Protocol
摂食応答1.ハイドラ文化と測定
- アルテミア毎日それらを供給し、中に含まれる培地（1mMのTris-HCl緩衝液、pHは7.6、1のNaCl、1mMのCaCl 2、0.1mMのKClと0.1mMのMgSO 4）し、それらを保持することにより、培養中ヒドラポリープを維持12時間明、12時間暗サイクルの下で18℃、ガラスボウル12前述したように。
- 摂食応答を測定するために、一つは24ウェルプレートの1ウェルに5~6触手を有するヒドラポリープ成熟移す。それを傾けることによってウェルから残留培地を除去した後、すぐに新鮮な培地500μlを加える。
- ヒドラ培地中の9100μMのグルタチオン溶液を調製する。グルタチオン溶液は酸化されやすいので、常に各実験のために新たに調製したグルタチオン溶液を使用する。
- 画像記録のための条項を持つ顕微鏡のイメージングプラットフォームにプレートを転送します。行動oは、そのような暗い背景を使用してくださいfはヒドラポリープは明らかに対照的な背景に画像化することができる。
- 部屋は観察し、変動強度、空気流及び騒音の光からヒドラフリーの挙動を撮像するために使用される。でも、グルタチオンが存在しない場合に - このような妨害はまたヒドラポリープは触手の収縮を示すことが原因となることがあります。
- ポリープは5分間リラックスすることができます。
- ポリープは行動が明確に画像化することができることをよくかかるの中心領域に沿って配置されていることを確認してください。ポリープはウェルの端にある場合には、ピペットを用いて培地をフラッシュすることによって、中心に持ってきて、もう一度それがリラックスすることができます。
- リラックスした状態でヒドラのイメージをキャプチャします。これは、ゼロ時点で観察されます。
- 迅速にウェル内に、3μMの最終濃度に到達するために9μMグルタチオン溶液を加える。実験の目的及びヒドラで示される反応に応じて、グルタチオンおよびチュウの異なる濃度範囲を試験必要とされる適切な濃度のSeを示す。
- すぐに4-5分ごとに15〜30秒後にグルタチオン溶液とキャプチャ画像を追加した後、タイマーを起動します。タイムラプスイメージング中倍率設定を変更しないでください。
- 穏やかにウェル内の動物の位置を最小限に顕微鏡の視野内に乱されることを均一な流れとグルタチオン溶液を加える。ポリープは、グルタチオン溶液を添加した後に広範囲に移動する場合は、画像キャプチャのための視野内にポリープをもたらすために非常に穏やかにプレートを移動させる。
- 対照実験では、同一の他の全てのパラメータを保持しながら媒体グルタチオンを欠く使用。
- 午後1時前に摂食応答の程度に概日リズムの可能性のある影響を避けるために - その日の前半に上記の実験の手順をすべて実行してください。
- GNU画像処理プログラム（GIMP）を使用して撮影した画像のそれぞれを開きます。 触手とhypostomeのそれぞれの先端部間の距離を決定するために測定>メニュー>ツールから利用できる「測定」ツールを使用します。口の開口部は、画像のいずれにおいても観察されている場合は、開いた口の中心と触手の先端部間の距離を決定する。触手の広がりとしてこの距離を参照してください。
- グルタチオンの暴露の前後に各ポリープの平均触手スプレッドを計算します。その後の時点の各々でそのまでゼロ時点での平均触手スプレッドの比を計算する。この比は、相対的な触手の広がりと呼ぶことにする。
- 少なくとも20ポリープのための測定を繰り返します。
2.メソッドバリデーション使用飢餓モデル
- 飢餓のために、別のガラスボウルに少数のヒドラポリープを転送し、5日間のためにそれらを餌を与えないでください。同じようなサイズのボウルにアルテミアを毎日、数ポリープの対照群を養う。実験の両方からメディアを変更して培地中の真菌の増殖を避けるために、毎日ボウル。
- 実験の日に、1時間アルテミアとヒドラの対照群を供給し、メディアからすべての食べ残しや死者アルテミアを除去した後、その後の実験のためにこれらのヒドラを使用しています。
- 飢餓および制御ヒドラポリープのそれぞれの測定値を交互による観察時に任意のバイアスを避けるために、以前のステップ1に記載の方法により対照群と比較して、ヒドラ飢餓ヒドラの摂食応答を測定する。
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Representative Results
グルタチオンは、ヒドラが獲物を飲み込むの目的のために、口の方に触手のカールを呈するようになります。触手のようなカールが近いhypostomeに触手の先端両端をもたらします。これは触手の広がりの減少、または触手とhypostome（ 図1）の先端部間の直線距離が生じる。相対触手広がり、または平均触手の比率は、前に広がり、グルタチオンを添加した後、時間の経過とともに減少し、複数のポリープにわたって平均。触手相対スプレッドは、グルタチオンを欠く培地を添加した後、しかし、一時的にのみ低下させ、約分（ 図2）の単位の値となる。飢餓は、グルタチオン1,13によって誘導された摂食行動の増強を引き起こすことが知られている。ここで説明する摂食行動を測定する方法は、飢餓モデルによって検証した。触手は、グルタチオンたsignificantlを追加した後、1分を広めるyは満腹基（σp = 1×等しい分散を有する2 t検定を適用することにより、10 -16）（ 図3）と比較して、飢餓グループの下位。
図1：平均触手の広がりの測定方法。リラックスヒドラポリープの画像がGSHを添加する前に記録し、口やポリープの触手のそれぞれの先端部間の直線距離は、GIMPツールを使用して画素数を測定した。別の画像は、GSHを添加した後に撮影したと触手広がりは同様にして測定した。
図2：ヒドラにおけるGSH誘発性摂食応答の定量。 Tentac図1で説明した相対的な触手拡散前とGSHた（n = 14）を添加した後触手スプレッドの割合として示されたようにGSHを測定した加算後の異なる時点でのルスプレッド。コントロール群の値は、ヒドラGSHを含まない培地た（n = 14）を添加した後、相対的な触手の広がりを表す。エラーバーは±SEMを表す。
図3：飢餓モデルを用いた摂食応答の定量方法のバリデーション。 X軸は、飢餓た（n = 61）および満腹た（n = 66）のグループのための3μMGSHの添加後の時間を表す。
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Discussion
ヒドラに摂食行動することは後生動物の中で最も祖先の化学感覚システムのいずれかを表します。刺胞アシスト獲物捕獲後にリリース甲殻流体中のGSHの存在はずっと前に1を検出されたが、GSHRタンパク質も推定されるコード遺伝子/ sのどちらも、ヒドラから現在までに特徴付けられている。いくつかの試みがヒドラ8、14、15結合タンパク質GSHを特徴付けるために行われている。しかし、これらの推定上の受容体タンパク質の同一性は送り反応に寄与する可能性が曖昧な、非常に少数の他の分子成分が残り、報告されている日付16、図17は 。動物界で唯一特徴付けGSHR金魚18からである。そのようなGPCRシグナル伝達カスケードの種々のタンパク質の阻害剤としてだけでなく、高度な分子生物学技術（RNAiを介した遺伝子サイレンシングおよびCRISPR-Cas9介在ゲノム編集）を使用するなど、古典的な技術は、捕虜を提供することができますヒドラにおけるGSHシグナル伝達カスケードの分子成分の同定のための電波の強いツール。受容体のような改変された発現および機能の評価可能な読み出し及びGSHシグナル伝達の他の構成要素は、摂食行動を変更することになる。これは、GSHによって誘発されるヒドラにおける摂食応答を測定するための方法を考案することが不可欠であった。
表現型的に、摂食応答は、口と口のその後の開口部に向かって触手のカールを伴う。前者の観察を利用し、我々は触手と口の頂端部間の距離を測定することを含む摂食行動を定量化する、単純でロバストな方法を開発した。それは、（1）新たに調製したGSH溶液を使用し、（2）GSHの適切な濃度を使用し、及び（3）の再現性のある測定値を得るために、均一な光強度のない強力な空気流を有する実験室で実験を行うために不可欠であるGSH-准Dの摂食行動。応答のような挙動を供給することも物理的に単純にGSHを欠く培地を添加することによって誘導することができた。しかし、そのような行動は一過性で15〜30秒後に顕著ではありません。このため、実験では、このコントロールを含むようにして、機械的外乱に起因するこのような応答を完全に消滅させた後にのみ、摂食応答を測定する必要があった。グルタチオン溶液を添加した可変流量によって生じる機械的擾乱によって誘発される触手収縮のばらつきを最小限に抑えるため、それはまた、先に記載19のような機械的装置と試験溶液の手動分注を代用することが可能であろう。グルタチオン溶液の機械化、分配は、それが内部で正規化されたため、すべてのディスペンシングイベントや全体で均一である可能性があることをこのような機械的な刺激の大きさと方向の厳密な制御を可能にするであろう。
この方法では、触手の広がり二つジ横切って測定されるmensions。現実には、一方、触手のいくつかはまた、観察者の方を向いて、第3の軸に沿って広がっている。同様に、触手の向きがグルタチオンを追加した後に変更することができます。しかし、単一のポリープの複数の触手を横切って、ならびに複数のポリープまたがっ触手を平均化する二次元測定と触手の変化方向によって導入されたバイアスを正規化する。私たちは、触手の明確な観察が常に実現可能ではないだけでなく、極端な周囲に移動ポリープは、分析から除外されることを示唆している。また、摂食応答の尺度として前およびGSHを添加した後に広がる触手の比率ではなく、GSH処理後の触手スプレッドの絶対値である相対触手の広がりを、取ることの変動によって誘導される変化の最小化につながる可能性があります個々のポリープの触手の長さで。グルタチオン誘発性feediを測定するこのプロトコールNG応答は、すべてのヒドラ種に同様に有用である可能性があります。ヒドラの大集団から得られた画像中の触手の広がりを測定するために、それはまた、動物の行動20の分析に利用可能なものと同様のコンピュータアルゴリズムを記述することも可能である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooled Incubator | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Microscope | Leica | S8AP0 | |
| Camera for the microscope | Leica | EC3 | |
| Reduced glutathione | Sigma | G4251 | Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation |
| Image editing program | GIMP | Version 2.8 |
References
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