Lokalisering, Identifikasjon, og Eksisjon av murine adipose depoter

Summary

På grunn av den drastiske og negativ sammenheng mellom fedme og andre samtidige sykdommer, forskning på rollen adipose spiller i sykdom og generell helse er berettiget. Vi presenterer en protokoll for isolering og fjerning av fettdepoter som åpner for studiet av adipose ved hjelp av in situ og in vitro metoder.

Introduction

Adipose gjort en bemerkelsesverdig opptreden i medienes søkelys på grunn av fedme dramatiske økning i løpet av de siste tiårene i det 20. århundre. Fedme påvirker i dag mer enn en tredjedel av voksne og 17% av barn og unge i ^en USA (US). Spenner over alle etniske grupper, har statistisk forskning rundt fedme-epidemien vist at ikke-spanske svarte har den høyeste aldersjustert rate av fedme (49,5%) sammenlignet med meksikanske amerikanere (40.4%), alle latinamerikanere (39,1%), og ikke- Hispanic hvite (34,3%) ^2. Den økonomiske effekten av fedme er også en økende bekymring for helsevesenet. I 2012 ble det anslått at den årlige medisinske kostnadene for omsorg for fedme i USA i 2005 var $ 190 200 000 000, nesten 21% av den totale medisinske utgifter budsjett. Dessverre ble barndommen fedme anslått til å være ansvarlig for $ 14 milliarder i direkte medisinske kostnader alene. Statistisk sett, ble det fastslått at den gjennomsnittlige medisinsk kostnadenepersoner med fedme var $ 2741 høyere i året enn de uten denne sykelighet ^3-5.

Fedme er en viktig risikofaktor for en rekke forhold som: type 2 diabetes, dyslipidemi, hjerte- og karsykdommer, kreft, muskel- og skjelettlidelser og kroniske betennelser. Fedme er dypt knyttet til patogenesen av metabolsk syndrom og andre kroniske sykdommer ^6-8. Med slike drastiske og negative sammenhenger mellom fedme og andre samtidige sykdommer, vitenskapelig forskning har fokusert oppmerksomhet for å bedre forstå den nåværende epidemien og de varierte og sentrale rollene spilles av adipose.

Historisk ble fettvev anses ubetydelig, og ble vist bare som en enkel fylling vev. Foreløpig har adipose vist seg å spille mange viktige roller i kroppens funksjon i: stoffskifte, hormonregulering, betennelse, beskyttelse og isolasjon ^9. Fettvev består hovedsakelig avadipocytes men inneholder også pericytes, endotelceller, monocytter, makrofager og pluripotente stamceller ^8. Fettvev er fordelt over hele kroppen i forskjellige depoter. De viktigste depoter kan bli funnet subdermalt, subkutant, intramuskulært, og viscerally ^10. Adipose depoter har vist seg å ha depot spesifikke metabolske profiler, som har vist et depot spesifikk følsomhet overfor fedme og relaterte forstyrrelser ^8.

Tradisjonelt har fettvev blitt klassifisert i to hovedtyper: hvit fettvev (WAT) og brunt fettvev (BAT); selv om nyere litteratur indikerer tilstedeværelsen av en tredje gruppe døpt brite eller beige adipose ^11. Fettvev har vist seg å ha forskjellige farger, morfologi, metabolske funksjoner, biokjemiske og genetiske egenskaper mønstre av uttrykket ^10. Adipocytter i WAT har en enkelt, stor oljedråpe, og variable mengder av mitokondrier. WATer dominant funnet i subkutane og viscerale lokaliteter av kroppen. WAT fungerer primært som et åsted for energilagring og orgel beskyttelse. Adipocytter i BAT har en multilokulær morfologi og rikelig mitokondrier. BAT ligger hovedsakelig i halsen og store blodkar av thorax, samt scapulae ^12. BAT primært funksjoner i energiKrevende atferd som regulerer thermogenesis ^7. Brite eller beige adipose har vist seg å dele en analog morfologi og uttrykk til BAT, men har blitt funnet å være stammer fra hvite adipocytter ^11.

Den beskrevne kirurgiske metoden i dette manuskriptet gir forskere med kapasitet til å analysere ulike effekter som faktorer som: miljø, legemidler, og genetikk, har på adipose; samt gunstig eller ugunstig rolle adipose spiller i sykdom og generell helse. Også, som gir en måte for å identifisere og isolere forskjellige typer av fettvev itillate for bedre å forstå av de biokjemiske relasjoner og forskjeller mellom depoter. Dette kan hjelpe til å bestemme forholdet mellom plasseringen, funksjon og typer av fett i kroppen. Denne beskrevne fremgangsmåte oppnår dette ved å tilveiebringe midler for grov visualisering, genekspresjonsanalyser, proteinekspresjon analyse, histologisk undersøkelse, og isolering av primære cellelinjer for in vitro studier. For tiden er det mange artikler som gir innsikt i den metabolske oppførsel av forskjellige adipose depoter, samt deres anatomiske steder; men gir ikke en grundig metoden på hvordan du spesifikt lokalisere, identifisere og isolere disse depoter. Denne kirurgiske metoden gir en teknikk som gjør det mulig nøyaktig for isolasjon av multiple depoter med en minimal mengde av disseksjon og kontaminering sammenlignet med andre metoder utviklet for isolatet av en eller to depoter ^13-14.

Målet med denne protokollen er å gien nøyaktig metode for identifisering og isolering av forskjellige typer fettdepoter fra flere anatomiske steder.

Protocol

MERK: Alle dyr prosedyrer ble utført med godkjenning av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Cincinnati og i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr fra National Institutes of Health (NIH Publication Ingen . 85-23, revidert 1996).

1. Avlive og Steriliser Mouse

1. Plasser musen i en dropbox inneholder en supratheraputic dose av isofluran og tillate å inhalere til effekt. Når musen avlives, fjerne fra boksen.
2. Cervically forrykke som en andre middel for aktiv dødshjelp.
3. Steril den ytre overflate av mus ved rensing av dyret med 70% etanol.

2. Identifisering og Isolering av tre forskjellige adipose depoter

1. Brunt fettvev (BAT) Isolasjon:
   1. Pass på at pelsen er våt fra alkohol rensing for å hjelpe til med å skjære gjennom epidermal og dermal layers.
   2. Plasser musen i liggende stilling med ryggen mot bordet.
   3. Ta tak i huden like under mellomgulvet med pinsett, heis og innsnittet med saks.
   4. Kuttet på tvers rundt omkretsen av musen for å eksponere peritoneum.
   5. Avslør sommerfugl-formet BAT depot ved degloving den øverste halvdelen av musen. Hold nedre vedheng og magen i den ene hånden og dra huden opp mot hodet.
   6. Orientere mus, slik at den er plassert liggende på bordet. Vær forsiktig med å forurense den eksponerte depot med hår.
   7. Rene kirurgiske instrumenter og endring til en frisk par hansker.
   8. Finn scapulae og tilhørende depot. Fjern forsiktig eventuelt overfladisk hvit adipose oppå butterfly og deretter dissekere sommerfugl av interscapular brunt fett. Vær forsiktig for å unngå muskel nært knyttet til brunt fett.
      MERK: Bruken av en disseksjon mikroskop er anbefalt for fjernelse av white adipose, så vel som i separasjonen av brunt fettvev fra scapulae.
   9. Fjerne fett depot og overføre til en 2 ml mikro tube.
   10. Hvis RNA eller proteinet som skal utvinnes, fryse vevet ved nedsenking i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. Fryse prøven samtidig for å hindre nedbrytning. Hvis dyrking, dekker vevet i DMEF-12 og satt på is til alle prøvene er samlet for kultur (supplerende informasjon).
2. Isolering av Subkutan fettvev (SQ), en hvit fettvev Depot (WAT):
   1. Sett på et nytt par hansker som å ikke kryss-forurense mellom fettdepoter.
   2. Avslør lyske, trekantede SQ depoter av DE-gloving den nederste halvdelen av musen. Å holde de øvre lemmer og thorax i den ene hånden og trekke huden ned mot føttene med den andre hånden.
   3. Orientere mus i en liggende stilling mens være forsiktig med å forurense den eksponerte depot med hår.
   4. Ren surgical instrumenter og endring til en frisk par hansker.
   5. Nøye dissekere trekanter av SQ fett. Vær forsiktig med å forurense prøven med muskler, nabo fett, brystkjertlene eller ved å kutte noen fartøy og forurense prøven med blod.
      MERK: Bruk av en disseksjon mikroskop anbefales hvis grensene ikke er klart definert.
   6. Fjerne fett depoter og overføre til 2 ml mikrosentrifugerør.
   7. Hvis RNA eller proteinet som skal utvinnes, fryse vevet ved nedsenking i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. Fryse prøven samtidig for å hindre nedbrytning.
   8. Til farging, fikse eller bygge inn i oktober Hvis dyrking, dekker vevet i DMEF-12 og satt på is til alle prøvene er samlet for kultur (supplerende informasjon).
3. Isolering av gonader Fat en Visceral fettvev (MVA) og Hvit fettvev (WAT) Depot:
   1. Sett på et nytt par hansker som å ikke kryss-forurense mellom fettdepoter.
   2. Med scissors, kuttet peritoneum tvers, rett under mellomgulvet. Skjær bukhinnen fra mellomgulvet til rektum midten coronally å utsette abdominal organer.
   3. Finn testiklene eller eggstokkene og identifisere den vedlagte hvitt fettvev, kjent som epididymal adipose hos menn eller gonadal adipose hos kvinner.
   4. Rene kirurgiske instrumenter og endring til en frisk par hansker
   5. Nøye dissekere både bitestiklenes fettdepoter fra testiklene, bitestiklene, og vasa deferentia. Eller hvis kvinnelig, nøye dissekere både gonadale fett pads fra eggstokkene.
   6. Fjerne fett depoter og overføre dem til 2 ml mikrosentrifugerør.
   7. Hvis RNA eller proteinet som skal utvinnes, fryse vevet ved nedsenking i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. Fryse prøven samtidig for å hindre nedbrytning.
   8. Til farging, fikse eller bygge inn i oktober Hvis dyrking, dekker vevet i DMEF-12 og satt på is til alle prøvene er samlet for kultur (supplerende informasjon).

   3. Isolering av perivaskulære fettvev (PVAT)

   1. Isolering av hjertet:
      1. Lå muse ut i liggende stilling med øvre og nedre vedheng utvidet utover.
      2. Sikre vedheng som bruker kirurgisk tape.
      3. Når du har plassert muse som er nevnt ovenfor, skape spenning ved å løfte opp på xiphoid prosessen med pinsett. Skjær horisontalt gjennom membranen, utsette den nedre del av brystkassen.
      4. Samtidig opprettholde strekk, ved å løfte opp xifoid prosessen, skjære gjennom brystkasse overlegent mot hodet, like ved siden av brystbenet.
      5. Plukk opp brystkassen bare dårligere til krageben, og kutt langs dårligere lengde av krageben ut mot armhulen i begge retninger. Brysthulen og dens innhold (hjerte, lunger, etc.) skal nå være godt synlig.
      6. Rengjør brysthula av overflødig blod og væske ved hjelp av steril gauze å absorbere væsken. Hvis samle organer eller fartøy være sikker på å overdådig (supplerende informasjon).
      7. Når området er ryddet av væske, skåret i bronkiene og feste fartøy for å fjerne lungene, noe som gir bedre eksponering av hjertet.
   2. Lokalisering og Eksisjon av aortic perivaskulære fettvev (PVAT):
      1. Fjern følgende organer som å bedre identifisere de mindreverdige deler av aorta: lever, mage, milt, bukspyttkjertel, tarmer, og tykktarm.
      2. Først starter med identifikasjon av magen og spiserøret. Skjær i spiserøret ved gastro-øsofageal krysset for å frigjøre magen fra kroppen.
      3. Deretter identifisere tarmen og den omkringliggende mesentery. Skjær overfladisk gjennom mesentery, som den ligger svært tett til nedsatt del av aorta, deretter "kjøre tarmen."
      4. Skjær kolon fri så nær endetarmen som mulig. Således frigjør mage, tarm og tykktarm fra mus.
      5. Rebevege mage, tarm, tykktarm, pankreas og milt ved å skjære gjennom feste mesenteriet og fartøy. Bukspyttkjertelen og milten bør komme gratis med magen, tarmen og kolon.
      6. Fjern leveren ved å kutte gjennom lever årer og feste mesentery, fjerne alle fliker.
      7. Skjær bort visceral lag og fett surround nyrene. La nyrene festet til aorta in vivo for å tjene som geografiske markører for forskjellige segmenter av aorta.
      8. Skyll området med steril 1x PBS og fjerne all væske ved absorpsjon med en steril kompress.
      9. Ved hjelp av mikro saks og mikro tang, skille aorta fra sin rygg vedlegg til ryggraden og dens ventral vedlegg til spiserøret.
      10. Isoler aorta ved å følge og løsne aorta lengden av den nedadgående aorta fra origo i hjertet til forgreningen i iliaca regionen.
      11. Identifisere og isolere subclavia fartøy. Isolere disse fartøyenefra nakken til aortarot å bedre eksponere aortic krysset og rot i hjertet.
      12. Fjern thymus deretter kutte brachiocephalic arterie, den venstre felles halspulsåre og venstre subclavia, slik at bevegelsen av hjertet.
      13. Med hjelp av en disseksjon mikroskop, se perivaskulær fettvev (PVAT) lag rundt aorta.
      14. Tar stor forsiktighet for å ikke klemme eller presse PVAT dra forsiktig i PVAT vei fra aorta med mikro tang. Forsiktig kuttet feste av PVAT til aorta med mikro saks starter ved thorax-regionen like overlegne i forhold til hvor membranen er plassert.
          MERK: En disseksjon mikroskop anbefales.
      15. Gjenta denne fremgangsmåten hele lengden av aorta, etterbehandling ved infrarenale aorta-regionen, som er lokalisert like overlegne i forhold til hofte forgreningen av aorta fartøyet.
      16. Hvis aortabuen PVAT er ønskelig, brukes den samme fremgangsmåten for å fjerne PVAT fra mindre curvature av buen.
      17. Plasser PVAT prøvene i 2 ml mikrosentrifugerør (e).
      18. Hvis RNA eller proteinet som skal utvinnes, fryse vevet ved nedsenking i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. Fryse prøven samtidig for å hindre nedbrytning. Hvis dyrking, dekker vevet i DMEF-12 og satt på is til alle prøvene er samlet for kultur (supplerende informasjon).
          MERK: Ytterligere adipose depoter for å vurdere om interessert i et omfattende adipose depot analyse inkluderer: retroperitoneal, mesenterisk, oment, perikardvæske og popliteal.

Representative Results

Identifikasjon og lokalisering av lyske subkutan adipose, interscapular brun adipose, visceral epididymal adipose (figur 1), samt aortabuen perivaskulær adipose, thorax aortic adipose, suprarenal aortic adipose og infrarenale aorta adipose (figur 2) ble oppnådd med hell bruker den beskrevne kirurgiske metoden. Histologisk undersøkelse og differensiering mellom BAT og WAT prøver ble positivt evaluert ved hjelp Hematoxylin og eosin (H & E) farging (figur 3). Analyse av RNA-nivåer av adiponectin (AdipoQ), peroksisomproliferator-aktivert reseptor gamma (PPAR-γ), celledød-induserende DFFA lignende effektor en (CIDEA), og andre fett spesifikke markører ble målt for alle de ovennevnte isolerte og skåret depoter (data ikke vist).

Primære cellelinjer av subkutane adipocytter og perivaskulære adipocytes ble dyrket og differensiert fra preadipocyte s til adipocytter hell for microarray analyse. De dyrkede preadipocytes konverteres til adipocytter ble bekreftet med Oil Red O farging (figur 4). Vellykket isolasjon, kultur og differensiering av adipocytter ble oppnådd for bruk i in vitro-studier, og protein aktivitet ble vellykket målt. Enzymatisk aktivitet av matriks metaloprotease-2 (MMP2) ble målt i en behandlingsgruppe sammenlignet med kontrollgruppen. Aktiviteten av MMP2 ble målt in situ i en primær perivaskulær adipocytt linje via zymografi (figur 5).

Figur 1. Anatomiske steder av C57BL / 6 mannlige mus adipose depoter. (A) interscapular brun adipose fett depot. (B) Lyske subkutan adipose fett depot. (C) Visceral epididymal adipose fett depot.w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Anatomiske steder av PVAT depoter i en C57BL / 6 hannmus. (A) aortabuen perivaskulær adipose depot. (B) Thoracic aorta perivaskulær adipose depot. (C) Suprarenal aorta perivaskulær adipose depot. (D) infrarenale aorta perivaskulær adipose depot. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. H & E farging av BAT og WAT adipose. (A) H 8; E farging av Paraformaldehyde fast, parafin innebygd C57BL / 6 hannmus prøve av WAT adipose på en 40X forstørrelse (B) H & E farging av Paraformaldehyde fast, parafin innebygd C57BL / 6 hannmus prøve av BAT på en 40X forstørrelse.. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Olje Red O farging av dyrkede PVAT preadipocytes og adipocytter. (A) Olje Red O farging av dyrkede aorta perivaskulære preadipocytes ved baseline av differensiering på 20X forstørrelse med fasekontrast. (B) Olje Red O farging av dyrkede aorta perivaskulære adipocytes etter fem dager med differensiering på 20X forstørrelse med fasekontrast.es / ftp_upload / 52174 / 52174fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Zymografi av differensierte adipocytter, isolert fra perivaskulær fettvev, viste en redusert aktivitet av MMP2 frigjøres etter behandling sammenlignet med ubehandlede (kontroll) celler, * P <0,01 sammenlignet med kontroll.

Discussion

Fedme kan føre til en stor mengde tilleggslidelser og full forståelse av rollen som adipose spiller er ikke fullt ut forstått; derfor fortsatt forskning på feltet adipose er nødvendig. Dyremodeller, spesielt murine modeller er ideelle for innledende forskning i utviklingen av sykdommer og testing av potensielle farmasøytiske behandlinger. Ved bruk av disse modellene, nøyaktig isolering og fjerning av fettdepoter er en ekstremt viktig og nødvendig verktøy i studiet av patologien til adipose påvirket sykdommer.

I nåværende litteratur angående fettdepoter, det er en betydelig mengde litteratur angående metabolske oppførsel og variasjon mellom fettdepoter, så vel som deres anatomiske steder. Men det er få som gir en grundig metoden på hvordan du spesifikt lokalisere, identifisere og isolere disse depoter. Basert på gjennomgang av dagens isolasjonsmetoder adipose, er det en liten undergruppe av protokoller tlue gi metodikk for hvordan å isolere en eller to depoter på en gang. Men en nøyaktig teknikk som gjør det mulig for isolasjon av multiple depoter med en minimal mengde av disseksjon og forurensninger, samt omhandler ulike fremgangsmåter for å studere de prøver samlet er karakteristisk for denne protokollen ^13-14.

I denne metoden, er det flere trinn som er av vital betydning for isolering og renhet av prøven. Rengjøring verktøy, hansker og overflater ofte for å fjerne hår og forurensninger er en viktig skritt for å unngå depot forurensning. Når du kutter huden tvers rundt omkretsen av musen til å eksponere peritoneum for degloving, er det viktig å unngå å kutte for dypt. Skjære peritoneum vil gjøre degloving svært vanskelig og vil øke muligheten for forurensning av prøven. Når excising de SQ adipose depoter er det viktig å identifisere de trekantede grensene for depot før excising noen av annonsenipose. I tillegg bør forsiktige kutt gjøres for å unngå muskel, og tilstøtende fartøy, kjertler og adipose. Dette vil hindre forurensning av prøven fra alternative adipose, kjertelvevet, muskler eller blod.

Den viktigste begrensning for isolering og fjerning av fettdepoter, i denne metoden, og andre sammenlignbare fremgangsmåter kan finnes i definering av grensene for visse depoter. På grunn av de uklare grenser i depoter, slik som subkutane depoter, kan isolasjon mangler en liten mengde forurensning fra nabo adipose være utfordrende. En annen begrensning kan bli funnet i å sikre nok vev samles for supplerende eksperimentering i vaskulære forbundet depoter. Denne begrensning krever noen ganger samkjøring av prøvene, selv om dette er avhengig av området av isolasjon og dietten i forbindelse med dyr.

Etter adipose depoter er isolert, kan de benyttes for en rekke analyser. Adipose kan være brukd for molekylære studier som protein uttrykk, enzymaktivitet og analyse av genuttrykk. I tillegg kan man isolere adipocytter for primær cellelinje in vitro studier. Udødeliggjorte cellelinjer kan også anvendes for in vitro-studier, men udødelige celler er ikke så troverdig som primære isolerte cellelinjer. Endelig kan det adipose være fast eller frosset i oktober for histologisk undersøkelse for å identifisere leukocyttinfiltrering, protein lokalisering, samt karakterisering av adipocytt-morfologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% Ethanol	Fisher	07-678-001
DMEF-12	Sigma Aldrich	D-6421	Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes	Midsci	MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK