Måling glutation-indusert Fôring Response i Hydra

Protocol

1. Hydra Kultur og måling av Feeding Response

1. Oppretthold hydra polypper i kultur ved å mate dem daglig med Artemia og holde dem i et medium (1 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,6, 1 mM NaCl, 1 mM _CaCl2, 0,1 mM KCl, 0,1 mM og _MgSO4) inneholdt i en glasskål ved 18 ° C under 12 timers lys-mørke-sykluser 12 hr som beskrevet tidligere ^12.
2. For måling av mate respons, overføre en modne hydra polypp som har 5 til 6 tentakler til en enkelt brønn av en 24-brønns plate. Fjern det gjenværende mediet fra brønnen ved å vippe den, og deretter umiddelbart legge til 500 pl friskt medium.
3. Forbered 9 mikrometer glutation løsning i hydra medium. Siden glutation løsningen er utsatt for oksidasjon, bruk alltid nylaget glutation løsning for hvert forsøk.
4. Overfør platen til bildebehandling plattform av et mikroskop med bestemmelser for bildeopptak. Bruk en mørk bakgrunn, slik at oppførselen of hydra polypp kan tydelig avbildes mot kontrasterende bakgrunn.
5. Rommet benyttes til observasjon og avbildning oppførselen til hydra fri fra lysene i varierende intensitet, luftstrømmer og støy. Slike forstyrrelser kan også føre til at hydra polypp å vise sammentrekning av tentakler - selv i fravær av glutation.
6. La polypp å slappe av i 5 min.
7. Kontroller at polypp ligger langs det sentrale område av brønnen, slik at virkemåten kan avbildes tydelig. Hvis polyppen er på kanten av brønnen, ta den med til sentrum ved å spyle medium med en pipette og igjen at det å slappe av.
8. Ta et bilde av hydra i avslappet tilstand. Dette vil være null-tidspunkt observasjon.
9. Raskt legge til 9 pM glutation-løsning for å nå en sluttkonsentrasjon på 3 uM i brønnen. Avhengig av formålet av eksperimentet og responsen vist ved hydra, teste en rekke forskjellige konsentrasjoner av glutation og ChooSE passende konsentrasjon nødvendig.
10. Starter tidtakeren umiddelbart etter å ha lagt glutation løsning og ta bilder etter hvert 15-30 sek for 4-5 min. Ikke endre forstørrelsen innstillingene under time-lapse imaging.
11. Tilsett glutation-løsning forsiktig og med jevn strøm, slik at posisjonen til dyret i brønnen ville bli minimalt forstyrret i synsfeltet av mikroskopet. Men hvis polyppen beveger seg i stor utstrekning etter å ha lagt glutation løsning, og flytt platen veldig forsiktig å bringe polypp i synsfeltet for bildeopptak.
12. I kontrollforsøk, bruker medium mangler glutation samtidig som alle de andre parameterne identiske.
13. Sørg for å utføre alle de ovennevnte eksperimentelle skritt i løpet av første halvdel av dagen - før 13:00 for å unngå den mulige effekten av døgnrytmen på omfanget av fôring svar.
14. Åpne hvert av bildene du har tatt ved hjelp av GNU Image Manipulation Program (GIMP). Bruk "Mål" verktøyet tilgjengelig fra Meny> Verktøy> Mål å bestemme avstanden mellom apikale enden av hver av tentakler og hypostome. Hvis munnåpningen er observert i noen av bildene, å bestemme avstanden mellom sentrum av den åpne munn og den apikale enden av tentakkel. Referere til denne avstanden som tentakkel spredning.
15. Beregne gjennomsnittlig tentakkel spredt for hver polypp før og etter glutation eksponering. Beregne forholdet av gjennomsnittlig tentakkel spredning ved null-punktet tid til at det ved hver av de etterfølgende tidspunkter. Dette forholdet vil bli kalt relativ tentakkel spredning.
16. Gjenta målinger i minst 20 polypper.

2. Metode Validering brukerSult Model

1. For sult, overføre noen hydra polypper til en egen glassbolle og ikke mate dem i 5 dager. Mate kontrollgruppe på noen polypper daglig med artemia i en lignende størrelse bolle. Endre mediet fra begge eksperimentelle boller daglig for å unngå soppvekst i medium.
2. På dagen for eksperimentet, mate kontrollgruppe av hydra med Artemia i 1 time og bruke disse hydra for de etterfølgende eksperimenter etter fjerning av alle oppspore og døde artemia fra mediet.
3. Mål mate respons av hydra sultet i sammenligning med hydra fra kontrollgruppen ved fremgangsmåten som er beskrevet tidligere i trinn 1. For å unngå enhver skjevhet på grunn av tid for observasjon, alternere målingene av hver av de sultet og kontrollere hydra polypper.

Representative Results

Glutation fører hydra å stille curling av tentakler mot munnen for det formål å engulfing byttet. Slike curling av tentakler bringer apikale endene av tentakler nærmere hypostome. Dette resulterer i reduksjon i tentakkel spredning, eller den lineære avstanden mellom apikale enden av tentakkel og hypostome (figur 1). Den relative tentakkel spredning, eller forholdet av gjennomsnittlig Tentakkel spredt før og etter tilsetning av glutation, i gjennomsnitt over flere polypper reduseres over tid. Den relative tentakkel spredning etter tilsetning av medium som mangler glutation, men reduserer bare forbigående, og oppnår enhet verdi i omtrent et minutt (figur 2). Sult er kjent for å forårsake økning av forings oppførsel indusert av glutation ^1,13. Metoden for å måle foringsadferd som beskrives her ble validert ved sult modellen. Tentakkel spre ett minutt etter å ha lagt glutation var significantly lavere for sultet gruppen sammenlignet med den mett gruppen (p = 1 x 10 ^-16 ved å anvende to-halet t-test med lik varians) (figur 3).

Figur 1: Metode for å måle gjennomsnittlig tentakkel spredning. Et bilde av en avslappet hydra polypp ble spilt inn før du legger GSH og den lineære avstanden mellom munn og apikale enden av hver av tentakkel av polyppen ble målt i antall piksler ved hjelp av GIMP verktøyet. Et annet bilde ble tatt til fange etter å ha lagt GSH og tentakkel spredningen ble målt på tilsvarende måte.

Figur 2: Kvantifisering av GSH-induserte respons i forings hydra. Tentacle spres på forskjellige tidspunkter etter tilsetning av GSH ble målt som beskrevet i figur 1 og relativ tentakkel spredning ble betegnet som et forhold mellom Tentakkel spredt før og etter tilsetning av GSH (n = 14). Verdiene for kontrollgruppen representerer den relative spredning tentakkel etter tilsetning av medium uten hydra GSH (n = 14). Feil barer representerer ± SEM.

Figur 3: Validering av fremgangsmåten for kvantifisering av foringsrespons-modellen ved hjelp av sult. X-aksen angir tiden etter tilsetning av 3 uM GSH for sultet (n = 61) tilfredsstilt (n = 66) grupper.

Discussion

Fôring atferd i hydra representerer en av de mest forfedrenes chemosensory systemer i metazoans. Selv om tilstedeværelsen av GSH i krepsdyr væske løslatt etter nematocyst assistert byttedyr fangst ble oppdaget for lenge siden ^en har verken GSHR protein eller de antatte koding genet / s vært preget fra hydra til dags dato. Noen forsøk har vært gjort for å karakterisere GSH bindingsproteiner i hydra ^{8, 14, 15.} Imidlertid, identiteten til disse antatte reseptorproteiner er fortsatt uklar og meget få andre molekylære komponenter, noe som sannsynligvis vil bidra til forings reaksjonen, har blitt rapportert å dato ^{16, 17.} Den eneste karakterisert GSHR i dyreriket er fra gullfisk ^18. Klassiske teknikker, for eksempel ved bruk av hemmere av ulike proteiner av GPCR signalkaskade samt avanserte molekylærbiologiske teknikker (RNAi mediert genet Slå og CRISPR-Cas9 mediert genom redigering), kan gi powerful verktøy for identifisering av de molekylære komponentene av GSH signalkaskade i Hydra. Den scorable avlesning av en slik en endret ekspresjon og funksjon av reseptoren og de andre komponenter av GSH-signalering ville bli forandret foringsadferd. Det var derfor viktig å utvikle en fremgangsmåte for å måle forings respons i hydra indusert av GSH.

Fenotypisk, omfatter forings respons krølling av fangarmene mot munningen og den påfølgende åpning av munnen. Ved hjelp av den tidligere observasjon vi utviklet en enkel og robust fremgangsmåte for å kvantifisere foringsadferd som innebærer måling av avstanden mellom de apikale ender av tentakkel og munn. Det er viktig å (1) bruke den nyfremstilte GSH-løsning, (2) bruke den passende konsentrasjon av GSH, og (3) å utføre forsøket i laboratoriet som har ensartede lysintensiteter og ingen sterke luftstrømmer for å oppnå reproduserbar måling av GSH-medarbeiderd fôring atferd. Fôring respons-lignende atferd kan også være fysisk indusert ved å legge medium mangler GSH. Imidlertid er en slik oppførsel forbigående og ikke merkbar etter 15-30 sek. Derfor var det nødvendig å ta med denne kontroll i eksperimentet og for å måle matingen respons kun etter slik responsen forårsaket av den mekaniske forstyrrelse er helt opphørt. For å minimalisere variasjonen i den mekaniske forstyrrelser indusert tentacular kontraksjon forårsaket av variabel strømningshastighet med hvilken glutation-løsning blir tilsatt, vil det også være mulig å erstatte manuell utlevering av testoppløsningen med en mekanisk enhet som tidligere beskrevet ^19. Mekanisert utlevering av glutation løsning ville gjøre det mulig tettere kontroll av omfanget og innretningen av mekanisk stimulus slik at det kunne være lik i alle dispense hendelser og derfor normalisert internt.

I denne fremgangsmåten blir tentakkel spredningen målt over to didimensjoner; mens det i realiteten er noen av tentakler også spredt langs den tredje aksen peker mot observatøren. Likeledes kan orienteringen av tentakler endres etter tilsetning av glutation. Imidlertid, i snitt tentakkel spredt over flere fangarmer av en enkelt polypp, så vel som på tvers av flere polypper normaliserer skjevhet introdusert av to-dimensjonale målinger, så vel som den endrede orienteringen av fangarmene. Vi foreslår at de polypper som beveger seg til ytterste periferien av brønnen, hvor klart observasjon av fangarmene er ikke alltid mulig, utelukkes fra analyse. Videre tar den relative tentakkel spredt, som er forholdet mellom Tentakkel spredt før og etter tilsetning av GSH, og ikke den absolutte verdi av etter spredning tentakkel GSH behandling, som et mål på mate respons kan føre til minimering av variasjonen indusert av variabilitet i tentakkel lengden av de enkelte polypper. Denne protokollen for måling av glutation-induserte foringng respons kan være like nyttig for alle hydra arter. For måling tentakkel spredt i bildene innhentet fra store populasjoner av hydra, ville det også være mulig å skrive en datamaskin-algoritme som ligner på dem som er tilgjengelige for analyse av dyrs atferd ^20.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cooled Incubator	Panasonic	MIR-254-PE
Microscope	Leica	S8AP0
Camera for the microscope	Leica	EC3
Reduced glutathione	Sigma	G4251	Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation
Image editing program	GIMP	Version 2.8