Protocol
1. Hydra Cultura e misura della risposta alimentazione
- Mantenere polipi idra in coltura somministrando loro giornalmente con artemia e tenerli in un mezzo (buffer 1 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 0.1 mM KCl, e 0,1 mM MgSO4) contenuta in un ciotola di vetro a 18 ° C in 12 hr luce-12 hr cicli scuri come descritto in precedenza 12.
- Per misurare la risposta di alimentazione, trasferire matura polipo Hydra avere da 5 a 6 tentacoli di un unico pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Rimuovere la quantità residua dal pozzo inclinandolo, e quindi aggiungere immediatamente 500 ml di terreno fresco.
- Preparare la soluzione glutatione 9 micron di media idra. Poiché la soluzione glutatione è incline all'ossidazione, utilizzare sempre soluzione glutatione appena preparata per ciascun esperimento.
- Trasferire la piastra alla piattaforma di imaging di un microscopio avente disposizioni per la registrazione di immagini. Utilizzare uno sfondo scuro in modo tale che il comportamento of polipo Hydra è chiaramente ripreso sullo sfondo contrastante.
- La sala utilizzata per l'osservazione e l'imaging del comportamento di idra privo di luci di intensità fluttuante, correnti d'aria e rumore. Tali disturbi possono anche causare il polipo idra per mostrare la contrazione dei tentacoli - anche in assenza di glutatione.
- Lasciare che il polipo per rilassarsi per 5 minuti.
- Assicurarsi che il polipo si trova lungo la regione centrale del pozzo in modo che il comportamento può essere ripreso in modo chiaro. Se il polipo è al bordo del pozzo, portarlo al centro irrigando il mezzo con una pipetta e ancora permettergli di rilassarsi.
- Scattare una foto di idra nello stato di rilassamento. Questo sarà il punto di osservazione zero tempo.
- Aggiungere rapidamente 9 mM soluzione glutatione per raggiungere una concentrazione finale di 3 micron nel pozzo. A seconda dello scopo dell'esperimento e la risposta dimostrato da idra, testare una gamma di diverse concentrazioni di glutatione e chooSE la concentrazione appropriata richiesta.
- Avviare il timer immediatamente dopo l'aggiunta di soluzione di glutatione e catturare immagini dopo ogni 15-30 secondi per 4-5 min. Non modificare le impostazioni di ingrandimento durante il time-lapse imaging.
- Aggiungere la soluzione glutatione delicatamente e con un flusso uniforme tale che la posizione dell'animale nel pozzo sarebbe minimamente disturbato nel campo visivo del microscopio. Tuttavia, se il polipo muove ampiamente dopo l'aggiunta di soluzione di glutatione, spostare la piastra delicatamente per portare il polipo nel campo di vista per la cattura delle immagini.
- Nell'esperimento di controllo, utilizzare mezzo privo glutatione mantenendo tutti gli altri parametri identici.
- Assicurarsi di eseguire tutte le fasi sperimentali di cui sopra durante la prima metà della giornata - prima di 1:00 per evitare il possibile effetto del ritmo circadiano del grado di risposta di alimentazione.
- Aprire ciascuna delle immagini acquisite utilizzando il GNU Image Manipulation Program (GIMP). Utilizzare lo strumento "Misura" disponibile dal Menu> Strumenti> Misura per determinare la distanza tra l'estremità apicale di ciascuno dei tentacoli e ipostoma. Se l'apertura della bocca è osservata in qualsiasi delle immagini, determinare la distanza tra il centro della bocca aperta e l'estremità apicale del tentacolo. Fare riferimento a questa distanza come la diffusione tentacolo.
- Calcolare lo spread medio tentacolo per ogni polipo prima e dopo l'esposizione glutatione. Calcolare il rapporto di spread medio tentacolo al punto zero tempo a quella in ciascuno dei successivi punti temporali. Questo rapporto si chiamerà relativa diffusione tentacolo.
- Ripetere le misurazioni per almeno 20 polipi.
2. Metodo di convalida utilizzando ilLa fame Modello
- Per fame, trasferire alcuni polipi Hydra in una ciotola di vetro separata e non dar loro da mangiare per 5 giorni. Inserire il gruppo di controllo di alcuni polipi al giorno con Artemia in una ciotola di dimensioni simili. Modificare il supporto sia sperimentale ciotole giorno per evitare la crescita di funghi nel mezzo.
- Il giorno dell'esperimento, alimentare il gruppo di controllo di idra con artemia per 1 ora e utilizzare questi hydra per gli esperimenti successivi dopo aver rimosso tutti artemia non consumati e morti dal mezzo.
- Misurare la risposta alimentazione del idra fame in confronto con l'idra dal gruppo di controllo con il metodo descritto in precedenza al punto 1. Per evitare qualsiasi distorsione dovuta al tempo di osservazione, alternare le misurazioni di ciascuno degli fame e controllare polipi idra.
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Representative Results
Glutatione provoca idra esporre arricciamento dei tentacoli verso la bocca al fine di inghiotte la preda. Tale arricciatura di tentacoli porta estremità apicale dei tentacoli più vicino alla ipostoma. Ciò comporta la riduzione dello spread tentacolo, o la distanza lineare tra l'estremità apicale del tentacolo e ipostoma (Figura 1). La diffusione tentacolo relativa, o il rapporto tra tentacolo media si sviluppa prima e dopo l'aggiunta di glutatione, la media su più polipi riduce nel tempo. La diffusione tentacolo relativo dopo aggiunta del mezzo privo glutatione, tuttavia, riduce solo transitoriamente e raggiunge valore unitario in circa un minuto (Figura 2). La fame è noto per provocare valorizzazione del comportamento alimentare indotta dal glutatione 1,13. Il metodo di misurazione del comportamento alimentare descritto è stato convalidato dal modello fame. Il tentacolo si diffuse un minuto dopo l'aggiunta di glutatione era significantly inferiore per il gruppo fame rispetto al gruppo sazi (p = 1 x 10 -16 applicando due test t coda con uguale varianza) (Figura 3).
Figura 1: Metodo di misurazione spread medio tentacolo. L'immagine di un polipo idra rilassata stata registrata prima di aggiungere GSH e la distanza lineare tra la bocca e la fine di ogni apicale del tentacolo del polipo è stata misurata in termini di numero di pixel con lo strumento GIMP. Un'altra immagine è stata catturata dopo l'aggiunta di GSH e la diffusione tentacolo è stata misurata in modo simile.
Figura 2: Quantificazione della risposta alimentazione GSH indotta a Hydra. Tentacle diffuse in diversi punti temporali dopo l'aggiunta di GSH è stata misurata come descritto in figura 1 e relativa diffusione tentacolo indicato come rapporto di tentacolo sviluppa prima e dopo l'aggiunta di GSH (n = 14). I valori per il gruppo di controllo rappresentano la diffusione tentacolo relativo dopo aggiunta del mezzo idra senza GSH (n = 14). Errori barre rappresentano ± SEM.
Figura 3: Validazione del metodo di quantificazione della risposta di alimentazione utilizzando il modello fame. Asse X rappresenta il tempo dopo l'aggiunta di 3 mM GSH per affamate (n = 61) e sazi (n = 66) gruppi.
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Discussion
Comportamento alimentare in idra rappresenta uno dei sistemi chemosensoriali più ancestrali dei metazoi. Sebbene la presenza di GSH nel fluido crostaceo rilasciato dopo la cattura la preda nematocisti-assistita è stato rilevato da tempo 1, né la proteina GSHR né le putativo gene codifica / s sono stati caratterizzati da idra ad oggi. Alcuni tentativi sono stati fatti per caratterizzare GSH proteine leganti in idra 8, 14, 15. Tuttavia, l'identità di queste proteine recettori putativi rimane altri componenti molecolari oscure e pochissimi, che possono contribuire alla reazione di alimentazione, sono stati segnalati data 16, 17. L'unico caratterizzato GSHR nel regno animale è da 18 pesci rossi. Tecniche classiche, come l'utilizzo degli inibitori delle varie proteine della cascata di segnalazione GPCR e le tecniche di biologia molecolare avanzate (RNAi mediato silenziamento genico e CRISPR-Cas9 mediata modifica del genoma), in grado di fornire powstrumenti erful per l'identificazione dei componenti molecolari del GSH cascata di segnalazione a Hydra. La lettura punteggio assegnabile di tale espressione alterata e la funzione del recettore e gli altri componenti della segnalazione GSH sarebbe alterata comportamento alimentare. Era pertanto indispensabile escogitare un metodo per misurare la risposta di alimentazione in idra indotta da GSH.
Fenotipicamente, la risposta alimentazione comporta arricciamento dei tentacoli verso la bocca e la successiva apertura della bocca. Utilizzando la prima osservazione abbiamo sviluppato un metodo semplice e robusta della quantificazione del comportamento alimentare che coinvolge misurando la distanza tra le estremità apicali tentacolo e la bocca. È essenziale (1) utilizzare la soluzione GSH appena preparata, (2) utilizzare la concentrazione appropriata di GSH, e (3) effettuare l'esperimento in laboratorio avente intensità luminosa uniforme e privo di forti correnti d'aria per ottenere la misura riproducibile del GSH-sociod comportamento alimentare. Alimentazione comportamento di risposta simile potrebbe anche essere fisicamente indotta semplicemente aggiungendo mezzo privo GSH. Tuttavia, tale comportamento è transitorio e non evidente dopo 15-30 sec. Pertanto, è stato necessario includere questo controllo nell'esperimento e misurare la risposta alimentazione solo dopo che la reazione causata dal disturbo meccanico è completamente cessato. Per minimizzare la variazione della perturbazione indotta meccanica contrazione tentacular causata da portata variabile con cui viene aggiunta una soluzione glutatione, sarebbe anche fattibile sostituirli erogazione manuale della soluzione campione con un dispositivo meccanico come descritto in precedenza 19. Erogazione meccanizzato di soluzione di glutatione consentirebbe un maggiore controllo della grandezza e l'orientamento di stimolo meccanico tale da poter essere uniforme in tutti gli eventi di erogazione e quindi normalizzata internamente.
In questo metodo, la diffusione tentacolo è misurato attraverso due dimensioni; mentre in realtà, alcuni dei tentacoli sono sparsi anche lungo il terzo asse che punta verso l'osservatore. Analogamente, l'orientamento dei tentacoli può cambiare dopo l'aggiunta di glutatione. Tuttavia, con una media tentacolo sviluppa su più tentacoli di un singolo polipo nonché attraverso più polipi normalizza la distorsione introdotta da misurazioni bidimensionali nonché l'orientamento mutato tentacoli. Suggeriamo che i polipi che si muovono per l'estrema periferia del pozzo, dove chiara osservazione dei tentacoli non è sempre possibile, essere esclusi dall'analisi. Inoltre, prendendo la diffusione tentacolo relativa, che è il rapporto di tentacolo sviluppa prima e dopo l'aggiunta di GSH, e non il valore assoluto della diffusione tentacolo dopo il trattamento GSH, come misura della risposta alimentazione potrebbe causare la minimizzazione della variazione indotta dalla variabilità nella lunghezza tentacolo dei singoli polipi. Questo protocollo di misurare la feedi glutatione indottarisposta ng potrebbe essere ugualmente utile per tutte le specie di Hydra. Per misurare la diffusione tentacolo nelle immagini ottenute da grandi popolazioni di idra, sarebbe anche possibile scrivere un algoritmo simile a quelli disponibili per l'analisi del comportamento animale 20.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooled Incubator | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Microscope | Leica | S8AP0 | |
| Camera for the microscope | Leica | EC3 | |
| Reduced glutathione | Sigma | G4251 | Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation |
| Image editing program | GIMP | Version 2.8 |
References
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