Protocol
दूध पिलाने की प्रतिक्रिया के 1. हाइड्रा संस्कृति और मापन
- एक में समाहित (1 मिमी Tris-एचसीएल बफर, पीएच 7.6, 1 मिमी NaCl, 1 मिमी 2 CaCl, 0.1 मिमी KCl, और 0.1 मिमी MgSO 4) artemia साथ दैनिक उन्हें खिलाने और एक मध्यम में उन्हें रखने के द्वारा संस्कृति में हाइड्रा जंतु बनाए रखें 12 घंटा प्रकाश-12 घंटा अंधेरे चक्र के तहत 18 डिग्री सेल्सियस पर कांच का कटोरा पहले 12 में वर्णित के रूप में.
- खिला प्रतिक्रिया को मापने के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली का एक भी अच्छी तरह से करने के लिए 5 से 6 जाल होने हाइड्रा नाकड़ा परिपक्व हस्तांतरण. यह झुकने से अच्छी तरह से अवशिष्ट मध्यम निकालें, और फिर तुरंत ताजा माध्यम के 500 μl जोड़ें.
- हाइड्रा मध्यम में 9 माइक्रोन glutathione समाधान तैयार है. Glutathione समाधान ऑक्सीकरण होने का खतरा है, हमेशा के लिए एक प्रयोग के लिए हौसले से तैयार glutathione के समाधान का उपयोग करें.
- छवि रिकॉर्डिंग के लिए प्रावधान होने के एक माइक्रोस्कोप की इमेजिंग मंच करने के लिए थाली स्थानांतरण. व्यवहार हे कि इस तरह के एक अंधेरे पृष्ठभूमि का उपयोग करेंएफ हाइड्रा नाकड़ा स्पष्ट रूप से विषम पृष्ठभूमि के खिलाफ imaged किया जा सकता है.
- कमरे के अवलोकन और अस्थिर तीव्रता, हवा धाराओं और शोर की रोशनी से हाइड्रा मुक्त का व्यवहार इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया. यहां तक कि glutathione के अभाव में - ऐसी गड़बड़ी भी हाइड्रा नाकड़ा जाल के संकुचन को दिखाने के लिए हो सकता है.
- नाकड़ा 5 मिनट के लिए आराम करने के लिए अनुमति दें.
- नाकड़ा व्यवहार स्पष्ट रूप से imaged किया जा सकता है कि अच्छी तरह से इस तरह के मध्य क्षेत्र के साथ स्थित है कि सुनिश्चित करें. नाकड़ा अच्छी तरह के किनारे पर है, तो एक पिपेट का उपयोग मध्यम निस्तब्धता द्वारा केंद्र को इसे लाने और इसे फिर से आराम करने के लिए अनुमति देते हैं.
- आराम से राज्य में हाइड्रा की एक छवि पर कब्जा. यह शून्य समय बिंदु अवलोकन किया जाएगा.
- जल्दी से अच्छी तरह से में 3 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए 9 माइक्रोन glutathione समाधान जोड़ें. हाइड्रा द्वारा दिखाए गए प्रयोग और प्रतिक्रिया के उद्देश्य पर निर्भर करता है, glutathione और चू के विभिन्न सांद्रता की एक सीमा का परीक्षणआवश्यक उचित एकाग्रता से.
- तुरंत 4-5 मिनट के लिए हर 15-30 सेकंड के बाद glutathione समाधान और कब्जा छवियों को जोड़ने के बाद टाइमर शुरू करो. समय चूक इमेजिंग के दौरान बढ़ाई सेटिंग में बदलाव न करें.
- धीरे और अच्छी तरह से में पशु की स्थिति न्यूनतम माइक्रोस्कोप से देखने के क्षेत्र में परेशान किया जाएगा कि इस तरह की वर्दी प्रवाह के साथ glutathione समाधान जोड़ें. नाकड़ा glutathione समाधान जोड़ने के बाद बड़े पैमाने पर चलता है हालांकि, अगर छवि पर कब्जा के लिए देखने के क्षेत्र में नाकड़ा लाने के लिए बहुत धीरे थाली चाल है.
- नियंत्रण प्रयोग में, समान अन्य सभी मापदंडों रखते हुए मध्यम glutathione कमी का उपयोग करें.
- 1:00 से पहले खिला प्रतिक्रिया की सीमा पर circadian ताल के संभावित प्रभाव से बचने के लिए - दिन की पहली छमाही के दौरान ऊपर प्रयोगात्मक चरणों के सभी प्रदर्शन करने के लिए सुनिश्चित करें.
- GNU छवि हेरफेर कार्यक्रम (जिम्प) का उपयोग कर लिया छवियों के प्रत्येक खोलें. जाल और hypostome में से प्रत्येक के शिखर अंत के बीच दूरी तय करने के लिए उपाय> मेनू> उपकरण से उपलब्ध "उपाय" उपकरण का उपयोग करें. मुंह खोलने छवियों में से किसी में मनाया जाता है, खोला मुंह से केंद्र और मूंछ के शिखर अंत के बीच की दूरी का निर्धारण. मूंछ प्रसार के रूप में इस दूरी को देखें.
- पहले और glutathione प्रदर्शन के बाद प्रत्येक नाकड़ा के लिए औसत मूंछ प्रसार की गणना. बाद में समय-बिंदुओं में से प्रत्येक पर है कि शून्य-समय बिंदु पर औसत मूंछ प्रसार के अनुपात की गणना. इस अनुपात के सापेक्ष मूंछ फैल बुलाया जाएगा.
- कम से कम 20 जंतु के लिए माप दोहराएँ.
2. विधि मान्यकरण का उपयोगभुखमरी मॉडल
- भुखमरी के लिए, एक अलग कांच का कटोरा के लिए कुछ हाइड्रा जंतु हस्तांतरण और 5 दिनों के लिए उन्हें खिलाने के लिए नहीं है. एक समान आकार के कटोरे में artemia साथ दैनिक कुछ जंतु के नियंत्रण समूह फ़ीड. दोनों प्रयोगात्मक माध्यम में कवक विकास से बचने के लिए दैनिक कटोरे से मध्यम बदलें.
- प्रयोग के दिन, 1 घंटे के लिए artemia साथ हाइड्रा का नियंत्रण समूह को खिलाने और मध्यम से सभी uneaten और मृत artemia हटाने के बाद बाद के प्रयोगों के लिए इन हाइड्रा का उपयोग करें.
- कारण, प्रेक्षण के समय के लिए किसी भी पूर्वाग्रह से बचने के लिए पहले चरण 1 में वर्णित विधि से नियंत्रण समूह से हाइड्रा के साथ तुलना में भूखे हाइड्रा के खिला प्रतिक्रिया को मापने भूखे में से प्रत्येक की माप वैकल्पिक और हाइड्रा जंतु नियंत्रित करते हैं.
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Representative Results
Glutathione हाइड्रा शिकार छा के प्रयोजन के लिए मुंह की ओर जाल के कर्लिंग प्रदर्शन करने का कारण बनता है. जाल की तरह के कर्लिंग करीब hypostome के लिए जाल के शिखर समाप्त होता है लाता है. यह मूंछ प्रसार में कमी, या मूंछ और hypostome (चित्रा 1) के शिखर अंत के बीच रेखीय दूरी में यह परिणाम है. रिश्तेदार मूंछ प्रसार, या औसत मूंछ का अनुपात पहले फैला और glutathione जोड़ने के बाद, समय के साथ कम कर देता है कई जंतु भर में औसत. रिश्तेदार मूंछ फैल glutathione कमी माध्यम के बाद इसके अलावा, तथापि, केवल क्षणिक कम कर देता है और के बारे में एक मिनट (चित्रा 2) में इकाई मूल्य उपलब्ध हो जाता है. भुखमरी glutathione 1,13 द्वारा प्रेरित खिला व्यवहार की वृद्धि के कारण जाना जाता है. यहाँ वर्णित खिला व्यवहार को मापने की विधि भुखमरी मॉडल द्वारा मान्य किया गया था. उनका कहना है glutathione significantl था के बाद मूंछ एक मिनट का प्रसारY तृप्त समूह (पी = 1 एक्स बराबर विचरण के साथ दो पूंछ टी परीक्षण लगाने से 10 -16) (चित्रा 3) की तुलना में भूखे समूह के लिए कम.
चित्रा 1: औसत मूंछ प्रसार को मापने की विधि. एक सुकून हाइड्रा नाकड़ा की एक छवि GSH और मुंह और नाकड़ा की मूंछ से प्रत्येक के शिखर अंत के बीच रेखीय दूरी जिम्प उपकरण का उपयोग पिक्सल की संख्या के मामले में मापा गया था जोड़ने से पहले दर्ज की गई थी. एक और छवि GSH जोड़ने के बाद कब्जा कर लिया था और मूंछ फैल समान तरीके से मापा गया था.
चित्रा 2: हाइड्रा में GSH प्रेरित खिला प्रतिक्रिया के quantitation. TentacLe चित्रा 1 में वर्णित और रिश्तेदार मूंछ प्रसार से पहले फैल मूंछ के अनुपात के रूप में और (एन = 14) GSH जोड़ने के बाद चिह्नित किया गया था के रूप में GSH मापा गया था जोड़ने के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर फैल गया. नियंत्रण समूह के लिए मूल्यों GSH (एन = 14) के बिना हाइड्रा माध्यम के बाद इसके अलावा रिश्तेदार मूंछ प्रसार का प्रतिनिधित्व करते हैं. त्रुटियाँ सलाखों ± SEM के प्रतिनिधित्व करते हैं.
चित्रा 3: भुखमरी मॉडल का उपयोग कर खिला प्रतिक्रिया के quantitation की विधि के मान्यकरण. एक्स अक्ष भूखे (एन = 61) और तृप्त (एन = 66) समूहों के लिए 3 माइक्रोन GSH के अलावा के बाद समय का प्रतिनिधित्व करता है.
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Discussion
हाइड्रा में व्यवहार दूध पिलाने मेटाजोअन में सबसे पैतृक chemosensory प्रणालियों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है. Nematocyst की मदद से शिकार को पकड़ने के बाद जारी जलीय द्रव में GSH की उपस्थिति बहुत पहले 1 का पता चला था, GSHR प्रोटीन और न ही ख्यात एन्कोडिंग जीन / एस न तो हाइड्रा से आज तक विशेषता किया गया है. कुछ प्रयास GSH हाइड्रा 8, 14, 15 में प्रोटीन बाध्यकारी चिह्नित करने के लिए बनाया गया है. हालांकि, इन ख्यात रिसेप्टर प्रोटीन की पहचान खिला प्रतिक्रिया के लिए योगदान करने की संभावना है जो अस्पष्ट और बहुत कुछ अन्य आणविक घटकों, को सूचित किया गया है रहता है दिनांक 16, 17. जानवरों के साम्राज्य में ही विशेषता GSHR सुनहरी 18 से है. ऐसे पाउ प्रदान कर सकते हैं GPCR संकेत झरना के विभिन्न प्रोटीन के अवरोधकों के साथ ही उन्नत आणविक जैविक तकनीक (आरएनएआई की मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने और CRISPR-Cas9 मध्यस्थता जीनोम संपादन), का उपयोग कर के रूप में शास्त्रीय तकनीक,हाइड्रा में झरना संकेत GSH की आणविक घटकों की पहचान के लिए erful उपकरण. एक बदल अभिव्यक्ति और समारोह रिसेप्टर की और GSH संकेतन के अन्य घटकों के इस तरह के scorable readout के खिला व्यवहार बदल जाएगी. यह GSH द्वारा प्रेरित हाइड्रा में खिला प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक विधि चिंतन करना इसलिए आवश्यक था.
Phenotypically, खिला प्रतिक्रिया मुंह और मुंह के बाद खोलने की दिशा में जाल की कर्लिंग शामिल है. पूर्व अवलोकन का उपयोग हम मूंछ और मुंह के शिखर सिरों के बीच की दूरी को मापने शामिल है जो खिला व्यवहार quantitating का एक सरल और मजबूत विधि विकसित की है. यह (1) हौसले से तैयार GSH समाधान का उपयोग, (2) GSH की उचित एकाग्रता का उपयोग, और (3) की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप प्राप्त करने के लिए एक समान प्रकाश तीव्रता और कोई मजबूत हवा धाराओं होने प्रयोगशाला में प्रयोग करने के लिए आवश्यक है GSH-सहयोगीव्यवहार खिला होगी. दूध पिलाने की प्रतिक्रिया की तरह व्यवहार भी शारीरिक रूप से बस मध्यम GSH कमी जोड़कर प्रेरित किया जा सकता है. हालांकि, इस तरह के व्यवहार क्षणिक और 15-30 सेकंड के बाद ध्यान देने योग्य नहीं है. इसलिए, यह प्रयोग में इस पर नियंत्रण शामिल करने के लिए और यांत्रिक गड़बड़ी की वजह से इस तरह की प्रतिक्रिया पूरी तरह से बंद कर दिया गया है के बाद ही खिला प्रतिक्रिया को मापने के लिए जरूरी हो गया था. Glutathione समाधान जोड़ा जाता है जिसके साथ चर प्रवाह दर की वजह से यांत्रिक अशांति प्रेरित मूंछ सारूप संकुचन में भिन्नता को कम करने के लिए, यह भी पहले 19 में वर्णित के रूप में एक यांत्रिक उपकरण के साथ परीक्षण समाधान की पुस्तिका वितरण स्थानापन्न करने के लिए संभव होगा. Glutathione समाधान की यंत्रीकृत वितरण यह सभी वितरण घटनाओं में एक समान है और इसलिए आंतरिक रूप से सामान्य हो सकता है कि इस तरह के यांत्रिक उत्तेजना की भयावहता और उन्मुखीकरण के सख्त नियंत्रण के लिए सक्षम होगा.
इस विधि में, मूंछ फैल दो डि भर में मापा जाता हैmensions; वास्तविकता में, जबकि जाल का कुछ भी पर्यवेक्षक की ओर इशारा करते हुए तीसरी धुरी के साथ फैले हुए हैं. इसी तरह, जाल के उन्मुखीकरण glutathione जोड़ने के बाद बदल सकते हैं. हालांकि, एक भी नाकड़ा के कई जाल पार करने के साथ ही कई जंतु भर में फैले मूंछ औसतन दो-आयामी माप के रूप में अच्छी तरह से जाल की बदली हुई अभिविन्यास द्वारा शुरू की पूर्वाग्रह normalizes. हम जाल की स्पष्ट अवलोकन हमेशा संभव नहीं है, जहां अच्छी तरह से, के चरम परिधि में ले जाएँ जो जंतु, विश्लेषण से बाहर रखा जाना है कि सुझाव. इसके अलावा, खिला प्रतिक्रिया का एक उपाय के रूप में पहले और GSH जोड़ने के बाद फैला मूंछ का अनुपात, और नहीं GSH उपचार के बाद मूंछ प्रसार के निरपेक्ष मूल्य है जो रिश्तेदार मूंछ प्रसार, ले परिवर्तनशीलता द्वारा प्रेरित भिन्नता के न्यूनतम में परिणाम हो सकता है व्यक्तिगत जंतु की मूंछ की लंबाई में. Glutathione प्रेरित feedi को मापने का यह प्रोटोकॉलएनजी प्रतिक्रिया सभी हाइड्रा प्रजातियों के लिए समान रूप से उपयोगी हो सकता है. हाइड्रा की बड़ी आबादी से प्राप्त छवियों में मूंछ प्रसार को मापने के लिए, यह भी पशु व्यवहार 20 के विश्लेषण के लिए उपलब्ध उन लोगों के समान एक कंप्यूटर कलन विधि लिखने के लिए संभव हो जाएगा.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooled Incubator | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Microscope | Leica | S8AP0 | |
| Camera for the microscope | Leica | EC3 | |
| Reduced glutathione | Sigma | G4251 | Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation |
| Image editing program | GIMP | Version 2.8 |
References
- Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
- Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
- Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
- Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
- Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
- Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
- Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
- Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
- Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
- Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
- Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
- Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
- Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
- Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
- Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
- Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
- Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
- Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
- Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).
