Abstract
Hier introduceren we een reeks grondig getest en goed gestandaardiseerde onderzoeksprotocollen aangepast voor gebruik in afgelegen maritieme omgevingen. De monstername protocollen omvatten de beoordeling van de middelen die beschikbaar zijn om de microbiële gemeenschap (opgeloste organische koolstof, zwevende organische stof, anorganische voedingsstoffen), en een uitgebreide beschrijving van de virale en bacteriële gemeenschappen (via directe virale en bacteriële tellingen, opsomming van autofluorescente microben, en bouw van virale en bacteriële metagenomes). We gebruiken een combinatie van methoden, die een gedispergeerde gebied van wetenschappelijke disciplines die reeds vastgestelde protocollen en enkele van de meest recente technieken ontwikkeld vertegenwoordigen. Vooral metagenomic sequencing technieken voor virale en bacteriële gemeenschap karakterisering, werd uitsluitend de laatste jaren, en blijft dus onderworpen aan voortdurende verbetering. Dit heeft geleid tot een verscheidenheid van bemonstering en bewerkingsprocedures currentgevoerd gebruikt. De set van methoden hier gepresenteerde biedt een up-to-date benadering van verzamelen en milieu monsters te verwerken. Parameters met deze protocollen gericht opleveren het minimum aan informatie die essentieel is om te karakteriseren en begrijpen van de onderliggende mechanismen van virale en microbiële gemeenschappen. Het geeft eenvoudig om richtlijnen om uitgebreide enquêtes te volgen en bespreekt kritische stappen en mogelijke valkuilen die relevant zijn voor elke techniek.
Introduction
Mariene ecosystemen blootgesteld aan een breed scala van storingen die resulteren in wijzigingen van de beschikbaarheid van voedingsstoffen aan de biomassa van toproofdieren. In de afgelopen tien jaar hebben meerdere studies het belang van de microbiële gemeenschappen in mariene ecosystemen 1-4 aangetoond. Het is duidelijk dat veranderingen in de bacteriële en virale door nauw verbonden met de algemene achteruitgang van het mariene milieu 5. Deze veranderingen kunnen worden vergemakkelijkt door veranderde geochemie in de waterkolom, zoals de beschikbaarheid van zuurstof of koolstof remineralisatie 6,7. Als gevolg van de onderlinge afhankelijkheid tussen de macroorganismen, water chemie en microbiële activiteit feedback loops kan de snelheid van aantasting van het ecosysteem 8 versnellen.
In de jaren 1970 en '80 werden meerdere pogingen gedaan om biogeochemische cycli te ontrafelen in mariene ecosystemen 9-11. Een van de belangrijkste uitdagingen voor deze vroege studies was het gebrekvan gestandaardiseerde benaderingen op het ingeschatte biogeochemische parameters te meten. Al waren er protocollen beschikbaar, voornamelijk op zeewater voedingsstoffen 12,13, de beoordeling van koolstof dynamiek en de microbiële gemeenschap structuur werden beperkt door de instrumenten en methoden beschikbaar. Met JGOFS EqPac methoden vergelijking Sharp et al. 14 voorgesteld voor het eerst een betrouwbare en gestandaardiseerd protocol voor opgeloste organische koolstof (DOC) concentratie evaluaties. Door de vroege jaren 2000 de analytische uitdagingen om middelen ter beschikking van de microbiële gemeenschap was dus grotendeels opgelost te bepalen en de aanpak van microbiële gemeenschappen te karakteriseren in gecontroleerde omgevingen cultuur was vastgesteld (zie DeLong 15). De traditionele sequencing methoden in die tijd grotendeels vertrouwd op gecultiveerd klonale culturen. Vroege milieu gen sequencing van natuurlijke monsters bleek echter dat de meerderheid van de microbiële biodiversiteit had gemist door Gecultivatie-gebaseerde methoden 16. In 2002, Breitbart et al. 17 shotgun sequencing voor de eerste keer naar de virale gemeenschap in milieu zeewatermonsters vaststelling van een werkwijze voor het volledige genoom van uncultured mariene virale gemeenschappen sequentie beschrijven.
Binnen het bestaande microbiële assessments, virussen nog steeds bijzonder onder bestudeerde, zoals de meeste zijn moeilijk te kweken en ze missen een universeel geconserveerde marker zoals de 16S ribosomaal RNA (rRNA) genen meestal gebruikt voor de beoordeling van de diversiteit en de gemeenschap profileren. De metagenomic sequencing aanpak biedt een alternatief voor de cultuur-afhankelijk en gen-gerichte methoden voor het analyseren van complexe virale gemeenschappen. Terwijl de eerste virale metagenomes gegenereerd uit zeewater werden gesequenced met Sanger sequentiebepaling 17, heeft de ontwikkeling van de volgende generatie sequencing technologieën en verbeterde moleculaire technieken geleid tot een snelle toename metagenomic studies 18 19-21.
Om de bestaande kennis over virale, microbiële en biochemische functioneren in aquatische ecosystemen te bevorderen, het vergelijken van data sets in diverse systemen over de hele wereld is van essentieel belang. Echter, de vastgestelde protocollen grotendeels ontwikkeld voor near-shore omgevingen met gemakkelijk toegankelijke laboratoriumfaciliteiten. Dus het ontbreken van gestandaardiseerde veldmethodes belemmert deze cross-ecosysteem vergelijkingen. Hier introduceren we grondig getest en goed gestandaardiseerd aanpassingen van state of the art onderzoek protocollen voor gebruik in afgelegen gebied locaties. Deze methoden zijn succesvol in meerdere studies verspreid over de afgelopen decennium 5,22 gebleken en momenteel door diverse mariene laboratoria en op de NOAAReef Assessment en Monitoring Program (RAMP) de hele Stille Oceaan 4. De monstername protocollen omvatten water chemische parameters (anorganische en organische koolstof concentraties anorganische concentratie voedingsstoffen), virale en bacteriële overvloed (directe bacteriële tellingen, directe virale tellingen, en flowcytometrie om autotroph vs heterotroph verhoudingen te beoordelen), en virale en microbiële gemeenschap structuur en metabolisch potentieel door metagenomic analyse (voor een overzicht zie figuur 1). De uit de hier beschreven werkwijzen resultaten vereist om essentiële biochemische basisstroom nodig om volledig karakteriseren aquatische ecosystemen helderen.
Protocol
1. Voorbereiding van de instrumenten
- Voorbereiding van de Filtratie Setup
- Bereid een 5% zoutzuur (HCl) oplossing (0,5-0,6 M, voeg 250 ml 32-36% HCl tot 4,75 L gedestilleerd water tot 5 liter uiteindelijke oplossing te maken). Bewaar deze oplossing in een hoge dichtheid polyethyleen (HDPE) gedurende 2 weken.
- Laat alle onderdelen die in contact met het monster (behalve de filters) komt voor 24 uur in 5% HCl-oplossing bloedzuiger op mogelijke opgeloste organische koolstof (DOC) contaminanten. Na elke bemonstering evenement Spoel alle onderdelen en flush lijnen met ongeveer 30 ml 5% HCl oplossing voor carbon besmetting te voorkomen (bijvoorbeeld van gas rook, olie, boten, muggenspray).
- Houd alle bemonstering artikelen verpakt in vooraf verbrand aluminiumfolie of bedekte tot onmiddellijk voor gebruik.
- Precombust 25 mm GF / F filters gewikkeld in aluminiumfolie in een moffeloven bij 550 ° C gedurende 12 uur te vervluchtigen uit alle koolstof en bewaar ze in een schone, drogeplaats tot gebruik. Met zuur gewassen pincet en steriel, niet-gepoederde handschoenen de precombusted filters behandelen allen tijde.
- Voorbereiding van Viral metagenoom Sampling Materials
- Grondig vier 20 L opvouwbare lagedichtheidpolyetheen jerrycans en vier 20 L hogedichtheidspolyethyleen emmers en deksels met 10% bleekmiddel.
- Vervolgens reinigen alle items 3x met gedestilleerd en vervolgens monster water en verzegelt mandeflessen met spigot.
- Wassen tangentiale Flow Filters (TFF) na elk gebruik volgens de onderstaande voorschriften, en schoon preventief indien het filter niet in de laatste 5 dagen.
- Los op in 5 liter water in een wasbeurt emmer 50 g NaOH pellets.
- Bevestig een natte TFF de slangen en assembleren volgens figuur 3.
- Draaien peristaltische pomp bij ~ 30 rpm zonder tegendruk enkele van de NaOH wasoplossing bewegen door het systeem. Was eenmaal stroomt van de retourleiding, bewegen transfer naar emmer wassenom de circulatie van oplossing voltooien.
- Solliciteer tegendruk aan het systeem door het plaatsen van een klem op de retourleiding stroomafwaarts van de TFF. Dit zal wasoplossing uit het filtraat lijn forceren. Veel tijd (5 min) naar de buitenzijde van de TFF overstromen en produceren filtraat wijst op een aangetaste TFF.
- Start het systeem totdat alle NaOH oplossing in de leidingen. Verwijder vervolgens de tegendruk, run-oplossing uit het systeem en gooi deze weg.
- Spoel de TFF door stromend water onder tegendruk tot de pH van het water dat uit de terugkeer en filtraat lijnen is pH 7-8.
- Verwijder slang van de peristaltische pomp en TFF. Verzegelt TFF voor opslag. Zorg ervoor dat de TFF nat blijft tot het volgende gebruik.
2. Sample Collection
OPMERKING: Tijdens het transport van alle verzamelde monsters moeten worden bewaard cool (indien mogelijk 4 ° C) en niet blootgesteld aan direct zonlicht, tot verdere verwerking.
- Monsternemingvoor Carbon, Voeding, Microscopie, flowcytometrie, en Microbiële Metagenomics
- Neem twee Hatay Niskin eenheden per event sampling (resulterend in 4 L monster water). De bemonstering schepen openen net voor dompelen (anders opgesloten lucht zal dalen te voorkomen).
- Op de respectieve locaties, spoel de binnenzijde van het bemonsteringsvat met het monster water door het openen van beide uiteinden en bewegen van de cilinder langs de poolas door het water.
- Neem het monster en de bemonstering container zorgvuldig sluiten. Zorg ervoor dat de prikplaats is stroomopwaarts van de boot en duikers om besmetting te voorkomen.
- Bemonstering voor Virale Metagenomics
- Op de beoogde locatie te monteren lenspomp op 20 L mandfles.
- Vul mandfles gericht lenspomp inlaat aan de elk doelgebied en afdichting mandfles met de bijbehorende aansluiting.
- Verzamel 4 mandeflessen van ongefilterde zeewater (alles samen 80 L) van elkaar worden bemonsterd.
3. Sample voorbereiding
OPMERKING: Verwerk de monsters in de volgorde hier gepresenteerde beginnen met DOC de kans op besmetting te minimaliseren. Gebruik poedervrije handschoenen voor de hele procedure.
- Opgeloste organische koolstof (DOC)
- Mount een van de twee monster Hatay Niskin eenheden in de respectievelijke sleuf van de filtratie set. Sluit de uitlaat slang die leidt naar de respectievelijke filterhouder. Sluit de perslucht (0,2 bar) slang aan de Hatay Niskin eenheid (zie figuur 2).
- Spoel alle lijnen met 100 ml van het monster water voordat u filters in de filterhouders. Plaats 25 mm vooraf verbrand GF / F filter in filterhouder met behulp van het zuur gewassen tang. Spoel elk DOC fles en dop 3 keer met ongeveer 20 ml gefilterd bemonstering water.
- Vul de fles met ongeveer 40 ml (~ 2/3 vol) van de bemonstering water. Verzamel minstens duplicaten van DOC monsters om een back-up in geval van mogelijke besmetting of verlies tijdens het transport.
- Freeze bemonstering flessen rechtop staat bij -20 ° C tot analyse.
- Particulate Organic Matter (POM)
- Na DOC monsters zijn verzameld blijven filteren tot een totaal van 500 ml zijn geslaagd voor de GF / F filter, met inbegrip van wat gepasseerd terwijl het verzamelen van DOC monsters.
- Schroef inline filterhouder.
- Verwijder de filter voor POM analyse met behulp van een tang en plaats het filter in een vierkant van pre-verbrand aluminiumfolie, vouw boven-kant in zichzelf gekeerd, en wikkel.
- Freeze filters bij -20 ° C voor opslag totdat onderworpen aan elementaire en isotopische analyse.
- Anorganische Nutriënten
- Plaats een 0,2 um-Track geëtst filter in elke filterhouder. Bevestig de filter cassettes.
- Spoel elk 20 ml plastic scintillation fles drie keer met sampling water. Vul elke fles naar de schouder (~ 18 ml).
- Invriezen bij -20 ° C tot latere analyse.
- Microscopy (SYBR Goud en DAPI)
- Take off filterhouder.
- Verzamel 1 ml water in elk van twee microcentrifugebuisjes.
- Voeg 66 ul 32% paraformaldehyde één van de porties (later SYBR Gold kleuring). Voeg 12 ul 25% glutaaraldehyde de overeenkomstige andere (voor later DAPI kleuring).
- Meng en laat monsters te "repareren" gedurende minstens 15 min bij KT in het donker.
- Flowcytometrie
- Een 8.0 um polycarbonaat filter in een van de filterhouders om puin en grote eukaryote cellen uitsluiten.
- Passeren bemonstering water door tot 2 cryovials uit elke prikplaats vullen met 1 ml monster.
- Voeg 5 ul van 25% glutaaraldehyde elke cryovial (eindconcentratie = 0,125%).
- Omkeren flesjes te mengen.
- Laat het monster vast gedurende 15-30 minuten bij kamertemperatuur. Niet meer dan 30 min.
- Flash bevriezen monsters in vloeibare stikstof.
- WINKEL monsters bij -80 ° C of liquid stikstof droge verlader tot analyse op een flowcytometer.
- Microbiële Metagenomic Sample
- Verwijder in line filter houders.
- Direct monteren van een 0,22 pm cilindrische filter op de betreffende regel.
- Filter resterende monster water van beide Hatay Niskin units van elke site (in totaal 3-4 L per filter) door middel van een filter.
- Na de filtratie druk het resterende water uit elke filter met behulp van een schone 10 ml spuit gevuld met lucht.
- Plaats filter terug in de originele verpakking en sluit de verpakking met lab tape.
- WINKEL individueel verpakt filters bij -20 ° C.
- Virale Metagenomic Sample
- Transfer virale metagenoom monsters onmiddellijk in de gewassen emmers om ervoor te zorgen geen monster wordt verloren of besmet door het milieu.
- Pre-filter met behulp van grote poriegrootte nylon mesh (25-100 micrometer) om vuil en celmateriaal te verwijderen voorafgaand aan de concentratie 19.
- Stel de TFF zoals getoond in figuur 3, het plaatsen van de persleiding in een monster emmer, en laat het rendement en filtraat lijnen lopen in een gootsteen.
- Schakel de peristaltische pomp en spoel lijnen met 1-2 L van het monster water.
- Plaats retourleiding in de steekproef emmer om cyclus te voltooien, voeg 0,7 bar van de tegendruk.
- Terwijl het concentreren van de zeewater, vul monsterreservoir als het niveau daalt. Wanneer het waterniveau daalt onder de zuigleiding in de emmer, overdracht concentraat in een bleekmiddel gewassen, triple gespoeld tripour beker en blijven concentreren.
- Als reservoir beker leeg is, kan de tegendruk, verhogen de pompsnelheid en duw het hele monster door de lijnen, het herstellen van het in de tripour.
- Passeer het concentraat door 0,45 pm cilindrische filters om de meeste bacteriën te verwijderen terwijl niet discrimineren elke virale geslachten.
- Verander 0,45 pm cilindrische filters na elke 150 ml. Verzamel de 0,45 pm-filgistreerde virale concentraat in 50 ml buizen.
- Voeg 250 ul chloroform aan elk 50 ml aliquot van gefilterde virale concentraat resterende bacteriën te elimineren. Inverteer mengen en opslaan rechtop bij 4 ° C tot verdere verwerking.
- Droog de 0,45 pm filters en op te slaan, zoals beschreven in de stappen 3.6.5 en 3.6.6.
4. Verwerking van Microscopie Monsters
OPMERKING: Spoel filter torens met 10% bleekmiddel, gevolgd door 95% ethanol om potentiële vlek of biologische residu's tussen runs te voorkomen. Proces microscoop monsters binnen 1 uur en bloot vlekken en gekleurd filters aan te steken indien mogelijk.
- Berg
- Voeg 100 ul van 10% ascorbinezuur tot 4,9 ml 1x PBS, en meng goed.
- Voeg 5 ml 100% glycerol, en meng goed.
- Filterhouder met een 0,02 urn alumina matrix wegwerpspuit filter, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
- SYBRGoud kleuring
- Pipetteer 500 ul aliquot van elk 2% eindconcentratie paraformaldehyde in een microcentrifugebuis vast monster.
- Voeg 0,5 pl 1000x SYBR Gold oplossing in elk van de monsters.
- Meng het monster voorzichtig en zet het in het donker gedurende 10 minuten.
- Plaats een 0,02 urn filter alumina matrix met ringvormige polypropyleen steunring elk filter stand van het vacuümpomp systeem en bevestig het filter torens (figuur 4). Controleer de 0,02 urn filter wordt op het filter stand plastic rechtop als deze filters hebben een dubbele porositeit.
- Met de vacuümpomp uitgeschakeld, voeg 500 ul van SYBR gekleurd monster, samen met 2 ml van 0,02 urn gefiltreerd virusvrij water de monsterneming wordt gelijkmatig verdeeld over het filter.
- Zet de vacuümpomp een onderdruk van niet meer dan 1 bar om beschadiging virussen en microben gefilterd maken.
- Laat het gehele monster te gaandoor.
- Behulp van een tang (niet hetzelfde paar als gebruikt voor DOC), verwijder voorzichtig elk filter bij het filtreren toren, en gaat over een delicate taak vegen om ervoor te zorgen de filter droog is.
- Pipetteer 10 ul van de berg op een microscoop dia en plaats de droge filter met gekleurd monster op de daling van de berg.
- Voeg 10 ul monteren op de top van elk filter voordat een dekglaasje.
- Druk zachtjes op het dekglaasje naar beneden. Probeer om luchtbellen te verwijderen indien mogelijk en voorkomen zijwaartse beweging van het dekglaasje.
- Plaats dia in een slidebox en bewaar bij -20 ° C.
- DAPI kleuring
- Plaats een 0,2 um alumina matrix filter met ringvormige polypropyleen support ring op elk filter stand en maak de filter torens.
- Met de vacuümpomp uitgeschakeld, voeg 2 ml van 0,02 micrometer gefilterd virusvrij water naar elke toren gebruikt.
- Pipetteer 1 ml van de glutaaraldehyde gefixeerd monster in elke toren, resulterend in een totaal volume of 3 ml in elk filter toren.
- Zet vacuümpomp een onderdruk van niet meer dan 1 bar maken.
- Filter gehele monster op de 0,2 um alumina matrix filter.
- Verwijder voorzichtig filter bij het filtreren toren met behulp van een tang (niet hetzelfde paar als gebruikt voor DOC).
- Plaats het filter op een 100 ul druppel DAPI oplossing [25 ug / ml] in een petrischaal houden van de filter goede kant naar boven en laat het monster vlek gedurende 15 min. Vermijd licht tijdens de kleuring proces.
- Na de 15 minuten, verwijder het filter uit de vlek, geef deze door een delicate taak doekje te drogen en over te dragen aan een 100 ul daling van 0,02 micrometer gefilterd virusvrij water, opnieuw in, met de filter goede kant naar boven, af te wassen resterende DAPI vlek gedurende 1 min. Herhaal dit een keer te wassen.
- Mount filter op microscoop schuif de identieke wijze als beschreven voor de SYBR Gold monsters.
5. DNA Extraction
- Microbiële Metagenomic DNA
- Ontdooi de cilindrische filters gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder eventuele resterende zeewater in het filter met behulp van een spuit van 10 ml. Cap het ondereinde van het cilindrische filter met een gebleekte en geautoclaveerd cap.
- Voor elk filter, meng 360 ui T1 "pre-lysis" buffer en 50 pl Proteinase K, en vervolgens pipet het mengsel in de filter. Cap het open einde.
- Incubeer de lysis reactie in een roterende oven O / N (of tenminste 2 uur) bij 55 ° C.
- Verwijder een van de dop en voeg 200 ul B3 "lysis" buffer in het filter om de pre-lyseren monster. Re-cap filter en incuberen van het mengsel in een roterende oven gedurende 10-20 minuten bij 70 ° C.
- Pak het gehele volume van de cilindrische filter met behulp van een injectiespuit 3 ml door zuigen de vloeistof met de filter op zijn kop.
- Verdrijf de gelyseerde monster in een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 200 ul 100% ethanol.
- Meng goed, laadt het gehele monster op de spinkolom en gaat de instructies van het protocol van de fabrikant.
- Kwantificeren DNA met behulp van een fluorescerende gebaseerde bepaling.
- Marine Viral Metagenomics
- Zuiveren en concentreren faagdeeltjes (gemodificeerd van Thurber et al. 19)
- Los CsCl in zeewater oplossingen van 1,7 g / ml te bereiden, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml, 1,2 g / ml (geijkt door weging uit 1 ml oplossing). Filter elke fractie met 0,02 urn filter vóór gebruik.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de dichtheid van elke fractie nauwkeurig tot op drie cijfers voor het gebruik van de oplossingen is en filteren alle oplossingen met een filter voor gebruik 0,02 micrometer. Gebruik zeewater of zeewater verzadigd met CsCl respectievelijk verlagen of verhogen dichtheid. - Maak een microscoop dia van 1 ml gecombineerd reagentia zoals beschreven in paragraaf 4.2 om ervoor te zorgen dat alle reagentia zijn verstoken van virussen voordat u verder gaat.
- Voeg 9 g CsCl 45 ml van virale TFF concentraateen uiteindelijke dichtheid van 1,12 g / ml. Koel terwijl het opzetten van de CsCl stapgradiënt.
- Te beginnen met de 1,7 g / ml oplossing achtereenvolgens voeg 1 ml van elk opeenvolgend minder dichte fractie langzaam in elke buis met behulp van serologische pipetten. Markeer het niveau van elke individuele meniscus en ervoor te zorgen dat de pycnoclines tussen fracties niet worden verstoord. Voor meer details zie de metgezel papier (Lim et al. 2014).
- Met een serologische pipet belasting 7,5 ml van het monster in elk van 6 en centrifugeer bij ~ 83.000 xg, 4 ° C gedurende 2 uur.
- Zonder verstoring van de dichtheidsgradiënten lossen de rotor en doorboren de buis net onder de eerder gemarkeerde 1,5 g / ml dichtheid laag (figuur 5) met een 18 G naald op een spuit 3 ml. Tap 1,5 ml gezuiverd VLP en over te dragen aan een nieuwe microcentrifugebuis. Herhaal dit voor alle monsters.
- Voeg 0,2 volume chloroform aan de gezuiverde VLP's, meng krachtig, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Voeg 150 &# 181; l 10x DNAse buffer aan elke microcentrifugebuis.
- Spin bij 16.000 g gedurende 5 min, en het verzamelen van de waterige fase. Indien de chloroform niet aggregaat in de bodem van de microcentrifugebuis, voeg meer DNAse buffer, meng en herhaal.
- DNase I (eindconcentratie = 2,5 eenheden / ul) toe en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur, vervolgens inactiveren DNase-activiteit door incubatie bij 65 ° C gedurende 15 min.
- Los CsCl in zeewater oplossingen van 1,7 g / ml te bereiden, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml, 1,2 g / ml (geijkt door weging uit 1 ml oplossing). Filter elke fractie met 0,02 urn filter vóór gebruik.
- DNA Extraction van virusachtige deeltjes (VLP's)
- Gelijkmatig bundelen het gezuiverde VLP's van elk monster in twee schoongemaakt en geautoclaveerd Oak Ridge buizen.
- Voeg 0,1 volume 2 M Tris-HCl (pH 8,5) met 0,2 M EDTA, 0,01 volume 0,5 M EDTA, 1 volume van formamide, 10 pl glycogeen (10 mg / ml). Meng goed en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Verwijzend naar nieuwe volume, voeg 2 volumes 100% ethanol RT. Mengen en incuberen bij 4 ° C gedurende meer dan 30 min.
- Pellet DNA door het draaien van Oak Ridge buizen bij 17.200 xg gedurende 60 min bij 4 & #176; C.
- Verwijder het supernatant. Was de DNA pellet tweemaal met ijskoude 70% ethanol middels serologische pipetten.
- Verwijder alle ethanol (re-spinnen kort indien nodig), deksel en laat pellet aan de lucht drogen bij kamertemperatuur gedurende> 15 min.
- Resuspendeer de DNA pellet gedurende> 15 min in 567 pi 1X TE-buffer (pH 8,0). Breng de 567 ul geresuspendeerde DNA in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg 30 ul van 10% SDS (voorverwarmen bij 65 ° C vóór gebruik) en 3 pl proteinase K (20 ug / ml), meng en incubeer gedurende 1 uur bij 56 ° C.
- Voeg 100 ul van 5 M NaCl en meng. Voeg 80 ul voorverwarmde CTAB NaCl oplossing, vortex en incubeer gedurende 10 minuten bij 65 ° C.
- Voeg 0,2 delen volume chloroform, vortex, en draaien bij 16.000 xg gedurende 2 min. Breng supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg gelijk volume fenol chloroform iso- 25: 24: 1 oplossing, vortex mengen,en draaien bij 16.000 xg gedurende 2 min. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg gelijk volume chloroform, vortex, en draaien bij 16.000 xg gedurende 2 min. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg 0,7 volume isopropanol om de supernatantfractie en incuberen bij -20 ° C gedurende ten minste 30 min om DNA te precipiteren.
- Pellet de DNA door centrifugeren bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Pipetteer het supernatant en was de pellet twee keer met 500 ul ijskoude 70% ethanol.
- Spin bij 16.000 xg en verwijder de resterende ethanol uit de buis. Lucht Droog de pellet gedurende 15 min.
- Resuspendeer DNA pellet met 50 ui elutiebuffer (5 mM Tris, pH 7,5) of Tris-EDTA pH 8,0 gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Kwantificeren DNA met hooggevoelige fluorescentie gebaseerde assay.
- Zuiveren en concentreren faagdeeltjes (gemodificeerd van Thurber et al. 19)
Representative Results
Microscopie
Microscopie monsters kan en moet onmiddellijk worden geanalyseerd om te zorgen dat ze van de gewenste kwaliteit. Om overvloed en grootteverdeling van de bacteriële gemeenschap te meten, zullen DAPI- slides door epifluorescentiemicroscopie worden onderzocht (excitatie / emissie: 358/461 nm, zie McDole et al 2012). (Figuur 6A). Cel aantallen en afmetingen kunnen worden verzameld met behulp van imaging software (bv ImagePro of ImageJ). Van lengte en breedte afmetingen celvolumes (V) worden verkregen door de veronderstelling dat alle cellen de vorm van cilinders met halfronde doppen met de volgende formule:
V = π / 4 x w 2 (L - w / 3)
waarbij L de lengte en breedte w van elke cel 23,4. Microbiële biomassa kan dan worden geschat met behulp van eerder vastgestelde grootte-afhankelijke relaties for mariene microbiële gemeenschappen 24. Algemeen mariene bacteriën in lengte 0,1-4 urn, maar ga naar ~ 8 urn op sommige locaties.
Terwijl het filter (0,2 pm) gekleurd met DAPI laat alleen bacteriën, de filters gebruikt voor SYBR Gold vlek (0,02 urn) bevatten bacteriën en virussen. Meten van de overvloed van virussen volgt hetzelfde protocol als voor microben, maar een excitatie van 325-375 nm wordt gebruikt en de maximale emissie bij 537 nm (figuur 6B).
Om kwantitatieve gegevens te genereren moet het monstervolume worden aangepast afhankelijk van het virale overvloed in het oorspronkelijke monster. Het juiste volume te filteren is het best empirisch bepaald voor een bepaalde hoeveelheid water. Voorbeelden van microfoto met monsters met verschillende virale concentraties zijn aangegeven in figuur 7.
Resultaten van eerdere studies suggereren dat Virus te Microberatio (VMR) variëren in het algemeen van 1 tot 50 in aquatische systemen 25-29, en tussen 3 en 20, met gemiddeld ongeveer 6 in koraalriffen (Knowles ongepubliceerde gegevens).
Flowcytometrie
Naast de directe tellingen en grootte schatting van de microbiële gemeenschap, kan beoordeling van de verhouding van autotrofe tot heterotrofe bacteriën via stroomcytometrie verder geëxtraheerd uit de verzamelde monsters (voorbeeld flowcytometrie zoals gegeven in figuur 8). Om het totale aantal bacteriën cellen te bepalen worden monsters gekleurd met SYBR Green I en een fotovermenigvuldigerbuis met een 530/30 banddoorlaatfilter wordt gebruikt voor detectie. Een kanaal voor chlorofyl (back to back LP spiegels die in een waaier van 675-735 nm) en phycoerytherin (585/42 banddoorlaatfilter) wordt gebruikt om de overvloed aan autotrophs in ongekleurde monsters tellen. Om de overvloed aan heterotrofe microben, de autotrofe telt van de niet te bepalengebrandschilderde deel worden vervolgens afgetrokken van de-SYBR gekleurd totale telling (McDole et al., ingediend).
Virale Metagenomics
Virale metagenomica maakt gebruik van een cultuur-onafhankelijke moleculaire benadering van virale ecologie, met behulp van totale genomische sequentie-informatie naar de gemeenschap structuur en functie te bepalen. Metagenomics is onze kennis van de complexiteit en diversiteit van de virale gemeenschappen op lokaal 17 tot wereldwijde schaal 30. De recente ontwikkeling van een breed scala van bioinformatica tools voor het analyseren van virale metagenomic data is afgenomen computational knelpunten, waardoor een meer uitgebreid overzicht van de van de virosphere door de lens van metagenomica.
De hier gepresenteerde werkwijzen benadrukken de isolatie en verrijking van virale deeltjes uit zeewater met een combinatie van pre-filtratie met grote poriën nylon gaas om vuil en cellulair materiaal te verwijderen, concentratiemonsters met TFF (figuur 3) waarna 0,45 pm filtratie grotere cellen te verwijderen. Deze methode levert ongeveer een 100x geconcentreerde monster (figuur 5B-5E), die ons in staat stelt om downstream processen uit te voeren in kleinere volumes. Om de groei van resterende microbiële cellen voorkomen virale lysaat en derhalve wijzigingen in de virale overvloed van het monster tijdens de lange looptijd tussen veldstation en laboratorium chloroform wordt vaak toegevoegd tot een eindconcentratie van 2% voor opslag. Na isolatie en zuivering van VLP's, epifluorescentie microscopie met nucleïnezuur kleurstoffen zoals SYBR Gold worden gebruikt om de aanwezigheid en de zuiverheid van de virale deeltjes (figuren 5B-5E) controleren.
Hier presenteren we twee virale metagenomes uit de Zuidelijke Line Island koraalrif, in het bijzonder, de Starbuck (STAR7) en Millennium (CAR9; voorheen bekend als Caroline) eilanden. Een totaal volume van 120 L sample water vanuit elke plaats op een diepte van 10 meter en verwerkt zoals beschreven in paragraaf 3.7 en 5.2. De VLP gezuiverd van caesiumchlorideoplossing gradiëntcentrifugering waren 3,3 x 10 8 deeltjes / ml voor CAR9 (Figuur 5D) en 2,9 x 10 9 deeltjes per ml voor STAR7 als geverifieerd overeenkomstig de in paragraaf 4 (Figuur 5B) beschreven methode. Het totale bedrag van DNA geïsoleerd uit deze monsters waren ongeveer 400 ng op basis van de Nanodrop meting. DNA werd geamplificeerd met behulp Phi29 polymerase en de sequentie door de Environmental Genomics Core facility in 2011. De kenmerken van de sequentiegegevens wordt weergegeven in Tabel 1. Gebaseerd op similariteitsonderzoeken Bestaande databanken, de meerderheid (> 70%) van de sequenties vaak eindigden ongekarakteriseerde, dwz onbekende oorsprong en functies. Ook de twee viromes hier gepresenteerde gepresenteerde meer dan 97% van onbekende sequenties. Hierdoor non-databankafhankelijke analyse werd gebruikt voor analyse en opende een nieuwe arm van het onderzoek kans op het "donkere materie" in viral metagenomica (Seguritan et al. in press).
Microbiële Metagenomics
De analyse van microbiële metagenomes maakt de karakterisering van de microbiële gemeenschap heden en de functionele beschrijving van deze gemeenschappen. Voorbeelden hiervan zijn de ramingen van de aanwezigheid van ziekteverwekkers en virulentie 5,22 of vergelijkingen tussen veranderingen in macrobial gemeenschap structuur of beschikbare voedingsstoffen en overvloed van soorten en hun overheersende metabole routes (figuur 9; Kelly et al 2014.).
Water Chemie
Waterchemie parameters in het algemeen nemen uitgebreide analytische verwerking om de gewenste gegevens te genereren; monsters voor DOC-analyse zal worden gemeten via hoge temperatuur katalytische oxidatie 31,32, organisch materiaal (POM) via isotoop-ratio massaspectrometrie gekoppeld aan een elementaire analyser 33-35, en anorganische voedingsstoffen door Flow Injection Analysis 36,12,37. Na een succesvolle voltooiing van de analyses, informatie zoals getoond in Tabel 1 beschikbaar zijn voor de karakterisering van de microbiële en virale gemeenschappen vullen. Deze informatie kan worden aangevuld met een stabiele isotoop verhoudingen van organische koolstof en stikstof monsters (Zie Haas et al. 35) en de verhoudingen tussen autotrophs en heterotrofe (McDole et al., Ingediend).
Figuur 1. Overzicht van de methoden in de sectie protocol beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze Figu bekijkenre.
Figuur 2. Voorbeeld verwerking rig setup. De filtratie setup hier geïntroduceerd (schematische tekening links, werkelijke beeld rechter paneel) is niet per se nodig is om monsters te genereren, maar zal het proces aanzienlijk versnellen. De opstelling bestaat uit een achterplaat, waarop de Hatay Niskin eenheden (1) zijn gemonteerd. Op de uitlaat naar beneden gericht, zijn Hatay Niskin apparaten die met siliconen slang aan op de filter houders (2) in-line. Deze laat de bemonsterde water pas door de respectieve filter in de HDPE-sampling flacons (3) gemonteerd recht onder. Het filtratieproces wordt versneld door perslucht (4), die heeft ontvangen van een drukmeter (5). Een waterretentiebekken voorkomt morsen water tijdens de wisseling van de HDPE flacons of POM filtratie. Gelieveklik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. tangentiële stroming filter opstelling (gemodificeerd van Thurber et al. 19). Nylonweefsel gefiltreerde monster water wordt via een peristaltische pomp (2) gepompt vanuit het reservoir (1) een tangentiële stroming filter (3). Het monster water keert terug naar het reservoir (1) langs de retourleiding (4) bij het ontbreken van tegendruk. Wanneer tegendruk wordt via een slangklem (5) op de retourleiding, water door het filter en wordt weggegooid of geleverd aan het filtraat reservoir (6). Monster water wordt vervangen als het geconcentreerd uit het filtraat lijn totdat al het monster water is geconcentreerd in de slang lijnen.
Figuur 4. Microscoop dia filtratie setup.Gelijkmatig verdelen DAPI en SYBR Gold gekleurde monsters van de respectievelijke alumina matrix filter (1), moeten filters tussen de filter toren (2) en de steel van de filtratie verdeelstuk worden gebracht en vastgezet met een klem (4). Een druk gereguleerd vacuum (5) zal het filtratieproces (schematische tekening top, werkelijke beeld onderste paneel) te bespoedigen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Zuivering en concentratie van faagdeeltjes. Een totaal van 1 ml van elk gradiënt chloride dichtheid cesium gelaagd bovenop elkaar vóór leidt het voorbehandelde monster (A). Elke laag moet buiten de buis worden gemarkeerd om de extractie na ultracentrifuge vergemakkelijken. Rode pijl markeert waar de buis zal worden doorboord om exdarmkanaal de VLP fractie. (BE) microfoto van virale concentraten: Epifluorescentie microfoto van 0,45 urn gefiltreerd representatieve virale concentraten van STAR7 (B) en CAR9 (D). Grote deeltjes zoals bacteriële cellen zichtbaar waren van 0,45 urn filtraten van beide STAR7 (B) en CAR9 (D) monsters, terwijl alleen VLP (witte pijlen) achterblijven na cesium chloride gradiënt ultracentrifugatie; Star 7 (C) en CAR9 (E). Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Voorbeeld van DAPI en SYBR Gold microfoto analyse. Schermafbeelding uit de analyse van (A) en DAPI (B) SYBR Gold gekleurd slide voorbeeld. (A) Lengte en breedte (micrometer) van alle gemarkeerd deeltjes(= Microben) kan worden beoordeeld met behulp van een grafisch programma. Let op de aggregatie in het midden van het beeld. Deze clusters nodig van verdere analyse worden uitgesloten. (B) In analyse virussen en bacteriën moeten worden weggegooid door drempels in VLP and size ranges cellulaire (VLP rood, groen cellulair). Merk op dat er meestal een aantal vage VLP Uncategorized door de respectieve imaging programma. Deze VLP's die te zien zijn als vage witte stippen moeten handmatig worden geteld en toegevoegd aan de geautomatiseerde virale tellingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7. Concentraties van SYBR Goud gekleurd monsters. Micrografen van een 0,02 alumina matrix filter met verschillende aantallen SYBR gekleurd virus monsters. Panel A toont afilter die een geschikte hoeveelheid zeewater gefilterd, terwijl de concentraties op het filter weergegeven in B te hoog zijn en in C te laag voor betrouwbare tellingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8. Resultaten van flowcytometrie analyse uitgang van een rif watermonster. Paneel (A) toont moleculaire waterbehandeling alleen geelgroene fluorescerende microbolletjes (0.75 pm), die minimale achtergrond met de instrumentinstellingen controleren. Paneel (B) toont de uitvoer van het rif watermonster run met dezelfde instellingen en opmaak als in A. Merk op dat de korrels nog te zien op dezelfde locatie, samen met verscheidene populaties van autotrofen. (C) (B), die wordt gebruikt om een back-gate de flowcytometer, targeting SYBR positieve gebeurtenissen (autotrofe + heterotrofe telling) en het minimaliseren van de achtergrond. (D) De representatieve rif-water monster gekleurd met SYBR Green I. Met behulp van de in (C) opgericht gating, werden in totaal microbe tellingen gegenereerd, en heterotrofe en autotrofe microben gepartitioneerd door chlorofyl autofluorescentie (zie McDole et al. 4). Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9. Voorbeeld van microbiële metagenoom gegevens. Patronen tussen de microbiële metagenomic sequence data en locatie afhankelijke variabelen. Hier, de relatieve abundantie van Synechococcus Pelagibacter spp. niet (linker panelen). De metabole route voor conjugatieve overdracht was positief gecorreleerd met nitraatconcentraties, terwijl de metabole route voor herstel van DNA was consistent tussen alle metagenomes (rechter panelen). Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Star 7 | CAR9 | |
| Totaal Aantal Leest | 939311 | 591600 |
| Aantal voorbewerkte Leest | 579664 | 360246 |
| Bedoel Sequence Lengte (bp) | 395 ± 131 | 451 ± 159 |
| Geannoteerde Sequences (%) | 42.218 (7.3%) 9117 (2.5%) | |
| Unknown (%) | 537.446 (92,7%) | 351.129 (97,5%) |
Tabel 1. Gegevens kenmerken van twee viromes gegenereerd uit de Southern Line-eilanden, Starbuck en Millennium. De mate van annotatie is gebaseerd op BLAT behulp van de MG-RAST-server.
Tabel 2. Representatieve resultaten met gegevens van verschillende sites tijdens een expeditie. De hier ingeschatte parameters inclusief water chemie metingen gecombineerd met de microbiële en virale abundanties. De tabel bevat verder bestandsnamen verwijzen naar de respectieve metagenomic gegevens voor elke bemonstering locatie. Carbon en anorganische nutriëntenconcentraties worden gegeven in micromol / l. Gelieveklik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Discussion
De hier gepresenteerde methode zal een hulpmiddel om een uitgebreide beoordeling van de virale en bacteriële dynamiek in aquatische ecosystemen te genereren. Ze zijn gericht op de permanente voorraad van organische en anorganische middelen beschikbaar om microbiële gemeenschappen kwantificeren en de make-up van de virale en microbiële gemeenschap aanwezig te karakteriseren. Naast het kwantificeren van virale overvloed en microbiële abundantie en biomassa, genomische sequentie-informatie onthult hun gemeenschap structuur en functie. Alle methoden zijn ontwikkeld of aangepast om te zorgen voor de toepassing in afgelegen gebied locaties. Maar het ontbreken van gecontroleerde laboratorium instellingen creëert inherent een aantal potentiële fouten. Hier bespreken we enkele kanttekeningen bij elk van de parameters beoordeeld. Naast de mogelijkheid van contaminatie tijdens de sample handling enkele van de parameters ook potentiële opbrengst voor fouten in het analyseproces.
Opgeloste organische koolstof
Carbon besmetting optreedt tijdens de monsterneming procedures (bemonstering stroomafwaarts of in de nabijheid van een boot of duiker) tijdens de monstervoorbereiding (vervuiling van apparatuur of onbedoelde bediening), en ook tijdens de opslag van het monster (andere monsters vriezer organische oplosmiddelen / vluchtige stoffen). Om de verschillende bronnen van verontreiniging gedrag zo weinig behandelingsstappen mogelijk vermeden als elk monster verplaatsing vormt een extra bron van contaminatie. Het monster mag niet in contact komen met een item niet zuur gewassen of verbrand. Tenslotte aanwijzing van een opslag vriezer uitsluitend monsters vluchtige organische stoffen bevat zal de integriteit van de monsters te verzekeren gedurende langere opslagperioden. Indien monsters kunnen niet worden bevroren gedurende een langere vakantieperiode verzuring van DOC monsters met geconcentreerde HCl gehouden (zoals beschreven 38-41) kan een toepasselijke alternatief zijn. Om te controleren of de meetnauwkeurigheid DOC consensus referentiematerialen worden gebruikt regularly tijdens de DOC meting loopt. Vooral diepzee water (> 2.000 m) referenties zijn waardevol bij de beoordeling van de prestaties van de analytische machine want het is zeer stabiel in de DOC-inhoud 42.
Particulate Organic Matter
Naast het vermijden van organische koolstof vervuiling, POM bemonstering vereist speciale aandacht aan de nauwkeurigheid van de gefilterde volume waarborgen. Indien het doelvolume 500 ml mag afwijken op mogelijke reden dat dit moet worden gewezen op de hoeveelheid POM gevangen op het filter aan het filtraat waarvan het afkomstig betrekking.
Anorganische Nutriënten
Zoals met organische koolstof bemonstering, moet aandacht worden besteed aan mogelijke voedingsstoffen monster verontreiniging veroorzaakt door verschillende bronnen, zoals boten of lozingen van afvalwater 12. Filters gebruikt voor organische koolstof bemonstering met een nominale poriegrootte van 0,8 micrometer, mogelijk niet alle microbiële biomassa en sh sluitenould derhalve worden gewijzigd tot 0,2 pm filters voor deze filtratiestap. Verder detectielimieten een probleem met voedingsstof samples vormen; vooral in de oligotrofe oppervlaktewater rond veel koraalrif locaties (bv Cotner et al. 43). Detectielimieten zijn ruwweg rond 0,1, 0,2, en 0,1 micromol / l voor ammonium, nitraat en nitriet, en ortho-fosfaat respectievelijk (zie 36,12,37)
Microscopie
Naast verschillen in de concentratie van beeldbemonsteringen analyse van microscoopglaasjes verdere levert mogelijkheden voor fouten. Zo kan beelden onscherp zijn in sommige gebieden van het gezichtsveld, en in de focus in anderen. Als een zeer zuiver aluminiumoxide matrix filter is een zeer stijf filtertype kan vuil in het filter veroorzaken de gehele filter te zitten op een hoek aan de dia. Hierdoor kunnen beelden constant onscherp in verschillende delen van het gezichtsveld voor een gegeven filter, reONGEACHT microscoop alignment. Hermontage filters, zodat de onderzijde van het filter schoon is, kan dit verbeteren als het wordt waargenomen. Voorts kan in sommige gevallen kunnen er twee focale vlakken waarin virussen en bacteriën te vinden. Dit is het gevolg van gekleurde objecten worden losgemaakt van het filter bij montage en stijgt op naar de onderkant van het dekglas die tellingen onbetrouwbaar kan maken. Daarom is het altijd aan te raden om de kwaliteit van de monsters controleren tijdens het proces.
Flowcytometrie
Zoals bij de microscopie monsters, kunnen er natuurlijk voorkomende verschillen tussen flowcytometrie monsters die aanpassing van het analyseproces vereisen. Bijvoorbeeld, afhankelijk van de gevoeligheid van het instrument, kan slecht Prochlorococcus fluorescerende cellen onder het geluidsniveau en niet gekwantificeerd. Beads als interne controle monster (bijvoorbeeld om te bevestigen dat respectievelijk het instrumentonse om fluorescerende signalen is consistent van dag tot dag (en blijft stabiel tijdens de run zelf). Indien toegevoegd aan het monster bij bekende concentraties, kunnen ze ook dienen als een interne controle aan het monstervolume run te controleren. Het wordt echter aanbevolen om altijd een monster van een eerder bevroren "standaard" zeewater monster dat ontdooid en gekleurd met de monsters van belang een additionele biologische bestrijding voor monsterbehandeling tussen 96 putjes runs verschaffen draaien. Afhankelijk van de locatie kunnen zeewatermonsters er heel verschillend van elkaar. Sorteren "vertegenwoordiger" populatie en vervolgens het bekijken onder een microscoop epifluorescerende (EM) kan een goede manier om snel fytoplanktonpopulaties Controleert als ofwel Synechococcus sp. Of fotosynthetische eukaryoten zijn. Prochlorococcus cellen zijn meestal niet zichtbaar onder EM omdat ze vervagen te snel. Naast een, Synechococcus sp chlorofyl. Ook ph bevattenotopigment phycoeurythrin (PE), die licht uitzendt op kortere golflengten (540-630 nm) dan chlorofyl A (660-700 nm). Wanneer Synechococcus cellen worden opgewekt met blauw / groen licht (470-490 nm), zullen ze gouden weergegeven als het wordt bekeken bij een emissie filter dat alle golflengten van het licht onder 510 nm verwijdert. Ter vergelijking, zal de eukaryotische fractie rood uitzien, toen enthousiast met dezelfde golflengte van het licht.
Virale Metagenomics
Het is belangrijk op te merken dat het proces van VLP concentratie en opslag beïnvloedt de gemeenschap hersteld. Virusdeeltje verlies kan optreden bij elke stap in het proces, en dus kan de keuze van virale zuivering en verrijkingsprotocollen uiteindelijk laat de waargenomen taxonomische samenstelling en diversiteit van de resulterende virale metagenomes 44,45,18. Concentratie van de monsters kan worden gedaan met behulp van TFF 19 of chemische basis flocculatie 20. In de chemische-gebaseerde benadering, ponerentend geladen ijzerionen binden de van nature negatief geladen virale deeltjes die grote (> 8 micrometer) ijzer-virale complexen die vlokken uit de oplossing en kan worden hersteld met behulp van 8 urn filters. Vervolgens wordt het ijzer gecheleerd uit de virale deeltjes en opnieuw opgelost met magnesium, ascorbinezuur, en EDTA, waardoor geconcentreerde virale deeltjes nucleïnezuurextractie 20. Na deze twee huidige methoden te vergelijken, hebben we geconcludeerd dat de ijzerchloride methode is minder tijdrovend dan TFF virale concentratie, maar kan wel enkele voorwaarden opleveren. We vonden dat dissociatie en oplossen van de ijzer-virus vereist twee maal meer geconcentreerd magnesium-ascorbinezuur-EDTA dan gerapporteerd 20 om ontbinding te gaan voordat het ascorbinezuur degradeert. Afgezien van dit probleem, het protocol zuivert virale deeltjes per grootte-fractionering alleen, het verwijderen van microbiële verontreinigingen met behulp van 0,2 um filtratie. Grote virussen niet door het filter (bijvoorbeeld Yang et al. 46) en zal dus niet worden gedetecteerd in het metagenoom, terwijl sommige Bacteriën (McDole, ongepubliceerde gegevens). Dit resulteert in een bacteriële besmetting terwijl discrimineren grote virussen.
Deze specifieke probleem is echter ook relevant voor de verwijdering van de microben in het kader van TFF-concentratie. Aangezien het chloroform behandeling is aangetoond chloroform-gevoelige virussen schaffen externe lipidemembranen 47 sommige studies suggereren dat 0,22 urn filtratie kan worden gebruikt om de meerderheid van de bacteriën te verwijderen. Voorts zij opgemerkt dat de gepresenteerde methode vooral gericht bacteriofaag, de meest voorkomende drager van genetisch materiaal in mariene omgevingen. Omdat faag algemeen gedacht geen lipiden bevatten gewoonlijk 48 ze resistenter tegen chloroform behandeling. Voor zover wij weten een "catch-all" methode niet bestaat tot op heden. De hier gepresenteerde methode is een bewerking van our veldervaring in de afgelopen 10 jaar in diverse maritieme omgevingen verspreid over tropische tot arctische systemen.
Microbiële Metagenomics
De constructie van metagenomic bibliotheken voor microben (bijvoorbeeld, bacteriën en archaea) is eenvoudiger dan virale metagenomes aangezien het gemakkelijker is om de minimale DNA concentraties vereist voor bibliotheek bereiding genereren. Linker amplificatie shotgun bibliotheken (LASLs) 17,49,50 en gehele genoom amplificatie gebaseerd op meerdere verplaatsing amplificatie (MDA) zijn de twee meest gebruikte methoden voldoende DNA voor sequentiebepaling te genereren. Het gebruik van MDA hogere DNA- concentraties in microbiële metagenomes verkrijgen soms noodzakelijk. Dit kan echter artefacten in de reeks gegevens, zoals de oversturing van dinoflagellaten minicircles veroorzaken. MDA methoden bekend om bij voorkeur amplificeren enkelstrengs en circulair DNA, resulterend in niet-kwantitatieve resultaten 51,52. De geoptimaliseerde LASLs benaderen 50 kan dus dient als een beter alternatief in het versterken van zowel de microbiële en virale metagenomic DNA voor sequencing. Het is belangrijk op te merken dat de LASLs benadering meerdere stappen vereist geavanceerde apparatuur, en is beperkt tot dsDNA templates. Verder is het weefsel DNA extractie kit aangetoond dat DNA extraheren van zowel Gram positieve en Gram negatieve phyla, maar niet is geverifieerd effectief lyse recalcitrant microbiële taxa of hun geassocieerde structuren (bijvoorbeeld bepaalde archaea, endospores of schimmelsporen) . Dus een kraal kloppend stap kan nodig zijn om DNA te verkrijgen van bepaalde microben.
Deze uitgebreide assessments zal leiden tot een beter begrip van virale en microbiële ecosystemen. Hoewel er weinig studies de inspanning om alle voorgestelde parameters evalueren hebben ondernomen, hebben veel onderzoek gedaan naar geselecteerden. Nelson et al. 53 stelde een verbinding tussENL specifieke rif habitats en depletions in zowel DOC en bacterioplankton concentraties ten opzichte van de offshore wateren. Deze concentratie veranderingen werden vergezeld door verschillende differentiaties van bacterioplankton gemeenschappen. Dinsdale et al. 5 bleek dat verhoogde antropogene effect gepaard met 10x hogere dichtheden van microbiële cellen en virusachtige deeltjes. Microbiële gemeenschappen in mariene wateren rond bewoonde eilanden had ook grotere fracties van heterotrofen en potentiële ziekteverwekkers 5. Tenslotte McDole et al. 4 toonde, door de invoering van de microbialization score, dat menselijke activiteiten verschuiven energie om de microben, ten koste van de macrobes. Deze studies, gericht op specifieke microbiële en chemische eigenschappen van water parameters, bieden nieuwe inzichten in de biochemische structuur van mariene ecosystemen. De combinatie van traditionele data van ecosysteemmonitoring inspanningen - zoals temperatuur en pH-waarden, vis biomassa en diversity, benthische cover, of blootstelling aan menselijke invloed - met water chemie en microbiële assessments, zal waarschijnlijk resulteren in meer gevoelige milieu-monitoring inspanningen, wat kan leiden tot meer specifiek gerichte pogingen tot instandhouding.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) | Figure 1 | ||
| Filtration setup | Figure 1 | ||
| 32-36% Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Sci | A508-212 | |
| High-density polyethylene (HDPE) container | e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid | ||
| Combustion oven (550 °C) | |||
| 60 ml HDPE vials | Fisher Sci | 02-896-2B | |
| 25 mm GF/F filter | Fisher Sci | 09-874-64 | |
| Forceps | Fisher Sci | XX62-000-06 | |
| Sterile, non-powdered gloves | Fisher Sci | 19-170-010B | |
| Bilge pump | e.g., Thirsty Mate 124PF | ||
| 20 L collapsible low-density polyethylene carboy | e.g., Reliance Fold A Carrier II | ||
| Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges | Amersham | CFP-2-E-9A | |
| Platinum-cured silicon tubing for TFF | Cole Parmer | 96440-82 | |
| Hose clamps | Cole Parmer | P-68007-23 | |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | EW-77410-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | Electron Microscopy Sciences | 21162 | |
| 0.2 µm Polycarbonate track-etched membrane filter | Fisher Sci | 09-300-61 | |
| 8.0 µm Polycarbonate track-etched membrane filter | Fisher Sci | 09-300-57 | |
| 0.22 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVGP01050 | |
| 0.45 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVHV010RS | |
| Synthetic nylon mesh | Sefar | 03-125-37 | |
| 20 ml Plastic scintillation bottle | Fisher Sci | 03-341-72C | |
| Clean bucket (10-20 L) | |||
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15714 | |
| 25% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16220 | |
| Liquid nitrogen | |||
| 0.02 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6002 | |
| 0.2 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6022 | |
| 10,000x SYBR Gold nucleic acid stain | Invitrogen | S11494 | |
| DAPI solution 25 µg/ml | Invitrogen | D1306 | |
| Molecular grade water | sigma aldrich | W-4502 | |
| Ascorbic acid | Fisher Sci | BP351-500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Sci | BP399-500 | |
| Glycerol | Fisher Sci | G31-500 | |
| Microscope slide | Fisher Sci | 12-550-123 | |
| Coverslip | Fisher Sci | 12-548-5M | |
| Delicate task wipe | Fisher Sci | 06-666A | |
| Slide station with vacuum pump | Figure 3 | ||
| DNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.1 | Nucleospin tissue kit |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Lifetechnologies | AM2546 | |
| 200-proof Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15058 | |
| Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | EW-45503-88 | |
| Cesium chloride (CsCl) | Fisher Sci | bp1595-500 | |
| 60 ml Syringe | Fisher Sci | 13-6898 | |
| 0.02 µm Alumina matrix disposable syringe filter | Fisher Sci | O992613 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 333790 | SW41 Ti Rotor |
| DNase I (100 units/µl) | Calbiochem | 260913 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher Sci | BP2482-500 | |
| Formamide | Fisher Sci | BP228-100 | |
| Glycogen | sigma aldrich | G-1767 | |
| 1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0 | Fisher Sci | BP2473-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Sci | 02674-25 | |
| 20 μg/ml Proteinase K | Fisher Sci | BP1700-500 | |
| Chloroform | Fisher Sci | BP1145-1 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | sigma aldrich | p3803 | |
| Isopropanol | Fisher Sci | BP2618-500 | |
| 50 ml Oak Ridge tube | Fisher Sci | 05-562-16B |
References
- Fuhrman, J. A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects. Nature. 399 (6736), 541-548 (1999).
- Azam, F., Malfatti, F.
- Huber, J. A., et al. Microbial population structures in the deep marine biosphere. Science. 318 (5847), 97-100 (2007).
- McDole, T., et al. Assessing coral reefs on a Pacific-wide scale using the microbialization score. PloS ONE. 7 (9), (2012).
- Dinsdale, E. A., et al. Microbial ecology of four coral atolls in the Northern Line Islands. PloS ONE. 3 (2), (2008).
- Nelson, C. E., et al. Coral and macroalgal exudates vary in neutral sugar composition and differentially enrich reef bacterioplankton lineages. The ISME Journal. 7 (5), 962-979 (2013).
- Haas, A. F., et al. Influence of coral and algal exudates on microbially mediated reef metabolism. PeerJ. 1, (2013).
- Smith, J. E., et al. Indirect effects of algae on coral: algae‐mediated, microbe‐induced coral mortality. Ecology Letters. 9 (7), 835-845 (2006).
- Burdige, D. J., Martens, C. S. Biogeochemical cycling in an organic-rich coastal marine basin: 10. The role of amino acids in sedimentary carbon and nitrogen cycling. Geochimica et Cosmochimica Acta. 52 (6), 1571-1584 (1988).
- Capone, D. G., Kiene, R. P. Comparison of microbial dynamics in marine and freshwater sediments: Contrasts in anaerobic carbon catabolism. Limnology and Oceanography. 33 (4), 725-749 (1988).
- Krom, M. D., Sholkovitz, E. R. Nature and reactions of dissolved organic matter in the interstitial waters of marine sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 41 (11), 1565-1574 (1977).
- Grasshoff, K. Methods of sea-water analysis. Verlag Chemie. , Weinheim and New York. (1976).
- Strickland, J. D.
- Sharp, J. H., et al. Analyses of dissolved organic carbon in seawater: the JGOFS EqPac methods comparison. Marine Chemistry. 48 (2), 91-108 (1995).
- DeLong, E. F. Microbial population genomics and ecology. Current Opinion in Microbiology. 5 (5), 520-524 (2002).
- Hugenholz, P., Goebel, B. M., Pace, N. R. Impact of Culture-Independent Studies on the Emerging Phylogenetic View of Bacterial Diversity. Journal of Bacteriology. 180 (18), 4765-4774 (1998).
- Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
- Willner, D., Hugenholtz, P. From deep sequencing to viral tagging: Recent advances in viral metagenomics. BioEssays. 35, 436-442 (2013).
- Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4, 470-483 (2009).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environmental Microbiology Reports. 3, 195-202 (2011).
- Lim, Y. W., et al. The Microbiome and Virome of CF. Pediatric Pulmonology. 47, 321-322 (2012).
- Kelly, L. W., et al. Black reefs: iron-induced phase shifts on coral reefs. The ISME Journal. 6 (3), 638-649 (2012).
- Bjornsen, P. K. Automatic determination of bacterioplankton biomass by image analysis. Applied Environmental Microbiology. 51, 1199 (1986).
- Simon, M., Azam, F. Protein content and protein synthesis rates of planktonic marine bacteria. Marine Ecology Progress Series. 51 (3), 201-213 (1989).
- Hara, S., Koike, I., Terauchi, K., Kamiya, H., Tanoue, E. Abundance of viruses in deep oceanic waters. Marine Ecology Progress Series. 145 (1), 269-277 (1996).
- Wommack, K. E., Colwell, R. R.
- Weinbauer, M. G., Brettar, I., Hofle, M. G. Lysogeny and virus-induced mortality of bacterioplankton in surface, deep, and anoxic marine waters. Limnology and Oceanography. 48 (4), 1457-1465 (2003).
- Clasen, J. L., Brigden, S. M., Payet, J. P., Suttle, C. A. Evidence that viral abundance across oceans and lakes is driven by different biological factors. Freshwater Biology. 53 (6), 1090-1100 (2008).
- Parada, V., Baudoux, A. C., Sintes, E., Weinbauer, M. G., Herndl, G. J. Dynamics and diversity of newly produced virioplankton in the North Sea. The ISME Journal. 2 (9), 924-936 (2008).
- Angly, F. E., et al. The marine viromes of four oceanic regions. PLoS Biology. 4 (11), (2006).
- Hansell, D. A., Carlson, C. A. Deep ocean gradients in dissolved organic carbon concentrations. Nature. 263 (266), (1998).
- Carlson, C. A., et al. Dissolved organic carbon export and subsequent remineralization in the mesopelagic and bathypelagic realms of the North Atlantic basin. Deep Sea Research Part II: Topical Studies in Oceanography. 57 (16), 1433-1445 (2010).
- Sharp, J. H. Improved analysis for particulate organic carbon and nitrogen from seawater. Limnology and Oceanography. 19 (6), 984-989 (1974).
- Ehrhardt, M., Koeve, W. Determination of particulate organic carbon and nitrogen. Methods of Seawater Analysis. Third Edition, 437-444 (2007).
- Haas, A. F., et al. Organic matter release by coral reef associated benthic algae in the Northern Red Sea. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 389 (1), 53-60 (2010).
- Guildford, S. J., Hecky, R. E. Total nitrogen, total phosphorus, and nutrient limitation in lakes and oceans: Is there a common relationship. Limnology and Oceanography. 45 (6), 1213-1223 (2000).
- Allison, S. D., Chao, Y., Farrara, J. D., Hatosy, S., Martiny, A. C. Fine-scale temporal variation in marine extracellular enzymes of coastal southern California. Frontiers in Microbiology. 3, (2012).
- Van Duyl, F. C., Gast, G. J. Linkage of small-scale spatial variations in DOC, inorganic nutrients and bacterioplankton growth with different coral reef water types. Aquatic Microbial Ecology. 24 (1), 17-26 (2001).
- De Goeij, J. M., Van Duyl, F. C. Coral cavities are sinks of dissolved organic carbon (DOC). Limnology and Oceanography. 52 (6), 2608-2617 (2007).
- De Goeij, J. M., et al. Major bulk dissolved organic carbon (DOC) removal by encrusting coral reef cavity sponges. Marine Ecology Progress Series. 357, 139-151 (2008).
- Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), (2014).
- Carlson, C. A., Ducklow, H. W., Hansel, D. A. Organic carbon partitioning during spring phytoplankton blooms in the Ross Sea polynya and the Sargasso Sea. Oceanography. 43 (3), 375-386 (1998).
- Cotner, J. B., et al. Nutrient limitation of heterotrophic bacteria in Florida Bay. Estuaries. 23 (5), 611-620 (2000).
- Willner, D., et al. Metagenomic detection of phage-encoded platelet-binding factors in the human oral cavity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (1), 4547-4553 (2011).
- Hall, R. J., et al. Evaluation of rapid and simple techniques for the enrichment of viruses prior to metagenomic virus discovery. Journal of Virological Methods. 195, 194-204 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Nanoporous membranes with ultrahigh selectivity and flux for the filtration of viruses. Advanced Materials. 18 (6), 709-712 (2006).
- Feldman, H. A., Wang, S. S. Sensitivity of various viruses to chloroform. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 736-738 (1961).
- Ackermann, H. W. The Bacteriophages., Second Edition. Calendar, R. , Oxford University Press. New York. 8-16 (2006).
- Henn, M. R., et al. Analysis of High-Throughput Sequencing and Annotation Strategies for Phage Genomes. PLoS ONE. 5 (2), (2010).
- Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14 (9), 2526-2537 (2012).
- Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nature Methods. 7 (12), 943-944 (2010).
- Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification Methods Bias Metagenomic Libraries of Uncultured Single-Stranded and Double-Stranded DNA Viruses. Applied Environmental Microbiology. 77 (21), 7663-7668 (2011).
- Nelson, C. E., Alldredge, A. L., McCliment, E. A., Amaral-Zettler, L. A., Carlson, C. A. Depleted dissolved organic carbon and distinct bacterial communities in the water column of a rapid-flushing coral reef ecosystem. The ISME Journal. 5 (8), 1374-1387 (2011).
- Kelly, L. W., et al. Local genomic adaptation of coral reef-associated microbiomes to gradients of natural variability and anthropogenic stressors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (28), 10227-10232 (2014).
- Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. , (2014).
