Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.
यहाँ हम दूरस्थ समुद्री वातावरण में उपयोग के लिए अनुकूलित अच्छी तरह से जांच और अच्छी तरह से मानकीकृत अनुसंधान प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला शुरू. नमूना प्रोटोकॉल माइक्रोबियल समुदाय (भंग कार्बनिक कार्बन कण कार्बनिक पदार्थ, अकार्बनिक पोषक तत्वों) के लिए उपलब्ध संसाधनों का आकलन, और प्रत्यक्ष वायरल और माइक्रोबियल मायने रखता है के माध्यम से वायरल और बैक्टीरियल समुदायों के लिए एक व्यापक वर्णन (autofluorescent रोगाणुओं की गणना में शामिल हैं, और वायरल और माइक्रोबियल metagenomes का निर्माण). हम पहले से ही स्थापित प्रोटोकॉल और विकसित सबसे हाल ही में तकनीक के कुछ शामिल वैज्ञानिक विषयों की एक छितरी क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं जो तरीकों का एक संयोजन का उपयोग करें. वायरल और बैक्टीरियल समुदाय लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल खास तौर पर metagenomic अनुक्रमण तकनीक, केवल हाल के वर्षों में स्थापित किया गया है, और इस प्रकार अभी भी निरंतर सुधार के अधीन हैं. यह नमूना और नमूना प्रसंस्करण प्रक्रिया कुरेन की एक किस्म के लिए प्रेरित कियाtly उपयोग में. यहाँ प्रस्तुत तरीकों का सेट इकट्ठा करने और पर्यावरण के नमूने पर कार्रवाई करने की तारीख दृष्टिकोण के लिए ऊपर एक प्रदान करता है. इन प्रोटोकॉल के साथ संबोधित पैरामीटर विशेषताएँ और वायरल और माइक्रोबियल समुदाय गतिशीलता के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए आवश्यक जानकारी पर न्यूनतम उपज. यह व्यापक सर्वेक्षण करने के लिए दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए आसान कर देता है और प्रत्येक तकनीक के लिए प्रासंगिक महत्वपूर्ण कदम है और संभावित निरंतर चर्चा.
समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों सुप्रीम शिकारियों की बायोमास के लिए पोषक तत्वों की उपलब्धता में किए गए बदलाव में परिणाम है कि perturbations की एक विस्तृत श्रृंखला के अधीन हैं. पिछले दशक के दौरान, कई अध्ययनों से समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों 1-4 में माइक्रोबियल समुदायों के महत्व का प्रदर्शन किया है. यह बैक्टीरियल और वायरल समुदाय में परिवर्तन बारीकी से समुद्री वातावरण 5 के समग्र गिरावट के साथ जुड़े रहे हैं कि स्पष्ट है. ये बदलाव ऐसे ऑक्सीजन की उपलब्धता या कार्बन पुनर्खनिजीकरण 6,7 के रूप में पानी स्तंभ में बदल बॉयोमेट्रिक्स द्वारा मदद की जा सकती है. Macroorganisms, पानी रसायन शास्त्र और माइक्रोबियल गतिविधि प्रतिक्रिया छोरों के बीच परस्पर निर्भरता का एक परिणाम के रूप में पारिस्थितिकी तंत्र गिरावट 8 की दर तेज हो सकती है.
1970 और 80 के दशक में कई प्रयास समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों 9-11 में biogeochemical चक्र को जानने के लिए किए गए थे. इन प्रारंभिक अध्ययन के लिए मुख्य चुनौतियों में से एक कमी थीमानकीकृत दृष्टिकोण का आकलन किया biogeochemical मापदंडों को मापने के लिए. मुख्य रूप से समुद्री जल पोषक तत्वों 12,13 पर उपलब्ध प्रोटोकॉल, वहाँ थे हालांकि, कार्बन गतिशीलता के आकलन और माइक्रोबियल समुदाय संरचना उपलब्ध साधनों और तरीकों से सीमित थे. JGOFS EqPac तरीकों तुलना के साथ, तीव्र एट अल. 14 पहली बार भंग कार्बनिक कार्बन (डॉक्टर) एकाग्रता के मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय और मानकीकृत प्रोटोकॉल के लिए सुझाव दिया. 2000 के दशक तक विश्लेषणात्मक चुनौतियों इस प्रकार काफी हद तक हल हो चुका था माइक्रोबियल समुदाय के लिए उपलब्ध संसाधनों का निर्धारण और (डीलॉन्ग 15 देखें) स्थापित किया गया था नियंत्रित संस्कृति के वातावरण में सूक्ष्म समुदायों विशेषताएँ दृष्टिकोण को. उस समय पारंपरिक अनुक्रमण तरीकों बड़े पैमाने पर खेती की जाती प्रतिरूप संस्कृतियों पर आधारित है. प्राकृतिक नमूनों की प्रारंभिक पर्यावरण जीन अनुक्रमण माइक्रोबियल जैव विविधता के बहुमत cultiv से याद किया गया था कि, हालांकि, पता चलाव्यावहारिक आधारित विधियों 16. 2002 में, Breitbart एट अल. 17 असभ्य समुद्री वायरल समुदायों के पूरे जीनोम अनुक्रम के लिए एक विधि की स्थापना पर्यावरण समुद्री पानी के नमूनों में वायरल समुदाय का वर्णन करने के लिए पहली बार बन्दूक अनुक्रमण इस्तेमाल किया.
सबसे संस्कृति को मुश्किल कर रहे हैं के रूप में मौजूदा सूक्ष्म आकलन के भीतर, वायरस अभी भी, विशेष रूप से नीचे से अध्ययन किया रहते हैं और वे ऐसी 16S ribosomal शाही सेना (rRNA) आम तौर पर विविधता और समुदाय की रूपरेखा का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जीनों के रूप में एक सार्वभौमिक संरक्षित मार्कर की कमी है. metagenomic अनुक्रमण दृष्टिकोण जटिल वायरल समुदायों का विश्लेषण करने के लिए संस्कृति पर निर्भर है और जीन-लक्षित तरीकों के लिए एक विकल्प प्रदान करता है. समुद्री जल से उत्पन्न प्रथम वायरल metagenomes सेंगर अनुक्रमण 17 का उपयोग अनुक्रम थे, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों और बेहतर आणविक तकनीक का विकास metagenomic पढ़ाई 18 में तेजी से वृद्धि हुई है </s> ऊपर. वायरल metagenomics के लिए वर्तमान प्रयोगशाला कार्यप्रवाह न्यूक्लिक एसिड (डीएनए या आरएनए) निष्कर्षण, पुस्तकालय तैयारी, और अनुक्रमण 19-21 से पीछा वायरल कणों की जुदाई, संवर्धन, और / या एकाग्रता, शामिल है.
दुनिया आवश्यक है चारों ओर विभिन्न प्रणालियों में डेटा सेट की तुलना, जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में वायरल, सूक्ष्म और जैव रासायनिक कामकाज पर मौजूदा ज्ञान और आगे के लिए. हालांकि, स्थापित प्रोटोकॉल काफी हद तक सहज सुलभ प्रयोगशाला सुविधाओं के साथ लगभग शोर वातावरण के लिए विकसित किया गया है. इस प्रकार, मानकीकृत क्षेत्र तरीकों की कमी इन पार पारिस्थितिकी तंत्र तुलना hinders. यहाँ हम अच्छी तरह से जांच शुरू करने और अच्छी तरह से दूरदराज के क्षेत्र के स्थानों में उपयोग के लिए कला अनुसंधान प्रोटोकॉल का राज्य से रूपांतरों मानकीकृत. इन तरीकों पिछले दशक 5,22 फैले कई अध्ययनों में सफल सिद्ध किया गया है और वर्तमान में एनओएए पर साथ ही साथ विभिन्न समुद्री प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया जाता हैरीफ आकलन और प्रशांत महासागर 4 भर निगरानी कार्यक्रम (रैंप). नमूना प्रोटोकॉल पानी रसायन शास्त्र मानकों (अकार्बनिक और कार्बनिक कार्बन सांद्रता, अकार्बनिक पोषक एकाग्रता), वायरल और माइक्रोबियल बहुतायत में शामिल (प्रत्यक्ष बैक्टीरियल मायने रखता है, प्रत्यक्ष वायरल मायने रखता है, और परपोषी अनुपात बनाम स्वपोषी का आकलन करने के लिए प्रवाह cytometry), और वायरल और माइक्रोबियल समुदाय संरचना और metagenomic विश्लेषण के माध्यम से चयापचय क्षमता (एक सिंहावलोकन के लिए चित्रा 1 देखें). यहाँ वर्णित तरीकों से प्राप्त परिणामों के व्यापक जलीय पारितंत्र को चिह्नित करने के लिए आवश्यक कुंजी biogeochemical पृष्ठभूमि मापदंडों को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक हैं.
यहाँ प्रस्तुत तरीकों जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में वायरल और माइक्रोबियल गतिशीलता की एक व्यापक मूल्यांकन उत्पन्न करने के लिए एक उपकरण प्रदान करेगा. वे माइक्रोबियल समुदायों के लिए उपलब्ध कार्बनिक और अकार्बनिक संसाधनों के खड़े शेयर यों और वायरल और माइक्रोबियल समुदाय वर्तमान का श्रृंगार चिह्नित करने के लिए लक्षित कर रहे हैं. अगला वायरल बहुतायत और माइक्रोबियल बहुतायत और बायोमास बढ़ाता, जीनोमिक अनुक्रम जानकारी उनके समुदाय संरचना और समारोह का पता चलता है. सभी तरीके विकसित या दूरदराज के क्षेत्र के स्थानों में आवेदन के लिए अनुमति देने के लिए संशोधित किया गया है. हालांकि नियंत्रित प्रयोगशाला सेटिंग की कमी स्वाभाविक त्रुटियों के लिए कुछ संभावित बनाता है. यहाँ हम आकलन किया मापदंडों में से प्रत्येक के साथ जुड़े कुछ निरंतर चर्चा की. अगला संदूषण के लिए क्षमता के लिए नमूना दौरान भी विश्लेषणात्मक प्रक्रिया में त्रुटि के लिए संभावित उपज मापदंडों में से कुछ से निपटने.
भंग कार्बनिक कार्बन
कार्बन संदूषण (बहाव के नमूने, या एक नाव या गोताखोर के आसपास के क्षेत्र में), नमूना तैयार करने के दौरान (उपकरण या अनजाने से निपटने के प्रदूषण), और यहां तक कि नमूने के भंडारण के दौरान (अन्य नमूने फ्रीजर में जैविक युक्त नमूना प्रक्रिया के दौरान हो सकता है सॉल्वैंट्स / वाष्पशील). प्रत्येक नमूने स्थानांतरण संदूषण का एक अतिरिक्त स्रोत बन गया है, के रूप में संभव के रूप में कुछ से निपटने के कदम के रूप में संदूषण आचरण की विभिन्न स्रोतों से बचने के लिए. नमूना नहीं एसिड धोया या combusted किसी भी वस्तु के संपर्क में नहीं होना चाहिए. अंत में, वाष्पशील कार्बनिक पदार्थों से युक्त नहीं नमूने के लिए विशेष रूप से एक भंडारण फ्रीजर designating अब भंडारण अवधि के दौरान नमूनों की अखंडता को सुनिश्चित करेगा. नमूने केंद्रित एचसीएल के साथ डॉक्टर के नमूने की एक विस्तारित यात्रा अवधि अम्लीकरण के दौरान जमी नहीं रखा जा सकता है (38-41 वर्णित) एक लागू विकल्प हो सकता है. माप सटीकता डॉक्टर आम सहमति संदर्भ सामग्री reg इस्तेमाल किया जाना चाहिए सत्यापित करने के लिएडॉक्टर माप दौरान ularly चलाता है. यह अपने डॉक्टर सामग्री 42 में बहुत स्थिर है के रूप में विशेष रूप से गहरे समुद्र में पानी (> 2,000 मीटर) संदर्भ विश्लेषणात्मक मशीन के प्रदर्शन का आकलन करने में मूल्यवान हैं.
पार्टिकुलेट कार्बनिक पदार्थ
जैविक कार्बन संदूषण से परहेज करने के अलावा, पोम नमूना फ़िल्टर की मात्रा की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है. 500 मिलीलीटर की लक्षित मात्रा किसी भी संभावित कारण हटना चाहिए तो यह बात निकाली थी जिसमें से छानना करने के लिए फिल्टर पर कब्जा कर लिया पोम की राशि संबंधित करने के लिए ध्यान दिया जाना चाहिए.
अकार्बनिक पोषक तत्वों
जैविक कार्बन नमूने के साथ के रूप में, ध्यान नावों या अपशिष्ट निर्वहन 12 जैसे विभिन्न स्रोतों से उत्पन्न संभव पोषक नमूना संदूषण के लिए भुगतान किया जाना चाहिए. 0.8 माइक्रोन का एक नाममात्र ताकना आकार के साथ कार्बनिक कार्बन नमूना लेने के लिए इस्तेमाल किया फिल्टर, सभी माइक्रोबियल बायोमास और श बाहर नहीं हो सकताould इसलिए इस निस्पंदन कदम के लिए 0.2 माइक्रोन फिल्टर करने के लिए परिवर्तित किया जाना. इसके अलावा, पता लगाने सीमा पोषक नमूनों के साथ एक समस्या खड़ी; विशेष रूप से कई मूँगे की चट्टान स्थानों (जैसे, Cotner एट अल. 43) के आसपास oligotrophic सतह पानी में. पता लगाने सीमा मोटे तौर पर लगभग 0.1, 0.2, और अमोनियम नाइट्रेट और नाइट्राइट, और ऑर्थो-फॉस्फेट के लिए 0.1 μmol / एल क्रमशः (36,12,37 देखें) कर रहे हैं
माइक्रोस्कोपी
माइक्रोस्कोपी स्लाइड से नमूने छवि विश्लेषण की एकाग्रता में बदलाव के अलावा आगे त्रुटियों के लिए संभावित पैदावार. उदाहरण के लिए, छवियों को देखने के क्षेत्र के कुछ क्षेत्रों में ध्यान से बाहर हो सकता है और दूसरों में ध्यान केंद्रित करने में कर सकते हैं. एक उच्च शुद्धता एल्यूमिना मैट्रिक्स फिल्टर एक बहुत कठोर फिल्टर प्रकार है, फिल्टर के तहत किसी भी मलबे पूरे फिल्टर स्लाइड करने के लिए एक कोण पर बैठने के कारण हो सकता है. नतीजतन, छवियों फिर से, किसी दिए गए फिल्टर के लिए देखने के क्षेत्र के विभिन्न भागों में ध्यान से बाहर लगातार हो सकता हैखुर्दबीन संरेखण के gardless. यह देखा गया है कि अगर फिल्टर के नीचे सुनिश्चित करने, फिल्टर remounting साफ है, इस उन्नति कर सकते हैं. इसके अलावा, कुछ मामलों में वायरस और रोगाणुओं पाया जा सकता है जिसमें दो फोकल विमानों हो सकता है. इस बढ़ते पर फिल्टर से अलग होता जा रहा है, और मायने रखता है अविश्वसनीय बना सकते हैं जो कवर पर्ची के नीचे करने के लिए ऊपर चल दाग वस्तुओं का परिणाम है. इसलिए यह हमेशा की प्रक्रिया के दौरान नमूनों की गुणवत्ता की जांच करने के लिए सिफारिश की है.
फ्लो
माइक्रोस्कोपी नमूनों के साथ के रूप में, स्वाभाविक रूप से विश्लेषणात्मक प्रक्रिया के समायोजन की आवश्यकता होती है जो नमूने प्रवाह cytometry के बीच मतभेद होने वाली हो सकती है. उदाहरण के लिए, साधन की संवेदनशीलता पर निर्भर करता है, dimly fluorescing Prochlorococcus कोशिकाओं शोर के स्तर से नीचे हो सकता है और मात्रा निर्धारित नहीं किया जाएगा. मोती पुष्टि करने के लिए, जैसे एक आंतरिक नमूना नियंत्रण (के रूप में सेवा है कि साधन के respफ्लोरोसेंट संकेतों को onse दिन से दिन में संगत है (और चलाने के दौरान ही स्थिर रहता है). जाना जाता सांद्रता में नमूना करने के लिए जोड़ा है, वे भी नमूना मात्रा रन सत्यापित करने के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं. हालांकि, यह हमेशा thawed और 96 अच्छी तरह से थाली रन के बीच से निपटने के नमूने के लिए एक अतिरिक्त जैविक नियंत्रण प्रदान करने के लिए ब्याज के नमूने के साथ दाग है कि एक पहले से जमे हुए "मानक" समुद्री जल के नमूने की एक विभाज्य चलाने की सिफारिश की है. स्थान के आधार पर, समुद्री जल के नमूने एक दूसरे से बहुत अलग दिख सकता है. "प्रतिनिधि" आबादी छंटनी और फिर एक epifluorescent खुर्दबीन (ईएम) के नीचे देखने के लिए जल्दी से या तो Synechococcus सपा. या संश्लेषक यूकेरियोट्स रूप पादप प्लवक आबादी को सत्यापित करने के लिए एक अच्छा तरीका हो सकता है. वे भी तेजी से नहीं हो पाती क्योंकि Prochlorococcus कोशिकाओं ईएम के तहत आम तौर पर दिखाई नहीं देते हैं. इसके अलावा एक, Synechococcus सपा क्लोरोफिल के लिए. भी पीएच होते हैंक्लोरोफिल ए (660-700 एनएम) की तुलना में कम तरंग दैर्ध्य (540-630 एनएम) पर प्रकाश का उत्सर्जन करता है जो otopigment phycoeurythrin (पीई),. Synechococcus कोशिकाओं नीला / हरी प्रकाश (470-490 एनएम) के साथ उत्साहित कर रहे हैं 510 एनएम नीचे प्रकाश के सभी तरंग दैर्ध्य को हटा कि एक उत्सर्जन फिल्टर के नीचे देखा, तो वे सुनहरा दिखाई देगा. प्रकाश की एक ही तरंग दैर्ध्य के साथ उत्साहित जब तुलना करके, यूकेरियोटिक अंश, लाल दिखेगा.
वायरल metagenomics
यह VLP एकाग्रता और भंडारण की प्रक्रिया बरामद समुदाय को प्रभावित करती है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. वायरल कण कम करने की प्रक्रिया में हर कदम पर हो सकता है, और इस प्रकार, वायरल शुद्धि और संवर्धन प्रोटोकॉल का चयन अंततः परिणामस्वरूप वायरल metagenomes 44,45,18 की मनाया वर्गीकरण संरचना और विविधता को प्रभावित कर सकते हैं. नमूनों की एकाग्रता TFF 19 या रासायनिक आधारित flocculation 20 का उपयोग किया जा सकता है. रासायनिक आधारित दृष्टिकोण, मंज़ूर मेंively लोहे के आयनों समाधान के बाहर गुच्छे में पड़ना और 8 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर ठीक किया जा सकता है कि बड़े (> 8 माइक्रोन) लोहे वायरल परिसरों के गठन स्वाभाविक रूप से नकारात्मक आरोप लगाया वायरल कणों बाँध का आरोप लगाया. इसके बाद लोहे वायरल कणों बंद chelated और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण 20 के लिए केंद्रित वायरल कणों छोड़ने, मैग्नीशियम, एस्कॉर्बिक एसिड, और EDTA का उपयोग फिर से भंग कर रहा है. इन दो मौजूदा तरीकों की तुलना के बाद, हम लोहा क्लोराइड विधि TFF वायरल एकाग्रता से खपत कम समय है, लेकिन कुछ निरंतर उपज हो सकती है कि संपन्न हुआ. हम लोहा वायरल की कि हदबंदी और विघटन पाया आवश्यकता है एक दो गुना विघटन एस्कॉर्बिक एसिड degrades से पहले आगे बढ़ने के लिए आदेश में रिपोर्ट 20 से अधिक केंद्रित मैग्नीशियम-एस्कॉर्बिक अम्ल-EDTA समाधान. एक तरफ इस मुद्दे से, प्रोटोकॉल 0.2 माइक्रोन निस्पंदन का उपयोग माइक्रोबियल contaminants को दूर करने, अकेले आकार-विभाजन से वायरल कणों शुद्ध. बड़े वायरस filt के माध्यम से पारित नहीं हैईआर (जैसे, यांग एट अल. 46) और इस प्रकार metagenome में पता नहीं होगा, कुछ बैक्टीरिया जबकि (McDole, अप्रकाशित डेटा). बड़े वायरस के खिलाफ भेदभाव है, जबकि यह जीवाणु संक्रमण में परिणाम है.
यही विशिष्ट मुद्दा हालांकि यह भी TFF एकाग्रता के सिलसिले में रोगाणुओं को हटाने के लिए प्रासंगिक है. क्लोरोफॉर्म उपचार बाह्य लिपिड झिल्लियों 47 के साथ क्लोरोफॉर्म के प्रति संवेदनशील वायरस को दूर करने के लिए दिखाया गया है जैसा कि कुछ अध्ययनों से 0.22 माइक्रोन निस्पंदन बैक्टीरिया के बहुमत को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सुझाव है. यह भी प्रस्तुत विधि में मुख्य रूप से जीवाणुभोजी, समुद्री वातावरण में आनुवंशिक सामग्री के सबसे प्रचुर वाहक है कि लक्ष्य पर ध्यान दिया जाना चाहिए. फेज आम तौर पर लगा रहे हैं क्योंकि न सामान्यतः वे क्लोरोफॉर्म उपचार के लिए प्रतिरोधी रहे लिपिड 48 को शामिल करने के लिए. हमारे ज्ञान करने के लिए एक "पकड़ सभी" विधि तारीख को मौजूद नहीं है. यहाँ प्रस्तुत विधि कहां से अनुकूलित हैआर्कटिक सिस्टम में उष्णकटिबंधीय फैले विभिन्न समुद्री वातावरण में पिछले 10 वर्षों से अनुसंधान क्षेत्र अनुभव.
माइक्रोबियल metagenomics
रोगाणुओं (यानी, जीवाणु और आर्किया) के लिए metagenomic पुस्तकालयों का निर्माण यह पुस्तकालय तैयारी के लिए आवश्यक न्यूनतम डीएनए सांद्रता उत्पन्न करने के लिए आसान है के रूप में वायरल metagenomes से अधिक सरल है. एकाधिक विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) पर आधारित linker प्रवर्धन बन्दूक पुस्तकालयों (LASLs) 17,49,50 और पूरे जीनोम प्रवर्धन अनुक्रमण के लिए पर्याप्त डीएनए उत्पन्न करने के लिए दो सबसे अधिक इस्तेमाल के तरीके हैं. माइक्रोबियल metagenomes में उच्च डीएनए सांद्रता प्राप्त करने के लिए एमडीए का उपयोग कभी कभी आवश्यक है. हालांकि इस तरह के dinoflagellate minicircles की overamplification के रूप में अनुक्रम डेटा में कलाकृतियों, पैदा कर सकता है. एमडीए तरीकों गैर मात्रात्मक परिणाम 51,52, जिसके परिणामस्वरूप को प्राथमिकता-एक असहाय और परिपत्र डीएनए बढ़ाना जाना जाता है. अनुकूलित LASLs 50 इस प्रकार सूक्ष्म और अनुक्रमण के लिए वायरल metagenomic डीएनए दोनों amplifying में एक बेहतर विकल्प के रूप में कार्य करता है हो सकता है दृष्टिकोण. यह LASLs दृष्टिकोण, कई कदम है परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता है, और dsDNA टेम्पलेट्स तक सीमित है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, ऊतक डीएनए निष्कर्षण किट ग्राम सकारात्मक और ग्राम नकारात्मक संघ दोनों से डीएनए निकालने के लिए दिखाया गया है, लेकिन इसे प्रभावी ढंग से Lyse अड़ियल माइक्रोबियल taxa या उनके संबद्ध संरचनाओं को सत्यापित नहीं किया गया है (उदाहरण के लिए, कुछ आर्किया, endospores, या कवक spores) . इसलिए एक मनका पिटाई कदम निश्चित रोगाणुओं से डीएनए प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
ये व्यापक आकलन वायरल और माइक्रोबियल पारिस्थितिकी तंत्र के कामकाज को बेहतर ढंग से समझ में परिणाम होगा. कुछ अध्ययनों से सभी प्रस्तावित पैरामीटर का आकलन करने के लिए प्रयास किए गए हैं, कई चयनित लोगों की जांच की गई है. नेल्सन एट अल. 53 betw एक कनेक्शन का सुझाव दियाअपतटीय जल के सापेक्ष दोनों डॉक्टर और bacterioplankton सांद्रता में een विशिष्ट चट्टान निवास और depletions. ये एकाग्रता परिवर्तन bacterioplankton समुदायों के अलग differentiations के साथ थे. Dinsdale एट अल. 5 वृद्धि मानवीय प्रभाव सूक्ष्म कोशिकाओं और वायरस की तरह कणों की 10x उच्च abundances के साथ गया था कि पता चला है. बसे हुए द्वीपों के आसपास के समुद्री जल में सूक्ष्म समुदायों भी heterotrophs और संभावित रोगजनक 5 का बड़ा भिन्न था. अंत में McDole एट अल. 4 मानव गतिविधियों macrobes की कीमत पर, रोगाणुओं को ऊर्जा जा रहे हैं कि, microbialization स्कोर को शुरू करने से पता चला है. विशिष्ट सूक्ष्म और पानी रसायन शास्त्र मानकों पर ध्यान केंद्रित ये अध्ययन, समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों के जैव रासायनिक संरचना में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं. तापमान और पीएच मान, मछली बायोमास और diversi तरह – पारिस्थितिकी तंत्र निगरानी प्रयासों के पारंपरिक डेटा का मेलTy, benthic कवर, या मानव प्रभाव के लिए जोखिम – पानी रसायन विज्ञान और सूक्ष्म आकलन के साथ, संभावना अधिक विशेष रूप से निशाना बनाया संरक्षण के प्रयासों को जन्म दे सकती है जो अधिक संवेदनशील पर्यावरण निगरानी प्रयासों का परिणाम देगा.
The authors have nothing to disclose.
We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) | Figure 1 | ||
Filtration setup | Figure 1 | ||
32 – 36 % Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Sci | A508-212 | |
High-density polyethylene (HDPE) container | e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid | ||
Combustion oven (550° C) | |||
60 ml HDPE vials | Fisher Sci | 02-896-2B | |
25 mm GF/F filter | Fisher Sci | 09-874-64 | |
Forceps | Fisher Sci | XX62-000-06 | |
Sterile, non-powdered gloves | Fisher Sci | 19-170-010B | |
Bilge pump | e.g., Thirsty Mate 124PF | ||
20 l collapsible low-density polyethylene carboy | e.g., Reliance Fold A Carrier II | ||
Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges | Amersham | CFP-2-E-9A | |
Platinum-cured silicon tubing for TFF | Cole Parmer | 96440-82 | |
Hose clamps | Cole Parmer | P-68007-23 | |
Peristaltic pump | Cole Parmer | EW-77410-10 | |
Sodium hydroxide (NaOH) solution | Electron Microscopy Sciences | 21162 | |
0.2 µm polycarbonate Track-Etched Membrane filter | Fisher Sci | 09-300-61 | |
8.0 µm polycarbonate Track-Etched Membrane filter | Fisher Sci | 09-300-57 | |
0.22 µm polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVGP01050 | |
0.45 µm polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVHV010RS | |
Synthetic nylon mesh | Sefar | 03-125-37 | |
20 ml plastic scintillation bottle | Fisher Sci | 03-341-72C | |
Clean bucket (10 – 20 L) | |||
32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15714 | |
25 % glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16220 | |
Liquid Nitrogen | |||
0.02 µm high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6002 | |
0.2 µm high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6022 | |
10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain | Invitrogen | S11494 | |
DAPI solution 25 µg ml-1 | Invitrogen | D1306 | |
Molecular grade water | sigma aldrich | W-4502 | |
Ascorbic Acid | Fisher Sci | BP351-500 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Sci | BP399-500 | |
Glycerol | Fisher Sci | G31-500 | |
Microscope slide | Fisher Sci | 12-550-123 | |
Coverslip | Fisher Sci | 12-548-5M | |
Delicate task wipe | Fisher Sci | 06-666A | |
Slide Station with vacuum pump | Figure 3 | ||
DNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.1 | Nucleospin tissue kit |
Proteinase K (20 mg ml-1) | Lifetechnologies | AM2546 | |
200-proof 100% Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15058 | |
Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | EW-45503-88 | |
Cesium chloride (CsCl) | Fisher Sci | bp1595-500 | |
60 ml syringe | Fisher Sci | 13-6898 | |
0.02 µm alumina matrix disposable syringe filter | Fisher Sci | O992613 | |
Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
Ultra – swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 333790 | SW41 Ti Rotor |
DNase I (100 u µl-1) | Calbiochem | 260913 | |
0.5 M EDTA | Fisher Sci | BP2482-500 | |
Formamide | Fisher Sci | BP228-100 | |
Glycogen | sigma aldrich | G-1767 | |
100 % Ethanol (200-proof) | Electron Microscopy Science | 15058 | |
1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0 | Fisher Sci | BP2473-500 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Sci | 02674-25 | |
20 μg ml-1 Proteinase K | Fisher Sci | BP1700-500 | |
Chloroform | Fisher Sci | BP1145-1 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | sigma aldrich | p3803 | |
Isopropanol | Fisher Sci | BP2618-500 | |
50ml Oak Ridge Tube | Fisher Sci | 05-562-16B |