Protocol
1. Hydra Культура и Измерение кормления ответ
- Поддержание Hydra полипы в культуре путем подачи их в день с Artemia и держать их в среде (буфер 1 мМ Трис-HCl, рН 7,6, 1 мМ NaCl, 1 мМ CaCl 2, 0,1 мМ KCl, и 0,1 мМ MgSO 4), содержащийся в стеклянный шар на 18 ° C при 12 ч света 12 ч темных циклов, как описано ранее 12.
- Для измерения отклика подачи, передать один зрелые гидры полип, имеющую от 5 до 6 щупальца к одному лунку 24-луночного планшета. Снимите остаточной среды из скважины, наклонив его, а затем сразу же добавить 500 мкл свежей среды.
- Подготовьте 9 мкм глутатиона решение в гидры среды. Так как глутатион раствор склонен к окислению, всегда используют свежеприготовленные глутатиона решение для каждого эксперимента.
- Трансфер тарелку с изображения платформе микроскопом, имеющим положения для записи изображения. Используйте темный фон такой, что поведение ое гидра полип может быть четко отображены против контрастном фоне.
- Комната для наблюдения и отображения поведение гидры свободным от огней колебания интенсивности, воздушных потоков и шума. Такие расстройства могут также вызвать гидра полип, чтобы показать сжатие щупалец - даже в отсутствие глутатиона.
- Разрешить полип расслабиться в течение 5 мин.
- Убедитесь, что полип расположен вдоль центральной области хорошо так, что поведение может быть отображена ясно. Если полип на краю колодца, привести его в центр с помощью промывки среду с помощью пипетки и снова позволить ему отдохнуть.
- Записать образ гидры в расслабленном состоянии. Это будет точка наблюдения нулевой раз.
- Быстрое добавление 9 мкМ раствор глутатиона, чтобы достичь конечной концентрации 3 мкМ в скважине. В зависимости от целей эксперимента и ответ, показанной на гидры, испытать ряд различных концентраций глутатиона и Chooсе соответствующую концентрацию, необходимую.
- Запустите таймер сразу после добавления раствора глутатиона и захват изображений после каждого 15-30 сек для 4-5 мин. Не изменить настройки коэффициента увеличения во время покадровой обработки изображений.
- Добавьте глутатиона раствор осторожно и с равномерным потоком таким образом, что положение животного в скважине будет минимально нарушается в поле зрения микроскопа. Тем не менее, если полип перемещает широко после добавления раствора глутатиона, перемещать плиту очень осторожно, чтобы довести полип в поле зрения захвата изображения.
- В контрольном эксперименте, используют среду, не содержащую глутатион, сохраняя при этом все другие параметры идентичны.
- Обязательно выполните все вышеперечисленные экспериментальных шагов в первой половине дня - до 1 вечера, чтобы избежать возможного влияния циркадного ритма на степень реакции кормления.
- Откройте каждый из захваченных изображений с помощью программы Image Manipulation GNU (GIMP). Используйте «мера» инструмент, доступный из меню> Инструменты> Измерить для определения расстояния между верхушечной конце каждого из щупалец и гипостомы. Если отверстие рта наблюдается в любом из изображений, определяют расстояние между центром в открытый рот и апикальной конце щупальцу. Обратитесь к этой дистанции, как распространение щупальца.
- Рассчитайте среднее распространение щупальце для каждого полипа до и после воздействия глутатиона. Рассчитывают отношение среднего распространения щупальца на нулевой момент времени в том, что на каждом из последующих временных точках. Это отношение будет называться относительный разброс щупальце.
- Повторите измерения для по меньшей мере, 20 полипов.
2. Метод Оценка использованияГолодание Модель
- Для голода, передать несколько Hydra полипы в отдельный стеклянный шар и не кормить их в течение 5 дней. Поток контрольную группу из нескольких полипов ежедневно с артемии в аналогичной по размеру миску. Изменение среды от обоих экспериментальная миски ежедневно, чтобы избежать роста грибов в среде.
- В день эксперимента, кормить контрольной группы гидры с артемии в течение 1 часа и использовать эти гидру для последующих экспериментов после удаления все недоеденные и мертвую артемии из среды.
- Измерить реакцию подача голодали гидры по сравнению с гидры из контрольной группы по способу, описанному ранее в пункте 1. Чтобы избежать смещения из-за времени наблюдения, чередовать измерения каждого из голодали и контролировать Hydra полипы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Глутатион вызывает гидра выставлять скручивания щупальца ко рту с целью поглощая добычу. Такое закручивание щупальцами приносит верхушечные концы щупалец ближе к гипостомы. Это приводит к уменьшению распространения щупальца, или линейного расстояния между верхушечной конце щупальца и гипостомы (рисунок 1). Относительное распространение щупальце, или отношение средней щупальцу распространяться до и после добавления глутатиона, в среднем на нескольких полипов снижает с течением времени. Относительное распространение щупальце после добавления в среде, не содержащей глутатион, однако, уменьшает только временно и достигает единичное значение примерно в минуту (рисунок 2). Голод, как известно, вызывают усиление пищевого поведения, вызванного глутатиона 1,13. Способ измерения пищевое поведение, описанный здесь, была подтверждена с помощью модели голодания. Щупальце распространяться через одну минуту после добавления глутатиона было significantlу ниже для голодающего группы по сравнению с сытой группы (р = 1 х 10 -16 с применением двухсторонние т-тест с равной дисперсии) (рисунок 3).
Рисунок 1: Метод измерения средней распространение щупальце. Образ непринужденной гидры полипа был записан перед добавлением ГШ и линейное расстояние между ртом и верхушечной конце каждого щупальца полипа измерялась по количеству пикселей, используя инструмент GIMP. Другой образ был взят в плен после добавления ГШ и распространение щупальце измеряли в подобной манере.
Рисунок 2: Количественный анализ реакции кормления ГШ-индуцированной в гидру. Tentacле распространяться на различных временных точках после добавления GSH была измерена, как описано на фиг.1, и относительный разброс щупальце был обозначен как отношение щупальцу распространилась до и после добавления GSH (п = 14). Значения для контрольной группы представляют собой относительную распространение щупальце после добавления гидры среде без GSH (п = 14). Ошибки бары представляют ± SEM.
Рисунок 3: Проверка метода количественного определения отклика подачи голоду модель. X-ось представляет время после добавления 3 мкМ GSH для изголодавшимися (п = 61) и сытых (п = 66) групп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Пищевое поведение в гидры представляет собой один из самых исконных хемосенсорных систем в многоклеточных. Хотя присутствие GSH в ракообразных жидкости, опубликованном после nematocyst при содействии захвата добычи был обнаружен давно 1, ни белок, ни GSHR предполагаемого гена, кодирующего / с были охарактеризованы от гидры до настоящего времени. Мало попытки были сделаны, чтобы охарактеризовать ГШ связывающих белков в гидру 8, 14, 15. Тем не менее, личность этих предполагаемых рецепторных белков остается неясным и очень немногие другие молекулярные компоненты, которые, вероятно, способствуют реакции кормления, как сообщается, Дата 16, 17. Единственное отличающийся GSHR в животном от золотой рыбки 18. Классические методы, такие как использование ингибиторов различных белков сигнального каскада ХВГФ а также самые современные молекулярно-биологические методы (РНК-интерференции опосредованной молчания генов и CRISPR-Cas9 опосредованной редактирования генома), может обеспечить военнопленныхвблизи сильных инструментов для идентификации молекулярных компонентов GSH каскад сигнальных в гидру. Подлежащих оценке считывание такой измененной экспрессии и функции рецептора и другими компонентами сигнализации GSH бы быть изменен пищевое поведение. Поэтому важно разработать метод для измерения отклика подачи в гидру, вызванное GSH.
Фенотипически, реакция включает кормление скручивания щупалец ко рту и последующего открытия рта. Используя прежнюю наблюдение мы разработали простой и надежный метод количественного определения пищевого поведения, который включает измерения расстояния между верхушечной концах щупальца и рот. Это имеет важное значение для (1) использовать свежеприготовленный раствор ГШ, (2) использовать соответствующую концентрацию GSH, и (3) проведения эксперимента в лаборатории, имеющие единые интенсивности света и нет сильных воздушных потоков, чтобы получить воспроизводимое измерение ГШ-ассоциированнымD пищевого поведения. Пищевого поведения, как реакция может быть также физически индуцированной путем простого добавления среде, не содержащей GSH. Тем не менее, такое поведение является временным и не заметно после 15-30 сек. Таким образом, необходимо было включить этот контроль в эксперименте и в измерении реакции подачи только после таких ответ вызвано механическим воздействием полностью прекратилось. Чтобы свести к минимуму изменение механического возмущения, вызванной щупальцевидных сжатия, вызванного переменной скоростью потока, с которой глутатион раствор добавляют, было бы также целесообразно заменить ручной дозирование исследуемого раствора с помощью механического устройства, как описано ранее, 19. Механизированная выдача глутатион решения позволит более жесткий контроль над величины и ориентации механического стимула таким образом, что это может быть едины для всех раздаточных событий и, следовательно, нормализуется внутренне.
В этом методе, распространение щупальце измеряется через два димерность; в то время как на самом деле, мало кто из щупалец также распространяться вдоль третьей оси направлен к наблюдателю. Точно так же, ориентация щупалец может измениться после добавления глутатиона. Тем не менее, в среднем щупальце распределены по нескольким щупальца одного полипа, а также на нескольких полипов нормализует уклон введенную двумерных измерений, а также измененной ориентации щупалец. Мы полагаем, что полипы, которые перемещаются в крайнее периферии скважины, где ясно наблюдение щупалец не всегда возможно, будут исключены из анализа. Кроме того, принимая относительное распространение щупальце, которое представляет собой отношение щупальцу распространяться до и после добавления GSH, а не абсолютное значение щупальца распространение после обработки GSH, как мера ответ подачи может привести к минимизации вариаций, индуцированной изменчивости в длину щупальца отдельных полипов. Этот протокол измерения глутатиона, вызванной feediнг ответ может быть одинаково полезен для всех видов Hydra. Для измерения щупальце распространение в изображениях, полученных от больших популяций гидры, она также будет возможность написать компьютерный алгоритм, похожий на те, которые доступны для анализа поведения животных 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooled Incubator | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Microscope | Leica | S8AP0 | |
| Camera for the microscope | Leica | EC3 | |
| Reduced glutathione | Sigma | G4251 | Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation |
| Image editing program | GIMP | Version 2.8 |
References
- Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
- Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
- Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
- Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
- Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
- Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
- Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
- Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
- Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
- Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
- Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
- Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
- Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
- Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
- Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
- Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
- Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
- Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
- Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).
