Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

Protocol

1. Hydra Cultura e medição da resposta Alimentação

1. Manter pólipos hidra em cultura, alimentando-os com diária de artemia e mantendo-os num meio (tampão de 1 mM Tris-HCl, pH 7,6, NaCl a 1 mM, CaCl2 1 _mM, KCl 0,1 mM, e 0,1 mM de _MgSO4) contida em um tigela de vidro a 18 ° C sob ciclos escuros hr de luz 12 12 h, como descrito anteriormente ^12.
2. Para a medição da resposta de alimentação, transferir um pólipo amadurecer hidra tendo 5 a 6 tentáculos para um único poço de uma placa de 24 poços. Retirar o meio residual do bem, inclinando-lo, e em seguida, adicione imediatamente 500 mL de meio fresco.
3. Preparar a solução de glutationa 9 uM em meio de hidra. Uma vez que a solução de glutationa é propenso a oxidação, usar sempre a glutationa solução preparada de fresco para cada experiência.
4. Transferir a placa para a plataforma de imagem de um microscópio tendo disposições para a gravação da imagem. Usar um fundo escuro de tal modo que o comportamentof pólipo hidra pode ser claramente fotografada contra o fundo contrastante.
5. A sala utilizada para a observação e imagem do comportamento de hidra livre de luzes de intensidade flutuante, correntes de ar e de ruído. Tais perturbações podem também fazer com que o pólipo hidra para mostrar a contracção dos tentáculos - mesmo na ausência de glutationa.
6. Permitir que o pólipo para relaxar por 5 min.
7. Certifique-se de que o pólipo está localizado ao longo da região central da cavidade de tal modo que o comportamento pode ser trabalhada de forma clara. Se o pólipo está na borda do poço, trazê-la para o centro, através de lavagem do meio utilizando uma pipeta e novamente permitir que ele relaxe.
8. Capturar uma imagem da hidra no estado relaxado. Este será o ponto de observação de tempo zero.
9. Rapidamente adicionar 9 uM solução glutationa para alcançar uma concentração final de 3 uM no poço. Dependendo da finalidade da experiência e a resposta mostrada por hidra, testar uma gama de diferentes concentrações de glutationa e Chooif a concentração adequada e necessária.
10. Inicie o cronômetro imediatamente após a adição de solução de glutationa e capturar imagens após cada 15-30 seg para 4-5 min. Não altere as configurações de ampliação durante a imagiologia de lapso de tempo.
11. Adicionar a solução de glutationa suavemente e com um fluxo uniforme de tal modo que a posição do animal no poço seria minimamente perturbado no campo de visão do microscópio. No entanto, se o pólipo se move extensivamente após a adição de solução de glutationa, mover a placa muito suavemente para trazer o pólipo no campo de visão para a captura de imagem.
12. No experimento de controle, use meio sem glutationa, mantendo todos os outros parâmetros idênticos.
13. Certifique-se de executar todas as etapas experimentais acima durante a primeira metade do dia - antes de 13:00 para evitar o possível efeito do ritmo circadiano sobre a extensão da resposta de alimentação.
14. Abra cada uma das imagens capturadas usando o GNU Image Manipulation Program (GIMP). Use a ferramenta "Medida", disponível a partir de Menu> Ferramentas> Medida para determinar a distância entre a extremidade apical de cada um dos tentáculos e hypostome. Se a abertura boca é observado em qualquer uma das imagens, determinar a distância entre o centro da boca aberta e a extremidade apical do tentáculo. Consulte a esta distância como a propagação tentáculo.
15. Calcule o spread médio tentáculo para cada pólipo antes e depois da exposição a glutationa. Calcular a proporção de spread médio tentáculo no ponto de tempo zero para que em cada um dos pontos de tempo subsequentes. Esta relação será chamado propagação tentáculo relativa.
16. Repita as medições por pelo menos 20 pólipos.

2. método de validação usando oA fome Modelo

1. Para a fome, transferir alguns pólipos Hydra para uma tigela de vidro separada e não alimentá-los durante 5 dias. Alimente o grupo de alguns pólipos controle diário com artemia em uma tigela de tamanho similar. Mudar o meio de tanto experimental taças diariamente para evitar crescimento de fungos no meio.
2. No dia do experimento, alimentar o grupo de controle hidra com artemia por 1 hr e usá-los hidra para os experimentos posteriores após a remoção de todos artemia não consumidos e mortos a partir do meio.
3. Meça a resposta de alimentação da hidra fome em comparação com a hidra do grupo de controle pelo método descrito anteriormente na etapa 1. Para evitar qualquer viés devido ao tempo de observação, alternar as medidas de cada da fome e controlar pólipos hidra.

Representative Results

A glutationa faz com que a hidra exibem ondulação dos tentáculos para a boca com a finalidade de engolindo a presa. Essa ondulação de tentáculos traz extremidades apicais dos tentáculos mais perto do hypostome. Isto resulta na redução da propagação tentáculo, ou a distância linear entre a extremidade apical do tentáculo e hipostoma (Figura 1). A propagação tentáculo parente, ou a proporção de tentáculo média espalhar antes e após a adição de glutationa, em média em vários pólipos reduz ao longo do tempo. A propagação tentáculo relativa após a adição do meio sem glutationa, no entanto, reduz apenas transitoriamente e alcança a unidade de valor em cerca de um minuto (Figura 2). A inanição é conhecido por causar a melhoria do comportamento de alimentação induzido pela glutationa ^1,13. O método de medição do comportamento de alimentação aqui descrito foi validado pelo modelo de inanição. O tentáculo espalhar um minuto após a adição de glutationa foi significantly inferior para o grupo de fome em comparação com o grupo saciados (p = 1 x 10 ^-16, aplicando duas caudas t-teste com igual variância) (Figura 3).

Figura 1: Método de medição spread médio tentáculo. Uma imagem de um pólipo hidra relaxado foi gravado antes da adição de GSH e a distância linear entre a boca ea extremidade apical de cada um dos tentáculo do pólipo foi medido em termos de número de pixels, usando a ferramenta GIMP. Outra imagem foi capturada após a adição de GSH e a propagação tentáculo foi medida de maneira semelhante.

Figura 2: A quantificação da resposta de alimentação induzida pelo GSH em hidra. Tentacle espalhar em diferentes pontos de tempo após a adição de GSH foi medido como descrito na Figura 1 e propagação tentáculo relativa foi denotada como uma razão de tentáculo se espalhar antes e após a adição de GSH (n = 14). Os valores para o grupo de controlo corresponde a propagação tentáculo relativa após a adição do meio de hidra, sem GSH (n = 14). Erros barras representam ± SEM.

Figura 3: Validação do método de quantificação da resposta de alimentação, utilizando o modelo de inanição. Eixo X representa o tempo após a adição de 3 uM de GSH (n = 61) e (n = 66) grupos privados de alimentação saciados.

Discussion

Comportamento alimentar em hidra representa um dos sistemas de quimio mais ancestrais dos metazoários. Embora a presença de GSH no fluido crustáceo libertado após assistida-nematocyst captura de presa foi detectada há muito tempo ^1, nem a proteína GSHR nem o gene que codifica putativo / s têm sido caracterizadas a partir da hidra até à data. Poucas tentativas têm sido feitas para caracterizar as proteínas de ligação a GSH na hidra ^{8, 14, 15.} No entanto, a identidade destas proteínas receptoras putativas permanece outros componentes moleculares obscuras e muito poucas, que são passíveis de contribuir para a reacção de alimentação, têm sido relatados para data ^{16, 17.} A única GSHR caracterizado no reino animal é de peixinho ^18. As técnicas clássicas, como o uso dos inibidores de várias proteínas da cascata de sinalização GPCR, bem como as técnicas de biologia molecular avançadas (RNAi silenciamento de genes mediada e CRISPR-Cas9 mediada edição genoma), pode fornecer powferramentas erful para identificação dos componentes moleculares da GSH cascata de sinalização em Hydra. A leitura contáveis ​​de uma expressão alterada e tais função do receptor e os outros componentes da sinalização GSH seria alterado o comportamento de alimentação. Era, portanto, essencial para desenvolver um método para medir a resposta de alimentação em hidra induzida pela GSH.

Fenotipicamente, a resposta de alimentação envolve o enrolamento das tentáculos para com a boca e a abertura posterior da boca. Utilizando o anterior observação foi desenvolvido um método simples e robusta de quantificar o comportamento de alimentação que envolve a medição da distância entre as extremidades apicais do tentáculo e boca. É essencial para (1) usar o GSH solução recentemente preparada, (2) utilizar a concentração apropriada de GSH, e (3) realizar o experimento no laboratório tendo intensidades de luz uniforme e não há fortes correntes de ar para obter a medição da reprodutível GSH-associadod comportamento alimentar. Comportamento de resposta do tipo de alimentação também pode ser induzida fisicamente simplesmente adicionando meio sem GSH. No entanto, tal comportamento é transitória e não perceptível após 15-30 segundos. Portanto, foi necessário incluir este controlo na experiência e para medir a resposta de alimentação apenas depois de tal resposta causada pela perturbação mecânica é completamente cessado. Para minimizar a variação na contracção mecânica tentacular induzida por perturbação causada pela taxa de fluxo variável, com os quais é adicionada uma solução de glutationa, seria igualmente viável para substituir o manual de distribuição da solução de teste com um dispositivo mecânico, como descrito anteriormente ^19. Distribuição mecanizada de glutationa solução permitiria um controle mais rígido da magnitude e orientação do estímulo mecânico tal que possa ser uniforme em todos os eventos de distribuição e, portanto, normalizada internamente.

Neste método, a propagação tentáculo é medido através de di doismensões; ao passo que, na realidade, alguns dos tentáculos também são espalhados ao longo do terceiro eixo apontando para o observador. Do mesmo modo, a orientação dos tentáculos podem mudar após a adição de glutationa. No entanto, a média do tentáculo espalhados em vários tentáculos de um único pólipo, bem como em vários pólipos normaliza o viés introduzido por medidas bidimensionais, bem como a orientação mudou dos tentáculos. Sugerimos que os pólipos que se movem para a periferia extrema do poço, onde a observação clara dos tentáculos nem sempre é viável, ser excluídos da análise. Além disso, tendo a propagação tentáculo relativa, que é a relação de tentáculo se espalhar antes e após a adição de GSH, e não o valor absoluto da propagação tentáculo GSH após o tratamento, como uma medida da resposta de alimentação pode resultar na minimização da variação induzida pela variabilidade em tentáculo o comprimento dos pólipos individuais. Este protocolo de medir a feedi induzida pela glutationang resposta poderia ser igualmente útil para todas as espécies de Hydra. Para a medição de propagação em tentáculo as imagens obtidas a partir de grandes populações de hidra, seria também possível escrever um algoritmo de computador semelhantes às disponíveis para a análise do comportamento dos animais ^20.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cooled Incubator	Panasonic	MIR-254-PE
Microscope	Leica	S8AP0
Camera for the microscope	Leica	EC3
Reduced glutathione	Sigma	G4251	Stored at 4 °C. Bring the bottle to room temperature before opening to avoid oxidation
Image editing program	GIMP	Version 2.8