Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.
Här presenterar vi en rad tuffa tester väl standardiserade forskningsprotokoll anpassade för användning i avlägsna marina miljöer. Protokollen provtagnings inkluderar bedömning av resurserna till den mikrobiella (löst organiskt kol, partikel organiskt material, oorganiska näringsämnen), och en omfattande beskrivning av de virala och bakteriella samhällen (via direkta virala och mikrobiella räknas, uppräkning av autofluorescerande mikrober, och konstruktion av virala och mikrobiella metagenomes). Vi använder en kombination av metoder, som utgör ett spritt fält av vetenskapliga discipliner som innefattar redan etablerade protokoll och några av de senaste tekniker som utvecklats. Speciellt metagenomic sekvenseringstekniker som används för virus- och bakteriesamhället karakterisering, har fastställts först på senare år, och som således fortsättningsvis utsätts för ständig förbättring. Detta har lett till en mängd olika provtagnings- och provhantering currently används. Uppsättningen metoder som presenteras här erbjuder en aktuell metod för att samla in och bearbeta miljöprover. Parametrar som behandlas med dessa protokoll ger ett minimum av information nödvändig för att karakterisera och förstå de bakomliggande mekanismerna för virala och mikrobiella samhällsdynamik. Det ger lätt att följa riktlinjer för att genomföra omfattande undersökningar och diskuterar kritiska steg och potentiella förbehåll relevanta för varje teknik.
Marina ekosystem utsätts för ett brett spektrum av störningar som medför förändringar från näringstillgång till biomassan av toppredatorer. Under det senaste decenniet har flera studier visat på vikten av de mikrobiella samhällen i marina ekosystem 1-4. Det är uppenbart att förändringar i bakterie- och virus gemenskap är nära förknippade med den totala nedbrytningen av marina miljöer 5. Dessa förändringar kan underlättas genom förändrad geokemi i vattenmassan, såsom syretillgång eller kol remineralization 6,7. Som en följd av det ömsesidiga beroendet mellan makroorganismer, vattenkemi och mikrobiell aktivitet återkopplingar kan accelerera takten i ekosystemet nedbrytnings 8.
På 1970- och 80-talet flera försök gjordes att nysta biogeokemiska kretslopp i marina ekosystem 9-11. En av de största utmaningarna för dessa tidiga studier var bristenav standardiserade metoder för att mäta de bedömda biogeokemiska parametrar. Även om det fanns protokoll som finns, främst på havsvatten näringsämnen 12,13, var bedömningen av koldynamik och mikrobiella samhällsstrukturen begränsas av de verktyg och metoder som finns tillgängliga. Med JGOFS EqPac metoder jämförelse, et al. Sharp 14 föreslås för första gången en pålitlig och standardiserat protokoll för bedömningar löst organiskt kol (DOC) koncentration. I början av 2000-talet de analytiska utmaningar att bestämma tillgängliga resurser för mikrobiella hade således till stor del lösts och tillvägagångssätt för att karakterisera mikrobiella samhällen i kontrollerade kulturmiljöer hade fastställts (se DeLong 15). De traditionella sekvenseringsmetoder på den tiden förlitat sig på odlade klonala kulturer. Tidig miljö gen sekvensering av naturliga prover visade dock att majoriteten av mikrobiell biodiversitet hade missats av Kulturation baserade metoder 16. År 2002 Breitbart et al. 17 shotgun-sekvensering för första gången för att beskriva den virala samhället i miljö havsvatten prover fastställer en metod för att sekvensera hela genom icke odlade marina virala samhällen.
Inom de befintliga bedömningar mikrobiella, virus fortfarande särskilt under studerade, eftersom de flesta är svåra att odla och de saknar ett universellt bevarad markör såsom 16S ribosom RNA (rRNA) gener som vanligtvis används för att bedöma mångfald och gemenskap profilering. Den metagenomic sekvense metod ger ett alternativ till kulturberoende och gen inriktade metoder för att analysera komplexa virus samhällen. Medan de första virala metagenomes genereras från havsvatten sekvenserades med hjälp av Sanger-sekvense 17, har utvecklingen av nästa generations teknik för sekvense och förbättrade molekylära tekniker har lett till en snabb ökning av metagenomic studier 18 </supp>. Den aktuella laboratorie arbetsflöde för virala metagenomiken innefattar separation, anrikning och / eller koncentrationen av viruspartiklar, följt av nukleinsyra (DNA eller RNA) extraktion, bibliotek beredning, och sekvensering 19-21.
För att främja befintlig kunskap om virus, mikrober och biokemisk funktion i akvatiska ekosystem, att jämföra datamängder i olika system runt om i världen är viktigt. Däremot har de etablerade protokoll till stor del utvecklats för strandnära miljöer med lätt åtkomliga laboratorier. Således, bristen på standardiserade fältmetoder hindrar dessa tvärekosystem jämförelser. Här presenterar vi grundligt testade och väl standardiserade anpassningar från toppmoderna forskningsprotokoll för användning i avlägsna fältplatser. Dessa metoder har visat sig vara framgångsrika i flera studier som spänner över det senaste decenniet 5,22 och används idag av olika marina laboratorier samt på NOAAReef Bedömning och Monitoring Program (RAMP) i hela Stilla havet 4. Protokollen provtagnings inkluderar vattenkemiparametrar (oorganiska och organiska kol koncentrationer, oorganiska näringsämnen koncentration), virus och mikrobiell överflöd (direkt bakterietal, direkta virala räknas, och flödescytometri bedöma autotroph vs heterotroph förhållanden), och viral och mikrobiell samhällsstruktur och metabolisk potential genom metagenomic analys (för en översikt se figur 1). Resultaten från de metoder som beskrivs här krävs för att belysa viktiga biogeokemiska bakgrundsparametrar som krävs för att på ett heltäckande karaktärisera akvatiska ekosystem.
De metoder som presenteras här kommer att ge ett verktyg för att generera en omfattande bedömning av virala och mikrobiella dynamik i akvatiska ekosystem. De är inriktade på att kvantifiera stående lager av organiska och oorganiska resurser tillgängliga för mikrobiella samhällen och för att karakterisera makeup av virala och mikrobiella närvarande. Bredvid kvantifiera viral överflöd och mikrobiell förekomst och biomassa, avslöjar genomisk sekvensinformation deras samhällsstruktur och funktion. Alla metoder har utvecklats eller modifierats för att möjliggöra tillämpning i avlägsna fältplatser. Men avsaknaden av kontrollerade laboratoriemiljö skapar i sig en viss potential för fel. Här diskuterar vi några varningar i samband med var och en av de parametrar som bedöms. Bredvid risken för förorening vid provhantering vissa av parametrarna även ge möjligheter till fel i analysprocessen.
Löst organiskt kol
Förorening Kol kan förekomma under den urvalsmetod (provtagning nedströms, eller i närheten av en båt eller dykare) under provberedningen (förorening av utrustning eller oavsiktlig hantering), och till och med under lagring av provet (andra prover i frysen som innehåller organiskt lösningsmedel / flyktiga ämnen). För att undvika de olika föroreningskällor beteende så få hanteringssteg som möjligt, eftersom varje prov omlokalisering är ytterligare en källa till förorening. Provet bör inte komma i kontakt med något objekt som inte syratvättade eller förbränns. Slutligen kommer att utse ett förvarings frys enbart för prover som inte innehåller flyktiga organiska ämnen säkerställa integriteten av proverna under längre lagringsperioder. Om proverna inte kan förvaras fryst under en längre tidsperioden försurning av DOC prover med koncentrerad HCI (som beskrivet 38-41) kan vara ett tillämpligt alternativ. För att verifiera mätnoggrannheten DOC konsensusreferensmaterial bör användas regbundet under DOC mätningen körs. Speciellt djupa havet vatten (> 2000 m) referenser är värdefulla vid bedömningen av resultatet för den analytiska maskinen som den är mycket stabil i sin DOC halten 42.
Partikulärt organiskt material
Förutom att undvika organiska föroreningar kol, kräver POM provtagning särskild uppmärksamhet för att säkerställa riktigheten av den filtrerade volymen. Om den riktade volym av 500 ml bör avvika någon potentiell orsak detta måste påpekas att relatera mängden POM fångat på filtret till filtratet som den härleddes.
Oorganiska Näringsämnen
Som med provtagning organiskt kol, måste hänsyn tas till eventuella näringsförorening prov som genereras av olika källor som båtar eller avloppsutsläpp 12. Filter används för provtagning organiskt kol med en nominell porstorlek av 0,8 pm, får inte utesluta all mikrobiell biomassa och shOuld därför ändras till 0.2 um filter för filtreringssteg. Vidare, detektionsgränser utgöra ett problem med närings prover; speciellt i oligotrof ytvatten runt många korallrev platser (t.ex. Cotner et al. 43). Detektionsgränserna är ungefär runt 0,1, 0,2, och 0,1 | amol / l för ammonium, nitrat och nitrit, och orto-fosfat respektive (se 36,12,37)
Mikroskopi
Bredvid variationer i koncentrationen av prov bildanalys från mikroskopi glider vidare ger potential för fel. Till exempel, kan bilderna bli oskarp i vissa delar av synfältet, och i fokus i andra. Som ett högrent aluminiumoxidmatris filtret är en mycket styv filtertypen kan eventuellt skräp under filtret orsaka att hela filtret för att sitta på en vinkel till objektglaset. Som ett resultat, kan bilderna konsekvent bli oskarp i olika delar av synfältet för ett givet filter, reOAVSETT mikroskop uppriktning. Återmontering filter, se till undersidan av filtret är rent, kan lindra detta om det konstateras. Också, i vissa fall kan det finnas två fokalplan där virus och mikrober kan hittas. Detta är resultatet av färgade objekt lossnar från filtret vid montering, och som flyter upp till undersidan av täckremsa som kan göra räknas otillförlitliga. Därför är det alltid rekommenderat att kontrollera kvaliteten på proverna under processen.
Flödescytometri
Såsom med mikroskopi prover, kan det finnas naturligt förekommande skillnader mellan flödescytometri prover som kräver justeringar av den analytiska processen. Till exempel, beroende på känsligheten hos instrumentet, kan svagt fluorescerande Prochlorococcus celler vara under brusnivån och kommer inte kvantifieras. Pärlor fungerar som en intern kontrollprov (t.ex. för att bekräfta att instrumentets response till fluorescerande signaler är konsekvent från dag till dag (och förblir stabil under körningen i sig). Om tillsätts till provet vid kända koncentrationer, kan de också tjäna som en intern kontroll för att kontrollera provvolymen loppet. Det rekommenderas att alltid köra en alikvot av en tidigare fryst "standard" havsvattenprov som tinas och färgas tillsammans med prover av intresse att ge ytterligare en biologisk kontroll för provhantering mellan 96-brunnar körningar. Beroende på platsen, kan havsvattenprover se väldigt olika varandra. Sortering "representativa" populationer och sedan tittar under en epifluorescent mikroskop (EM) kan vara ett bra sätt att snabbt kontrollera växtplankton populationer antingen Synechococcus sp. Eller foto eukaryoter. Prochlorococcus celler är vanligtvis inte syns under EM eftersom de bleknar för fort. Förutom klorofyll a, Synechococcus sp. Även innehålla photopigment phycoeurythrin (PE), som emitterar ljus vid kortare våglängder (540-630 nm) än klorofyll A (660-700 nm). När Synechococcus celler exciteras med blått / grönt ljus (470-490 nm), visas de gyllene om det betraktas i ett emissionsfilter som tar bort alla våglängder av ljus under 510 nm. Som jämförelse kommer den eukaryota fraktionen ser rött, när den exciteras med samma våglängd av ljus.
Virala metagenomiken
Det är viktigt att notera att processen för VLP koncentration och lagring påverkar samhället återvinns. Viral partikelförlust kan förekomma vid varje steg i processen, och därmed kan valet av virala renings- och anrikningsprotokoll slutligen påverkar den observerade taxonomisk sammansättning och mångfald av de resulterande virala metagenomes 44,45,18. Koncentration av prov kan göras med TFF 19 eller kemisk baserade flock 20. Inom den kemiska baserade metoden, posittivt laddade järnjoner binder de naturligt negativt laddade viruspartiklar som bildar stora (> 8 ^ m) järnviral komplex som flockas ur lösningen och kan återvinnas med hjälp av 8 um filter. Därefter järn kelateras av de virala partiklarna och åter-upplöstes med användning av magnesium, askorbinsyra och EDTA, lämnar koncentrerade virala partiklar för nukleinsyra extraktion 20. Efter att ha jämfört dessa två aktuella metoder, drog vi slutsatsen att järnkloridmetoden är mindre tidskrävande än TFF viruskoncentration, men kan ge några varningar. Vi fann att dissociering och upplösning av järn viral kräver ett två-faldigt mer koncentrerade magnesium-askorbinsyra-EDTA-lösning än vad som rapporterats 20 för att upplösning fortgå innan askorbinsyran bryts ned. Bortsett från denna fråga, renar protokollet viruspartiklar genom storleksfraktione ensam, ta bort mikrobiella föroreningar som använder 0,2 pm filtrering. Stora virus inte passera genom filter (t.ex. Yang et al. 46) och kommer således inte att upptäckas i metagenome, medan vissa bakterier göra (McDole, opublicerade data). Detta resulterar i bakterieangrepp samtidigt diskriminera stora virus.
Den specifika frågan är dock också relevant för att avlägsna mikrober i samband med TFF koncentration. Eftersom kloroform behandling har visat att avlägsna kloroform känsliga virus med yttre lipidmembran 47 vissa studier antyder att 0,22 | im filtrering kan användas för att avlägsna huvuddelen av bakterier. Det bör också noteras att den presenterade metoden riktar sig främst bakteriofag, den mest förekommande bärare av genetiskt material i marina miljöer. Eftersom fager allmänhet tänkte inte ofta innehåller lipider 48 de är mer motståndskraftiga mot kloroform behandling. Såvitt vi känner till finns inte en "catch-all" -metod hittills. Den metod som presenteras här är anpassad från our erfarenhet från fältet under de senaste 10 åren i olika marina miljöer som spänner tropiska till arktiska system.
Mikrobiell metagenomiken
Konstruktionen av metagenomic bibliotek för mikrober (dvs bakterier och arkéer) är enklare än virala metagenomes eftersom det är lättare att alstra de minimala DNA-koncentrationer som krävs för bibliotek beredning. Linker förstärknings hagelgevär bibliotek (LASLs) 17,49,50 och hela genomet förstärknings baserade på flera förskjutning förstärkning (MDA) är de två vanligaste metoderna för att generera tillräckligt med DNA för sekvensering. Användningen av MDA att erhålla högre DNA-koncentrationer i mikrobiella metagenomes är ibland nödvändigt. Detta kan dock orsaka artefakter i sekvensdata, såsom overamplification av dinoflagellater minicircles. MDA metoder är kända för att företrädesvis förstärka enkelsträngat och cirkulärt DNA, vilket resulterar i icke-kvantitativa resultat 51,52. De optimerade LASLs närmar 50 kan således fungerar som ett bättre alternativ för att förstärka både mikrobiell och viral metagenomic DNA för sekvensering. Det är viktigt att notera att den LASLs tillvägagångssätt har flera steg, kräver sofistikerad utrustning, och är begränsad till dsDNA-mallarna. Vidare har vävnaden DNA-extraktion kit visats att extrahera DNA från både grampositiva och gramnegativa phyla, men det har inte verifierats att effektivt lysera motsträviga mikrobiell taxa eller deras associerade strukturer (t.ex. viss arkéer, endosporer, eller svampsporer) . En pärla stryk steg kan därför vara nödvändigt att erhålla DNA från vissa mikrober.
Dessa omfattande utvärderingar kommer att leda till en bättre förståelse av virus och mikrobiell ekosystemens funktion. Även om få studier har åtagit ansträngningen för att bedöma alla föreslagna parametrar, många har undersökt utvalda. Al., Nelson et 53 föreslog en anslutning between specifik rev livsmiljöer och uttömning i både DOC och Bakteriekoncentrationerna i förhållande till öppet hav. Dessa förändringar koncentrations åtföljdes av olika differentieringar av Bakterie samhällen. Et al. Dinsdale 5 visade att ökad mänsklig påverkan åtföljdes av 10x högre bestånd av mikrobiella celler och virusliknande partiklar. Mikrobiella samhällen i marina vatten som omger bebodda öar hade också större fraktioner av heterotrofa och potentiella patogener 5. Slutligen McDole et al. 4 visade, genom att införa microbialization poäng, att mänskliga aktiviteter flyttar energi till mikroberna, på bekostnad av de macrobes. Dessa studier, inriktade på särskilda mikrobiella och vattenkemiparametrar, tillhandahålla nya insikter i den biokemiska strukturen i de marina ekosystemen. Kombinera traditionella uppgifter i ekosystemens övervakningsinsatser – som temperatur och pH-värden, fiskbiomassa och diversifieringty, bentiska omslag, eller exponering för mänsklig påverkan – med vattenkemi och mikrobiella bedömningar, sannolikt kommer att leda till mer känsliga för miljöövervakning insatser, vilket kan leda till mer specifikt riktade bevarandeåtgärder.
The authors have nothing to disclose.
We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) | Figure 1 | ||
Filtration setup | Figure 1 | ||
32 – 36 % Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Sci | A508-212 | |
High-density polyethylene (HDPE) container | e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid | ||
Combustion oven (550° C) | |||
60 ml HDPE vials | Fisher Sci | 02-896-2B | |
25 mm GF/F filter | Fisher Sci | 09-874-64 | |
Forceps | Fisher Sci | XX62-000-06 | |
Sterile, non-powdered gloves | Fisher Sci | 19-170-010B | |
Bilge pump | e.g., Thirsty Mate 124PF | ||
20 l collapsible low-density polyethylene carboy | e.g., Reliance Fold A Carrier II | ||
Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges | Amersham | CFP-2-E-9A | |
Platinum-cured silicon tubing for TFF | Cole Parmer | 96440-82 | |
Hose clamps | Cole Parmer | P-68007-23 | |
Peristaltic pump | Cole Parmer | EW-77410-10 | |
Sodium hydroxide (NaOH) solution | Electron Microscopy Sciences | 21162 | |
0.2 µm polycarbonate Track-Etched Membrane filter | Fisher Sci | 09-300-61 | |
8.0 µm polycarbonate Track-Etched Membrane filter | Fisher Sci | 09-300-57 | |
0.22 µm polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVGP01050 | |
0.45 µm polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVHV010RS | |
Synthetic nylon mesh | Sefar | 03-125-37 | |
20 ml plastic scintillation bottle | Fisher Sci | 03-341-72C | |
Clean bucket (10 – 20 L) | |||
32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15714 | |
25 % glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16220 | |
Liquid Nitrogen | |||
0.02 µm high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6002 | |
0.2 µm high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6022 | |
10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain | Invitrogen | S11494 | |
DAPI solution 25 µg ml-1 | Invitrogen | D1306 | |
Molecular grade water | sigma aldrich | W-4502 | |
Ascorbic Acid | Fisher Sci | BP351-500 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Sci | BP399-500 | |
Glycerol | Fisher Sci | G31-500 | |
Microscope slide | Fisher Sci | 12-550-123 | |
Coverslip | Fisher Sci | 12-548-5M | |
Delicate task wipe | Fisher Sci | 06-666A | |
Slide Station with vacuum pump | Figure 3 | ||
DNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.1 | Nucleospin tissue kit |
Proteinase K (20 mg ml-1) | Lifetechnologies | AM2546 | |
200-proof 100% Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15058 | |
Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | EW-45503-88 | |
Cesium chloride (CsCl) | Fisher Sci | bp1595-500 | |
60 ml syringe | Fisher Sci | 13-6898 | |
0.02 µm alumina matrix disposable syringe filter | Fisher Sci | O992613 | |
Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
Ultra – swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 333790 | SW41 Ti Rotor |
DNase I (100 u µl-1) | Calbiochem | 260913 | |
0.5 M EDTA | Fisher Sci | BP2482-500 | |
Formamide | Fisher Sci | BP228-100 | |
Glycogen | sigma aldrich | G-1767 | |
100 % Ethanol (200-proof) | Electron Microscopy Science | 15058 | |
1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0 | Fisher Sci | BP2473-500 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Sci | 02674-25 | |
20 μg ml-1 Proteinase K | Fisher Sci | BP1700-500 | |
Chloroform | Fisher Sci | BP1145-1 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | sigma aldrich | p3803 | |
Isopropanol | Fisher Sci | BP2618-500 | |
50ml Oak Ridge Tube | Fisher Sci | 05-562-16B |