Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.
Aquí presentamos una serie de protocolos de investigación a fondo probados y bien estandarizados adaptados para su uso en ambientes marinos remotos. Los protocolos de muestreo incluyen la evaluación de los recursos a disposición de la comunidad microbiana (carbono orgánico disuelto, la materia orgánica particulada, nutrientes inorgánicos), y una descripción completa de las comunidades virales y bacterianas (a través de los recuentos microbianos y virales directos, la enumeración de los microbios autofluorescentes, y construcción de metagenomes virales y microbianas). Utilizamos una combinación de métodos, que representan un campo disperso de las disciplinas científicas que comprenden protocolos ya establecidos y algunas de las técnicas más recientes desarrollados. Técnicas de secuenciación metagenómica Especialmente utilizados para la caracterización viral y bacteriana de la comunidad, se han establecido sólo en los últimos años, y por lo tanto están todavía sometidos a la mejora continua. Esto ha conducido a una variedad de procedimientos de muestreo y procesamiento de las muestras Currentemente en uso. El conjunto de métodos que aquí se presenta ofrece un enfoque hasta la fecha para recoger y procesar muestras ambientales. Parámetros tratados con estos protocolos producen el mínimo de información esencial para caracterizar y comprender los mecanismos subyacentes de la dinámica de la comunidad virales y microbianas. Da fácil de seguir las directrices para llevar a cabo estudios amplios y discute los pasos críticos y advertencias potenciales pertinentes para cada técnica.
Los ecosistemas marinos son sometidos a una amplia gama de perturbaciones que resultan en cambios con respecto a la disponibilidad de nutrientes a la biomasa de los depredadores. Durante la última década, varios estudios han demostrado la importancia de las comunidades microbianas en los ecosistemas marinos 1.4. Es evidente que los cambios en la comunidad bacteriana y viral están estrechamente asociados con la degradación general de los entornos marinos 5. Estos cambios pueden ser facilitadas por la geoquímica de alteración en la columna de agua, tales como la disponibilidad de oxígeno o 6,7 remineralización de carbono. Como resultado de la interdependencia entre el macroorganismos, la química del agua y ciclos de retroalimentación de actividad microbiana puede acelerar la tasa de degradación de los ecosistemas 8.
En los años 1970 y 80 se hicieron múltiples intentos de desentrañar los ciclos biogeoquímicos en los ecosistemas marinos 9.11. Uno de los principales retos para estos primeros estudios fue la faltade enfoques estandarizados para medir los parámetros biogeoquímicos evaluados. Aunque hubo protocolos disponibles, principalmente en los nutrientes del agua de mar 12,13, la evaluación de la dinámica del carbono y la estructura de la comunidad microbiana fueron limitados por las herramientas y métodos disponibles. Con la comparación de métodos JGOFS EQPac, Sharp et al. 14 sugirió por primera vez un protocolo fiable y estandarizado para las evaluaciones de concentración (DOC) de carbono orgánico disuelto. A principios de la década de 2000 los retos analíticos para determinar los recursos disponibles para la comunidad microbiana se habían resuelto de este modo en gran medida y enfoques para caracterizar las comunidades microbianas en ambientes de cultivo controladas se había establecido (ver DeLong 15). Los métodos de secuenciación tradicionales de la época se basaban en gran medida en cultivos clonales cultivadas. La secuenciación de genes ambiental adelantado de muestras naturales reveló, sin embargo, que la mayoría de la biodiversidad microbiana se había perdido por cultivmétodos basados en la ación 16. En 2002, Breitbart et al. 17 utiliza la secuenciación escopeta para la primera vez para describir la comunidad viral en muestras de agua de mar ambientales se establece un método para secuenciar el genoma completo de comunidades virales uncultured marinos.
Dentro de las evaluaciones microbianas existentes, los virus siguen siendo particularmente bajo estudiada, ya que la mayoría son difíciles de cultivar y que carecen de un marcador universalmente conservada como el 16S ARN ribosomal (rRNA) genes normalmente utilizados para la evaluación de la diversidad y el perfil de la comunidad. El enfoque de secuenciación metagenómica ofrece una alternativa a los métodos de cultivo y dependiente de genes orientados para el análisis de comunidades virales complejos. Mientras que los primeros metagenomes virales generados a partir de agua de mar se secuenciaron usando secuenciación de Sanger 17, el desarrollo de tecnologías de secuenciación de próxima generación y mejora de las técnicas moleculares ha llevado a un rápido aumento en los estudios de metagenómica 18 </sarriba>. El flujo de trabajo de laboratorio actual de la metagenómica virales implica la separación, enriquecimiento, y / o la concentración de partículas virales, seguido de ácido nucleico (ADN o ARN) extracción, la preparación de la biblioteca, y la secuenciación 19-21.
Para avanzar en el conocimiento existente sobre viral, microbiano y el funcionamiento bioquímico en los ecosistemas acuáticos, la comparación de conjuntos de datos en los diferentes sistemas en todo el mundo es esencial. Sin embargo, los protocolos establecidos en gran parte han sido desarrollados para entornos cercanos a la costa con instalaciones de laboratorio de fácil acceso. Por lo tanto, la falta de métodos de campo estandarizados dificulta estas comparaciones entre ecosistemas. Aquí presentamos probado a fondo y bien estandarizado adaptaciones de estado de los protocolos de investigación técnica para su uso en lugares remotos de campo. Estos métodos han sido probados con éxito en múltiples estudios sobre el transcurso de la última década 5,22 y se utilizan en la actualidad por diversos laboratorios marinos, así como en el de NOAAEvaluación y Programa de Monitoreo de Arrecifes (RAMP) en todo el Océano Pacífico 4. Los protocolos de muestreo incluyen parámetros de química de agua (concentraciones de carbono inorgánicos y orgánicos, concentración de nutrientes inorgánicos), la abundancia viral y microbiana (recuentos bacterianos directos, recuentos directos virales, y citometría de flujo para evaluar autotroph vs proporciones heterótrofos), y estructura de la comunidad microbiana y viral y potencial metabólico a través de análisis de metagenómica (para una visión general véase la figura 1). Los resultados obtenidos a partir de los métodos descritos aquí son necesarios con el fin de dilucidar los parámetros de fondo biogeoquímicos clave necesarios para caracterizar exhaustivamente los ecosistemas acuáticos.
Los métodos presentados aquí proporcionan una herramienta para generar una evaluación exhaustiva de la dinámica viral y microbiana en los ecosistemas acuáticos. Están dirigidos a cuantificar la biomasa de los recursos orgánicos e inorgánicos disponibles para las comunidades microbianas y para caracterizar la composición de la comunidad microbiana y viral presente. Junto a la cuantificación de la abundancia viral y la abundancia de biomasa microbiana y, información de la secuencia genómica revela su estructura y función de la comunidad. Todos los métodos han sido desarrollados o modificados para permitir la aplicación de campo en lugares remotos. Sin embargo, la falta de ajustes de laboratorio controladas crea inherentemente alguna posibilidad de errores. Aquí hablamos de algunas advertencias asociadas a cada uno de los parámetros evaluados. Junto al potencial de contaminación durante la manipulación de muestras algunos de los parámetros también el potencial de rendimiento para el error en el proceso analítico.
Carbono orgánico disuelto
La contaminación de carbono puede ocurrir durante los procedimientos de muestreo (muestreo de aguas abajo, o en las proximidades de un barco o un buceador), durante la preparación de la muestra (contaminación del equipo o la manipulación inadvertida), e incluso durante el almacenamiento de la muestra (otras muestras en el congelador que contiene orgánica disolventes volátiles /). Para evitar las diversas fuentes de contaminación conducta tan pocos pasos de manipulación como sea posible, ya que cada muestra de reubicación plantea una fuente adicional de contaminación. La muestra no debe ponerse en contacto con cualquier elemento no ácido se lava o se quema. Por último, la designación de un congelador de almacenamiento exclusivamente para muestras que no contengan sustancias orgánicas volátiles se asegurará la integridad de las muestras durante períodos de almacenamiento más largos. Si las muestras no pueden mantenerse congeladas durante un periodo de tiempo prolongado acidificación de las muestras de DOC con HCl concentrado (como se describe 38-41) puede ser una alternativa aplicable. Para verificar los materiales de referencia DOC consenso exactitud de medición se deben utilizar regcialmente durante la medición DOC ejecuta. Especialmente de agua de mar profundo (> 2.000 m) las referencias son valiosos para evaluar el rendimiento de la máquina analítica, ya que es muy estable en su contenido DOC 42.
Materia orgánica particulada
Además de evitar la contaminación de carbono orgánico, el muestreo POM requiere una atención especial para garantizar la exactitud del volumen filtrado. Si el volumen específico de 500 ml debería desviarse por cualquier razón potencial que este necesita ser observado para relacionar la cantidad de POM capturado en el filtro para el filtrado de los cuales se deriva.
Los nutrientes inorgánicos
Al igual que con el muestreo de carbono orgánico, se debe prestar atención a la posible contaminación de la muestra de nutrientes generada por diversas fuentes como barcos o descargas de aguas residuales 12. Los filtros utilizados para el muestreo de carbono orgánico con un valor nominal de tamaños de poro de 0,8 micras, no pueden excluir toda la biomasa microbiana y shpor lo tanto, ould ser cambiado a 0,2 micras filtros para esta etapa de filtración. Además, los límites de detección plantean un problema con muestras de nutrientes; especialmente en las aguas superficiales oligotróficas alrededor de muchos lugares de arrecifes de coral (por ejemplo, Cotner et al., 43). Los límites de detección son más o menos alrededor de 0,1, 0,2, y 0,1 mol / L para el amonio, nitrato y nitrito, y orto-fosfato, respectivamente (ver 36,12,37)
Microscopía
Además de las variaciones en la concentración de análisis de imágenes de microscopía de muestras a partir de diapositivas aún más los rendimientos potencial de errores. Por ejemplo, las imágenes pueden estar fuera de foco en algunas zonas del campo de visión, y en el enfoque en otros. Como un filtro de matriz de alúmina de alta pureza es un tipo de filtro muy rígido, cualquier residuo bajo el filtro puede hacer que todo el filtro para sentarse en un ángulo a la diapositiva. Como resultado, las imágenes pueden ser consistentemente fuera de foco en diversas partes del campo de visión para un filtro dado, reindependientemente de la alineación microscopio. Volver a montar los filtros, asegurando la parte inferior del filtro está limpio, puede mejorar esta si se observa. También, en algunos casos puede haber dos planos focales en los que los virus y los microbios se pueden encontrar. Este es el resultado de los objetos manchados se desprenda desde el filtro al montar, y que flotan hasta la parte inferior de la hoja de la cubierta que puede hacer que los recuentos de poco fiable. Por lo tanto siempre es recomendable para comprobar la calidad de las muestras durante el proceso.
Citometría de Flujo
Al igual que con las muestras de microscopía, puede ser de origen natural diferencias entre las muestras de citometría de flujo que requieren ajustes del proceso analítico. Por ejemplo, dependiendo de la sensibilidad del instrumento, débilmente las células fluorescentes Prochlorococcus pueden estar por debajo del nivel de ruido y no serán cuantificados. Beads sirven como un control interno de la muestra (por ejemplo, para confirmar que resp del instrumentoOnse a las señales fluorescentes es consistente día a día (y se mantiene estable durante el mismo plazo). Si se añade a la muestra a concentraciones conocidas, también pueden servir como un control interno para verificar el funcionamiento volumen de muestra. Sin embargo, se recomienda ejecutar siempre una parte alícuota de una muestra de agua de mar previamente congelado "estándar" que se descongeló y se tiñeron junto con las muestras de interés para proporcionar un control biológico adicional para el manejo de entre las corridas de placa de 96 pocillos de muestra. Dependiendo de la ubicación, las muestras de agua de mar puede parecer muy diferentes entre sí. Clasificación poblaciones "representativas" y luego ver bajo un microscopio de epifluorescencia (EM) puede ser una buena manera de verificar rápidamente las poblaciones de fitoplancton, ya sea como Synechococcus sp. O eucariotas fotosintéticos. Prochlorococcus células normalmente no son visibles bajo EM porque se desvanecen demasiado rápido. Además de clorofila a, Synechococcus sp. Contener también el phphycoeurythrin otopigment (PE), que emite luz en longitudes de onda más cortas (540 a 630 nm) que la clorofila A (660-700 nm). Cuando las células Synechococcus se excitan con luz azul / verde (470-490 nm), aparecerán de oro si se observa bajo un filtro de emisión que elimina todas las longitudes de onda de la luz por debajo de 510 nm. En comparación, la fracción eucariótica se verá de color rojo, cuando se excitan con la misma longitud de onda de la luz.
La metagenómica viral
Es importante señalar que el proceso de concentración y el almacenamiento VLP influye en la comunidad recuperado. Pérdida partícula viral puede ocurrir en cada paso en el proceso, y por lo tanto, la selección de los protocolos de purificación y enriquecimiento virales puede afectar en última instancia la composición taxonómica observada y la diversidad de los metagenomes virales resultantes 44,45,18. Concentración de las muestras se puede hacer usando TFF 19 o basada en productos químicos de floculación 20. En el enfoque de base química, positvamente cargada iones de hierro se unen las partículas virales, naturalmente, con carga negativa que forman (> 8 micras) complejos de hierro viral grandes que floculan de la solución y pueden ser recuperados utilizando 8 micras filtros. Posteriormente, el hierro está quelado fuera de las partículas virales y re-disolvió utilizando magnesio, ácido ascórbico, y EDTA, dejando partículas virales concentradas para la extracción de ácido nucleico 20. Después de la comparación de estos dos métodos actuales, llegamos a la conclusión de que el método del cloruro de hierro es menos tiempo que la concentración viral TFF, pero puede producir algunas advertencias. Se encontró que la disociación y la disolución del hierro-viral requiere una dos veces solución de magnesio-ácido ascórbico-EDTA más concentrada que informaron 20 con el fin de proceder para la disolución antes de que se degrada el ácido ascórbico. Aparte de esta cuestión, el protocolo purifica partículas virales por tamaño-fraccionamiento solo, la eliminación de contaminantes microbianos utilizando 0,2 micras de filtración. Virus grandes no pasan por el filter (por ejemplo, Yang et al. 46) y que por lo tanto no ser detectado en el metagenoma, mientras que algunas bacterias hacen (McDole, datos no publicados). Esto da lugar a la contaminación bacteriana, mientras que discriminar a los grandes virus.
Esta cuestión específica sin embargo, también es relevante para la eliminación de microbios en relación con la concentración de TFF. Como se ha demostrado el tratamiento cloroformo para eliminar virus-cloroformo sensible con las membranas lipídicas externas 47 algunos estudios sugieren que 0,22 micras de filtración puede ser utilizado para eliminar la mayoría de las bacterias. También hay que señalar que el método presentado se dirige principalmente a bacteriófago, el más abundante portador de material genético en ambientes marinos. Debido a fagos se piensa generalmente que no contienen lípidos comúnmente 48 que son más resistentes al tratamiento cloroformo. A nuestro entender un método "catch-all" no existe hasta la fecha. El método que aquí se presenta es una adaptación del ouexperiencia de campo r en los últimos 10 años en diversos ambientes marinos tropicales que abarcan a los sistemas árticos.
Microbiana metagenómica
La construcción de bibliotecas metagenomic para los microbios (es decir, bacterias y arqueas) es más sencillo que metagenomes virales, ya que es más fácil de generar las concentraciones mínimas de ADN necesarios para la preparación de la biblioteca. Linker amplificación escopeta bibliotecas (LASLs) amplificación 17,49,50 y todo el genoma basado en la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) son los dos métodos más comúnmente utilizados para generar suficiente ADN para la secuenciación. El uso de MDA para obtener concentraciones más altas de ADN en metagenomes microbianas veces es necesario. Sin embargo, esto puede causar artefactos en los datos de secuencia, como la sobreamplificación de minicircles de dinoflagelados. Métodos de MDA son conocidos para amplificar preferentemente ADN monocatenario y circular, resultando en resultados no cuantitativos 51,52. Los LASLs optimizados se acercan a 50 puede por lo tanto sirve como una alternativa mejor en la amplificación de tanto microbiana y el ADN viral metagenomic para la secuenciación. Es importante señalar que el enfoque LASLs tiene múltiples pasos, requiere un equipo sofisticado, y se limita a plantillas de ADN de doble cadena. Además, el kit de extracción de ADN de tejidos se ha demostrado para extraer el ADN de ambos filos negativa Gram positivas y Gram, pero no ha sido verificada a taxones microbianos efectivamente lisis recalcitrante o sus estructuras asociadas (por ejemplo, seguro de arqueas, endosporas, o esporas de hongos) . Por lo tanto, puede ser necesario un paso paliza de cuentas para obtener el ADN de ciertos microbios.
Estas evaluaciones completas se traducirá en una mejor comprensión del funcionamiento del ecosistema microbiano y viral. Aunque pocos estudios han llevado a cabo el esfuerzo de evaluar todos los parámetros propuestos, muchos han estado investigando los seleccionados. Nelson et al. 53 sugiere una conexión between hábitats de arrecifes específica y agotamientos en ambas concentraciones de DOC y bacterioplancton relativos a las aguas en alta mar. Estos cambios de concentración fueron acompañados por distintas diferenciaciones de bacterioplancton. Dinsdale et al. 5 mostró que el aumento de impacto antropogénico fue acompañado por 10x mayor abundancia de células microbianas y partículas similares a virus. Las comunidades microbianas en las aguas marinas que rodean las islas habitadas también tenían fracciones más grandes de heterótrofos y potenciales patógenos 5. Finalmente McDole et al. 4 mostró, mediante la introducción de la puntuación microbialization, que las actividades humanas están cambiando energía a los microbios, a expensas de los macrobios. Estos estudios, se centraron en los parámetros microbiológicos y químicos del agua específicos, proporcionan nuevos conocimientos sobre la estructura bioquímica de los ecosistemas marinos. La combinación de datos tradicionales de los esfuerzos de monitoreo de ecosistemas – como valores de temperatura y pH, la biomasa de peces y diversidad, la cubierta bentónica, o la exposición al impacto humano – con la química del agua y evaluaciones microbianas, probablemente como resultado de los esfuerzos de monitoreo ambiental más sensibles, que pueden llevar a los esfuerzos de conservación más específicamente dirigidos.
The authors have nothing to disclose.
We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) | Figure 1 | ||
Filtration setup | Figure 1 | ||
32 – 36 % Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Sci | A508-212 | |
High-density polyethylene (HDPE) container | e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid | ||
Combustion oven (550° C) | |||
60 ml HDPE vials | Fisher Sci | 02-896-2B | |
25 mm GF/F filter | Fisher Sci | 09-874-64 | |
Forceps | Fisher Sci | XX62-000-06 | |
Sterile, non-powdered gloves | Fisher Sci | 19-170-010B | |
Bilge pump | e.g., Thirsty Mate 124PF | ||
20 l collapsible low-density polyethylene carboy | e.g., Reliance Fold A Carrier II | ||
Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges | Amersham | CFP-2-E-9A | |
Platinum-cured silicon tubing for TFF | Cole Parmer | 96440-82 | |
Hose clamps | Cole Parmer | P-68007-23 | |
Peristaltic pump | Cole Parmer | EW-77410-10 | |
Sodium hydroxide (NaOH) solution | Electron Microscopy Sciences | 21162 | |
0.2 µm polycarbonate Track-Etched Membrane filter | Fisher Sci | 09-300-61 | |
8.0 µm polycarbonate Track-Etched Membrane filter | Fisher Sci | 09-300-57 | |
0.22 µm polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVGP01050 | |
0.45 µm polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVHV010RS | |
Synthetic nylon mesh | Sefar | 03-125-37 | |
20 ml plastic scintillation bottle | Fisher Sci | 03-341-72C | |
Clean bucket (10 – 20 L) | |||
32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15714 | |
25 % glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16220 | |
Liquid Nitrogen | |||
0.02 µm high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6002 | |
0.2 µm high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6022 | |
10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain | Invitrogen | S11494 | |
DAPI solution 25 µg ml-1 | Invitrogen | D1306 | |
Molecular grade water | sigma aldrich | W-4502 | |
Ascorbic Acid | Fisher Sci | BP351-500 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Sci | BP399-500 | |
Glycerol | Fisher Sci | G31-500 | |
Microscope slide | Fisher Sci | 12-550-123 | |
Coverslip | Fisher Sci | 12-548-5M | |
Delicate task wipe | Fisher Sci | 06-666A | |
Slide Station with vacuum pump | Figure 3 | ||
DNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.1 | Nucleospin tissue kit |
Proteinase K (20 mg ml-1) | Lifetechnologies | AM2546 | |
200-proof 100% Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15058 | |
Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | EW-45503-88 | |
Cesium chloride (CsCl) | Fisher Sci | bp1595-500 | |
60 ml syringe | Fisher Sci | 13-6898 | |
0.02 µm alumina matrix disposable syringe filter | Fisher Sci | O992613 | |
Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
Ultra – swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 333790 | SW41 Ti Rotor |
DNase I (100 u µl-1) | Calbiochem | 260913 | |
0.5 M EDTA | Fisher Sci | BP2482-500 | |
Formamide | Fisher Sci | BP228-100 | |
Glycogen | sigma aldrich | G-1767 | |
100 % Ethanol (200-proof) | Electron Microscopy Science | 15058 | |
1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0 | Fisher Sci | BP2473-500 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Sci | 02674-25 | |
20 μg ml-1 Proteinase K | Fisher Sci | BP1700-500 | |
Chloroform | Fisher Sci | BP1145-1 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | sigma aldrich | p3803 | |
Isopropanol | Fisher Sci | BP2618-500 | |
50ml Oak Ridge Tube | Fisher Sci | 05-562-16B |