기 나일론 예비 여과의 조합을 이용하여 해수로부터 분리 및 바이러스 입자의 농축을 강조TFF (그림 3)과 이후의 0.45 μm의 여과 시료는 큰 세포를 제거합니다. 이 방법은 대략 우리가 작은 볼륨에서 다운 스트림 프로세스를 수행 할 수있는 100 배 농축 된 샘플 (그림 5B-5E)을 생산하고 있습니다. 바이러스 성 용 해물에 남아있는 미생물 세포의 성장을 방지하고, 따라서 필드 스테이션 및 실험실 사이의 긴 전송 시간 동안 샘플의 바이러스 풍부하게 변경하기 위하여, 클로로포름 종종 수납 2 %의 최종 농도로 첨가된다. 단리 및 정제의 VLP를 따라, 예컨대 금 등의 SYBR 핵산 염료 표면 형광 현미경은 바이러스 입자의 존재 및 순도 (도 5B-5E)을 확인하는 데 사용된다.
여기에, 우리는 남부 라인 섬 산호초에서 두 바이러스 성 metagenomes을 제시, 구체적으로는 스타 벅스 (Star7)과 밀레니엄 (CAR9, 이전 캐롤라인라고도 함) 섬. 120 L 샘의 총 부피섹션 3.7 및 5.2에 설명 된대로 PLE 물 10 미터의 깊이에서 각 사이트에서 수집 및 처리되었습니다. 제 4 (도 5b)에 기재된 방법에 따라 확인 된 바와 같이 염화 세슘 구배 원심 분리로 정제 한 VLPs를는 CAR9 (도 5d) 3.3 × 10 8 입자 / ㎖ 및 Star7 대 1 ㎖ 당 2.9 × 109 입자를 사용했다. 이들 샘플로부터 분리 된 DNA의 총량은 약 400 Nanodrop 측정에 기초 NG였다. DNA는 시퀀스 데이터의 특성은 표 1에 제시되어있다. 기존 데이터베이스를 이용하여 유사성 검색 기준 Phi29 폴리머 라 아제를 사용하여 증폭되고, 2011 년 환경 유전체학 핵심 기능에 의해 서열화하고, 서열의 대부분 (> 70 %)는 종종 끝내 지지 않은, 즉, 알 수없는 기원과 기능. 유사하게, 여기에 제시된 두 viromes 알려지지 않은 서열의 97 % 이상을 제시했다. 그 결과, 비 데이터베이스따라 분석은 분석에 사용 (바이러스 성 메타 지노믹스에서 "암흑 물질"에 대한 연구 기회의 새로운 팔을 연 Seguritan 등. 언론).
미생물 메타 지노믹스
미생물 metagenomes의 분석은 미생물 군집 존재의 특성과 이러한 지역 사회의 기능을 설명 할 수 있습니다. 예 macrobial 사회 구조의 변화 또는 사용 가능한 영양분과 종의 풍부하고 그들의 주된 대사 경로 (; 켈리 등 알 2014. 그림 9) 사이에 병원균 및 독성 5,22 또는 비교의 존재의 추정을 포함한다.
물 화학
화학 물 파라미터는 일반적으로 원하는 데이터를 생성하기 위해 광범위한 분석 처리를 수행; DOC 분석을위한 시료는 고온 산화 촉매 31,3 통해 측정 될2, 흐름 주입 분석 36,12,37 의한 원소 분석기 33-35 및 무기 양분 결합 동위 원소 비율 질량 분석을 통해 입자상 유기물 (POM). 모든 분석을 성공적으로 완료 한 후, 표 1에 나타내는 정보는 미생물 및 바이러스 사회의 특성을 보완하는 데 이용할 수있을 것이다. 이 정보는 유기 탄소와 질소 샘플의 안정 동위 원소 비율 칭찬 할 수 있고 독립 영양 생물과 종속 영양 미생물 사이의 비율 (McDole 등. 제출) (하스 등. 35 참조).
프로토콜 절에서 설명하는 방법 그림 1. 개요. 이 figu의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오다시.
그림 2. 샘플 처리 장비 설치. 여기에서 소개 여과 설정은 (개략도는, 실제 사진 오른쪽 패널 왼쪽) 반드시 샘플을 생성하는 데 필요하지 않지만 상당히 과정을 촉진합니다. 설정 (1) 하타 Niskin 채 장치가 탑재되는 백 플레이트로 구성되어 있습니다. 아래로 향 배출구에서 하타 Niskin 채 단위는 인라인 필터 홀더 (2)에 실리콘 튜브로 연결된다. 다음은 HDPE 샘플링 유리 병에 각각의 필터를 통해 샘플링 된 물 패스 (3) 바로 아래에 장착 할 수 있습니다. 여과 공정은 압력 게이지 (5)에 의해 조정 및 가압 공기 (4)를 통해 가속된다. 오버 플로우 분지는 HDPE 유리 병 또는 POM 여과의 변화 동안 물을 흘리고 방지 할 수 있습니다. 하시기 바랍니다이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 나일론 (터버 외. (19)로부터 변형)도 3 접선 흐름 필터 라인업 여과 메쉬 샘플 물 접선 흐름 필터에 연동 펌프 (2)를 통하여 리저버 (1)로부터 펌핑된다 (3). 역압이없는 복귀 라인 (4)을 따라 저장조 (1) ~ 시료 물 복귀한다. 배압이 복귀 라인에 호스 클램프 (5)를 통해인가되는 경우, 물이 필터를 통과하여 폐기되거나 여액 저장조 (6)에 전달된다. 모든 샘플 물이 튜브 라인에 집중되어 때까지 여과 라인을 집중으로 샘플 물이 대체됩니다.
그림 4. 현미경 슬라이드 여과 설정.균등 각 알루미나 매트릭스 필터 DAPI 및 SYBR 골드 염색 시료를 분배하기 (1), 필터 클램프 (4)로 여과 매니 폴드의 필터 탑 (2)와 스템 사이에 배치하고 고정 할 필요가있다. 압력 조절 진공 (5) 여과 과정 (개략도 탑, 실제 사진 하단 패널)을 촉진 할 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5. 정제 및 파지 입자의 농도. 각 염화 세슘 밀도 구배 1 ㎖의 총 전처리 된 샘플 (A)를 이끄는 전에 서로의 상단에 적층된다. 각 층은 초 원심 분리 후 추출을 용이하게하기 위해 튜브의 외부 표시되어야한다. 튜브 EX에 피어싱됩니다 빨간색 화살표 표시VLP 분획 TRACT. Star7 (B) 및 CAR9 (D)의 0.45 μm의 필터 대표적인 바이러스 성 집중의 표면 형광 현미경 : 바이러스 농축의 현미경 사진 (BE). 단지 VLP를 (흰색 화살표) 염화 세슘 구배 초 원심 분리 후 남아있는 반면, 박테리아 세포를 포함한 대형 입자 Star7 (B) 및 CAR9 (D) 샘플 모두로부터 0.45 μm의 여액에서 볼 수 있었다; 스타 7 (C)과 CAR9 (E). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 (A) 및 DAPI (B) SYBR 골드 염색 슬라이드 예의 분석 DAPI와 SYBR 골드 현미경 분석. 6. 스크린의 예. (A) 길이와 모든의 폭 (μm의)는 입자를 강조(= 미생물)는 촬상 프로그램의 도움으로 평가 될 수있다. 이미지의 중심에 응집을 참고. 이러한 클러스터는 분석 중에 바이러스 (B). 후속 분석에서 제외 될 필요가 세균은 VLP 및 세포 크기 범위 (적색 VLP, 셀룰러 녹색)로 크기가 임계 비닝 될 필요가있다. 일반적으로 각각의 영상 프로그램에 의해 분류되지 않은 일부 희미한 VLP를가합니다. 같은 희미한 흰색 도트 나타나는 이러한 VLP를 수동으로 계산하고 자동화 된 바이러스 개수에 추가해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 SYBR 금의 농도 7. 염색 표본. SYBR 염색 바이러스 샘플의 다양한 숫자를 포함 0.02 알루미나 매트릭스 필터의 현미경 사진. 패널은 AF를 보여줍니다B에 표시된 필터의 농도가 신뢰할 수가 너무 낮은 너무 높은 C에있는 반면 ilter는, 여과 해수의 적절한 금액을 포함. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 암초 물 시료의 분석 출력 유동 세포 계측법의 8 결과. 패널 (A)는 본 악기 설정으로 최소한의 배경을 확인하는 데 사용되는 노란색 - 녹색 형광 마이크로 스피어 (0.75 μm의)와 분자 수준의 물을 보여줍니다. 패널 (B)는 비드가 여전히 독립 영양 생물의 여러 집단과 함께 동일한 위치에서 볼 수 있음 A. 주에서와 동일한 설정과 레이아웃 암초 물 샘플 실행의 출력을 도시한다. (C) (B)과 동일한 샘플. (D) SYBR 녹색 I. 사용으로 염색 대표 암초 물 샘플 (C)에 설립 게이팅, 총 미생물 수가가 생성되었고, 엽록소 형광도에 의해 분할 종속과 독립 영양 미생물. (McDole 등. 4 참조) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 미생물 metagenome 데이터의 9 예. 미생물 metagenomic 시퀀스 데이터 및 사이트 종속 변수 사이의 패턴. Synechococcus의 다음 상대 풍부 Pelagibacter 종 반면, 산호의 비율이 커버의 상관 관계를 보였다. (패널 왼쪽)되지 않았습니다. DNA의 수리를 위해 대사 경로가 모든 metagenomes (오른쪽 패널) 사이의 일치 동안 공역 전송을위한 대사 경로가 긍정적으로, 질산염 농도와의 상관 관계를 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 스타 7 | CAR9 | |
| 총 수의 읽 | 939311 | 591600 |
| 전처리 수 읽고 | 579664 | 360246 |
| 시퀀스의 길이를 평균 (BP) | 395 ± 131 | 451 ± 159 |
| 주석 시퀀스 (%) | 42,218 (7.3 %) 9117 (2.5 %) | |
| 알 수 (%) | 537,446 (92.7 %) | 351,129 (97.5 %) |
남부 라인 제도, 스타 벅스와 밀레니엄에서 생성 된 두 viromes 표 1. 데이터 특성. 주석의 정도는 MG-RAST 서버를 사용 BLAT을 기반으로합니다.
한 탐험하는 동안 여러 사이트에서 데이터를 보여주는 표 2. 대표 결과. 여기에 평가 매개 변수는 미생물 및 바이러스 중 농도와 결합 물 화학 측정을 포함한다. 표는 추가로 각각의 샘플링 위치에 대한 각각의 metagenomic 데이터를 참조 파일 이름을 포함합니다. 탄소 및 무기 양분 농도는 μmol / L에 제시되어있다. 하십시오이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 제시된 방법은 수중 생태계에서 바이러스와 미생물 역학의 포괄적 인 평가를 생성하는 도구를 제공합니다. 그들은 미생물 군집에 사용할 수 유기 및 무기 자원의 서 주식을 정량화하고 바이러스와 미생물 군집 존재의 구성의 특성을 목표로하고 있습니다. 다음 바이러스 풍부하고 미생물 풍부한 바이오 매스를 정량화에, 게놈 서열 정보는 지역 사회의 구조와 기능을 알 수있다. 모든 방법이 개발 또는 원격 필드 위치에서 응용 프로그램을 허용하도록 수정되었습니다. 그러나 제어 실험실 설정의 부족은 본질적으로 오류에 대한 몇 가지 가능성을 만듭니다. 여기에서 우리는 평가 각 매개 변수와 관련된 몇 가지주의 사항에 대해 설명합니다. 다음 오염 가능성에 샘플 동안 또한 분석 과정에서 오류 가능성을 산출 일부 매개 변수를 처리.
용존 유기 탄소
탄소 오염 (하류 샘플링 또는 보트 또는 잠수의 근방), 시료 전처리 과정 (장비 또는 부주의 핸들링 오염), 심지어 시료의 저장 동안 (다른 샘플을 냉장고에서 유기물 함유 샘플링 절차 중에 발생할 수 용제 / 휘발성 물질). 각 샘플 재배치 오염의 추가 소스를 포즈, 가능한 한 적은 수의 처리 단계 등의 오염 행위의 다양한 소스를 방지하려면. 샘플은 없습니다 산 세척 또는 연소 된 모든 항목과 접촉하지합니다. 마지막으로, 휘발성 유기 물질을 함유하지 않는 시료 전용 스토리지 냉동기를 지정하는 데는 긴 저장 기간 동안 샘플의 무결성을 보장한다. 샘플을 농축 HCl로 DOC 샘플의 출장 기간 산성화 중에 냉동 보존 될 수없는 경우 (38-41 바와 같은) 적용 가능한 대안 일 수있다. 측정 정확도 DOC 컨센서스 참고 자료가 레지 표기 확인하려면DOC 측정시 ularly 실행됩니다. 그것 DOC 함량 42 매우 안정적이므로 특히 해양 심층수 (> 2,000m) 참조는 분석 시스템의 성능을 평가하는 데 가치가있다.
입자상 유기 물질
유기 탄소 오염을 방지하는 것 외에도, POM 샘플링은 필터링 된 볼륨의 정확도를 보장하기 위해 특별한주의를 필요로한다. 500 ㎖가 타겟 볼륨 잠재적 이유로 이탈해야한다면 이는 파생의 여액에 필터에 포획 POM의 양을 관련시키기 주목해야한다.
무기 영양소
유기 탄소 샘플링과 마찬가지로,주의 보트 또는 폐수 배출 (12)와 같은 다양한 소스에서 생성 가능한 영양 샘플 오염에 지불해야합니다. 0.8 ㎛의 공칭 기공 크기와 유기 탄소 샘플링에 사용되는 필터는, 모든 미생물 바이오 매스와 쉬를 제외하지 않을 수 있습니다울드 따라서 이러한 여과 공정에 대해 0.2 ㎛의 필터로 변경. 또한, 검출 한계는 영양 샘플 문제를 제기; 특히 많은 산호초 위치 (예를 들면, 코너를 등. 43) 주변의 빈 영양면 물. 검출 한계는 대략 약 0.1, 0.2, 암모늄, 질산과 아질산염 및 오르토 - 인산 0.1 μmol / L 각각 (36,12,37 참조)입니다
현미경 사용
현미경 슬라이드에서 샘플 이미지 분석의 농도의 변화 옆에 추가 오류 가능성을 산출한다. 예를 들어, 이미지가 시야의 일부 영역에 초점이, 그리고 다른 사람에 초점을 수 있습니다. 고순도 알루미나 매트릭스 필터는 매우 단단한 필터 타입이기 때문에, 아래의 필터 이물질은 전체 필터 슬라이드 각도에 앉아 발생할 수있다. 결과적으로, 이미지는 다시, 주어진 필터에 대한 시야의 다양한 부분에서 초점이 일관 될 수현미경 정렬와는 상관이없고. 이 관찰되는 경우, 필터의 밑면을 보장 필터 재 마운트 것은 깨끗한,이를 개선 할 수있다. 또한, 어떤 경우에는 바이러스 및 미생물이 발견 될 수있는 두 초점면이있을 수있다. 이것은 장착시에 필터로부터 분리되고, 그리고 카운트 신뢰할 수 커버 슬립의 밑면에 떠 염색 오브젝트의 결과이다. 그러므로, 항상 공정 동안 샘플의 품질을 확인하기 위해 추천된다.
유동 세포 계측법
현미경 샘플에서와 같이 자연적으로 분석 프로세스의 조정을 필요로 샘플 유동 세포 계측법의 차이 발생이있을 수 있습니다. 예를 들어, 기기의 감도에 따라 희미 형광 Prochlorococcus 셀은 잡음 레벨 이하로 할 수 있고, 정량 않을 것이다. 비즈 확인하기 위해, 예를 들어, 내부 샘플 제어 (역할을하는 악기의 RESP형광 신호 온세는 날마다 일치 (및 실행 자체 동안 안정적으로 유지). 공지 된 농도에서 시료에 첨가하는 경우, 그들은 또한 샘플 량 실행을 검증하는 내부 제어로서 역할을 할 수있다. 그러나, 항상 해동하고 96 웰 플레이트 사이 실행 처리 샘플에 대한 추가적인 생물학적 제어를 제공하기 위해 관심의 샘플과 함께 얼룩이 이전 동결 "표준"해수 샘플의 분취 량을 실행하도록 권장한다. 위치에 따라, 해수 샘플은 서로 매우 다를 수 있습니다. "대표"인구를 정렬하고 epifluorescent 현미경 (EM)에서보기를 신속 하나 Synechococcus SP. 또는 광합성 진핵 생물로 식물 플랑크톤의 개체수를 확인하는 좋은 방법이 될 수 있습니다. 그들은 너무 빨리 퇴색하기 때문에 Prochlorococcus 세포가 EM에서 일반적으로 볼 수 없습니다. 또한, Synechococcus SP는 클로로필. 또한 pH를 포함엽록소 A (660-700 ㎚)보다 단파장 (540-630 ㎚)로 발광 otopigment phycoeurythrin (PE). Synechococcus 세포 블루 / 그린 빛 (470-490 nm의) 흥분 할 때 510 nm의 아래 빛의 모든 파장을 제거하는 배기 필터에서 볼 경우, 그들은 황금 나타납니다. 빛의 같은 파장으로 흥분 할 때 비교함으로써, 진핵 부분은 빨간색 볼 것이다.
바이러스 성 메타 지노믹스
그것은 VLP 농도 및 저장 과정을 회수 사회에 영향을 유의하는 것이 중요하다. 바이러스 성 입자 손실이 프로세스의 모든 단계에서 발생할 수 있고, 따라서, 바이러스 농축 및 정제 프로토콜의 선택은 궁극적으로 생성 된 바이러스 metagenomes 44,45,18의 분류 학적 관찰과 조성의 다양성에 영향을 미칠 수있다. 샘플을 농축 TFF 19 또는 화학적 응집 계 (20)를 사용하여 수행 할 수있다. 화학 기반의 접근 방식, 멋 부리다에서ively 철 이온 용액으로부터 응집 8 μm의 필터를 사용하여 복구 될 수있다 큰 (> 8 μm의) 철 - 바이러스 성 복합체를 형성하는 천연 음전하 바이러스 입자를 바인딩 청구. 이어서 철 바이러스 입자를 킬레이트 핵산 추출 20 농축 바이러스 입자를 떠나, 마그네슘, 아스코르브 산, 및 EDTA를 사용하여 다시 용해된다. 이러한 두 가지 현재의 방법과 비교 한 후, 우리는 염화철 방법은 TFF 바이러스 농도보다 적은 시간 소모적이지만, 몇 가지주의를 산출 할 수 있다는 결론을 내렸다. 우리는 철 바이러스의 분리 및 용해를 발견 필요로하는 두 배 용해 아스 코르 빈산이 저하되기 전에 진행하기 위해서는보고 (20)보다 더 농축 된 마그네슘 아스 코르 빈산-EDTA 솔루션을. 이와는 문제로부터, 프로토콜은 0.2 μm의 여과를 이용하여 미생물 오염 물질을 제거 단독 크기 분별하여 바이러스 입자를 정화한다. 대형 바이러스는 여과 및 통과하지 않습니다어 (예를 들어, 양 등. 46) 따라서 metagenome에서 검출되지 않습니다, 일부 박테리아는 않지만 (McDole, 게시되지 않은 데이터). 큰 바이러스 차별 동안이 박테리아 오염을 초래한다.
즉, 특정 문제 그러나 또한 TFF 농도와 관련 미생물의 제거에 적합하다. 클로로포름 처리 외부 지질막 (47)과 클로로포름 민감성 바이러스를 제거하기 위해 도시 한 바와 같이 일부 연구는 0.22 μm의 여과 박테리아의 대부분을 제거하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 또한, 제시된 방법은 주로 박테리오파지, 해양 환경에서 유전 물질의 가장 풍부한 캐리어를 대상으로 주목해야한다. 파지가 일반적으로 생각하기 때문에하지 일반적으로 그들은 클로로포름 처리에 더 저항성 지질 (48)를 포함한다. 우리의 지식에있는 "포괄적 인"방법은 지금까지 존재하지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 OU에서 적응북극 시스템에 열대에 걸쳐 다양한 해양 환경에서 지난 10 년 동안 연구 현장 경험.
미생물 메타 지노믹스
미생물 (즉, 박테리아 및 고세균) 미국 metagenomic 라이브러리의 구성은 라이브러리 제조를 위해 필요한 최소한의 DNA 농도를 생성하기 쉽다 바이러스 성 metagenomes보다 더 간단하다. 다중 변위 증폭 (MDA)에 기초 링커 증폭 산탄 라이브러리 (LASLs) 17,49,50 및 전체 게놈 증폭 시퀀싱 충분한 DNA를 생성하는 두 개의 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 미생물 metagenomes 더 높은 DNA 농도를 얻기 MDA의 사용은 때때로 필요하다. 그러나 이것은 같은 와편 모 조류의 minicircles의 overamplification과 시퀀스 데이터 아티팩트가 발생할 수 있습니다. MDA 방법은 비 - 정량적 결과 51,52 결과, 우선적으로 단일 가닥 및 원형의 DNA를 증폭하는 것으로 알려진. 최적화 된 LASLs (50)은 이렇게 미생물 및 시퀀싱 바이러스 성 metagenomic DNA를 모두 증폭에 더 나은 대안 역할을 할 수있다 접근. 그것은 LASLs 방식은 여러 단계가 복잡한 장비가 필요하고, dsDNA 템플릿에 한정된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 또한, 조직 DNA 추출 키트 그람 양성 및 그람 문 (門) 모두에서 DNA를 추출하기 위해 도시되었지만, 효과적으로를 Lyse 분해성 미생물 분류군 또는 연관된 구조체에 검증되지 않은 (예를 들면, 특정 고세균, 내생 포자, 진균 포자) . 따라서 비드 비팅 단계 특정 미생물로부터 DNA를 얻기 위해 필요할 수있다.
이러한 종합적인 평가는 바이러스와 미생물 생태계의 기능을 더 잘 이해 될 것입니다. 몇몇 연구는 제안 된 모든 매개 변수를 평가하는 노력을 수행하고 있지만, 많은 사람들이 선택한 사람을 조사하고있다. 넬슨 등. 53 betw 연결 제안근해를 기준으로 모두 DOC와 bacterioplankton 농도 EEN 특정 산호초 서식지 및 고갈. 이러한 농도 변화는 bacterioplankton 지역 사회의 뚜렷한 차별화를 동반했다. 딘즈 데일 등. 5는 증가 인위적 영향은 미생물 세포와 바이러스 입자의 10 배 이상 풍부함을 동반 한 것으로 나타났다. 이 거주하는 섬 주변 해수의 미생물 군집은 종속 영양 미생물과 잠재적 인 병원균 5의 큰 분수를했다. 마지막 McDole 등. 4는 인간 활동 macrobes의 비용으로 미생물에 에너지를 전환하고 있다는 microbialization 점수를 도입함으로써, 보였다. 특정 미생물과 물 화학 매개 변수에 초점을 맞춘이 연구는 해양 생태계의 생화학 적 구조에 새로운 통찰력을 제공합니다. 온도와 산도 값, 생선, 바이오 매스 및 diversi처럼 - 생태계 모니터링 노력의 기존의 데이터를 결합타이, 저서 커버, 또는 인간에 미치는 영향에 노출 - 물 화학 및 미생물 평가와 함께, 가능성이 더 구체적으로 대상 보존 노력으로 이어질 수 더 민감한 환경 모니터링 활동, 발생합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) | Figure 1 | ||
| Filtration setup | Figure 1 | ||
| 32-36% Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Sci | A508-212 | |
| High-density polyethylene (HDPE) container | e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid | ||
| Combustion oven (550 °C) | |||
| 60 ml HDPE vials | Fisher Sci | 02-896-2B | |
| 25 mm GF/F filter | Fisher Sci | 09-874-64 | |
| Forceps | Fisher Sci | XX62-000-06 | |
| Sterile, non-powdered gloves | Fisher Sci | 19-170-010B | |
| Bilge pump | e.g., Thirsty Mate 124PF | ||
| 20 L collapsible low-density polyethylene carboy | e.g., Reliance Fold A Carrier II | ||
| Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges | Amersham | CFP-2-E-9A | |
| Platinum-cured silicon tubing for TFF | Cole Parmer | 96440-82 | |
| Hose clamps | Cole Parmer | P-68007-23 | |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | EW-77410-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | Electron Microscopy Sciences | 21162 | |
| 0.2 µm Polycarbonate track-etched membrane filter | Fisher Sci | 09-300-61 | |
| 8.0 µm Polycarbonate track-etched membrane filter | Fisher Sci | 09-300-57 | |
| 0.22 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVGP01050 | |
| 0.45 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVHV010RS | |
| Synthetic nylon mesh | Sefar | 03-125-37 | |
| 20 ml Plastic scintillation bottle | Fisher Sci | 03-341-72C | |
| Clean bucket (10-20 L) | |||
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15714 | |
| 25% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16220 | |
| Liquid nitrogen | |||
| 0.02 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6002 | |
| 0.2 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6022 | |
| 10,000x SYBR Gold nucleic acid stain | Invitrogen | S11494 | |
| DAPI solution 25 µg/ml | Invitrogen | D1306 | |
| Molecular grade water | sigma aldrich | W-4502 | |
| Ascorbic acid | Fisher Sci | BP351-500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Sci | BP399-500 | |
| Glycerol | Fisher Sci | G31-500 | |
| Microscope slide | Fisher Sci | 12-550-123 | |
| Coverslip | Fisher Sci | 12-548-5M | |
| Delicate task wipe | Fisher Sci | 06-666A | |
| Slide station with vacuum pump | Figure 3 | ||
| DNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.1 | Nucleospin tissue kit |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Lifetechnologies | AM2546 | |
| 200-proof Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15058 | |
| Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | EW-45503-88 | |
| Cesium chloride (CsCl) | Fisher Sci | bp1595-500 | |
| 60 ml Syringe | Fisher Sci | 13-6898 | |
| 0.02 µm Alumina matrix disposable syringe filter | Fisher Sci | O992613 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 333790 | SW41 Ti Rotor |
| DNase I (100 units/µl) | Calbiochem | 260913 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher Sci | BP2482-500 | |
| Formamide | Fisher Sci | BP228-100 | |
| Glycogen | sigma aldrich | G-1767 | |
| 1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0 | Fisher Sci | BP2473-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Sci | 02674-25 | |
| 20 μg/ml Proteinase K | Fisher Sci | BP1700-500 | |
| Chloroform | Fisher Sci | BP1145-1 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | sigma aldrich | p3803 | |
| Isopropanol | Fisher Sci | BP2618-500 | |
| 50 ml Oak Ridge tube | Fisher Sci | 05-562-16B |
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