Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Modeling Mucosal Candidiasis i Larve Zebrafisk af swimbladder Injection

Published: November 27, 2014 doi: 10.3791/52182
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

Abstract

Tidlig forsvar mod mucosale patogener består af både en epitelbarriere og medfødte immunceller. Den immunocompetency af begge, og deres indbyrdes kommunikation, er altafgørende for at beskytte mod infektioner. Interaktionerne af epitel- og medfødte immunceller med et patogen bedst undersøgt in vivo, hvor kompleks adfærd udfolder i tid og rum. Men de eksisterende modeller ikke mulighed for nem spatio-temporale billeddannelse af kampen med patogener på slimhinde-niveau.

Den udviklede model her skaber en mucosal infektion ved direkte injektion af det fungale patogen, Candida albicans, i swimbladder af unge zebrafisk. Den resulterende infektion giver høj opløsning billeddannelse af epitel- og medfødte immunsystem celle adfærd i hele udviklingen af ​​mucosal disease. Alsidigheden i denne metode giver mulighed for afhøring af værten til at undersøge detaljeret sekvens af immune begivenheder, der fører til pHagocyte rekruttering og undersøge roller bestemte celletyper og molekylære veje i beskyttelse. Desuden kan adfærd patogen som en funktion af immunangreb skal afbildes samtidigt ved hjælp af fluorescerende protein-udtrykkende C. albicans. Øget rumlige opløsning vært-patogen interaktion er også muligt ved hjælp af den beskrevne hurtige swimbladder dissektion teknik.

Det mucosal infektion model her beskrevne er ligetil og meget reproducerbar, hvilket gør det et værdifuldt redskab for studiet af mukøs candidiasis. Dette system kan også være stort set translaterbare andre mucosale patogener, såsom mycobakterielle, bakterielle eller virale mikrober, der normalt inficerer gennem epiteloverflader.

Protocol

BEMÆRK: Alle zebrafisk pleje protokoller og forsøg blev udført i overensstemmelse med NIH retningslinjer i Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) protokol A2012-11-03.

1. zebrafisk Opdræt til 4 dage efter befrugtning

  1. Saml AB zebrafisk eller andre transgene linier, inden for de første 3 timer efter befrugtning, som vist i en anden video 34.
  2. Inkuber 120 æg i en 15 cm petriskåle indeholdende 150 ml E3 medier (5 mM NaCI; 0,17 mM KCI; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgCI2, 2 mM HEPES, pH 6,8) med methylenblåt (0,3 ug / ml endelig koncentration) i en 33 ° C inkubator med 12/12 lys / mørke fotoperiode.
  3. Udskift mediet efter 6 timer med E3 + PTU (1-phenyl-2-thiourinstof, 10 ug / ml slutkoncentration) og fjerne de døde æg.
  4. Der inkuberes i 4 dage ved 33 ° C, udveksle medierne med frisk E3 + PTU efter 2 dage.

2. Ifremskrivningen Micro-nål Forberedelse

  1. Træk borsilicat kapillær (OD 1,2 mm, ID 0.69 mm) i en mikro-nål ved hjælp af en nål aftrækker med følgende indstillinger (550 Heat; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time).
    BEMÆRK: Indstillingerne vil variere fra filament til filament for at opnå tilsvarende formede mikronåle (se figur 1) og skal justeres, når en ny filament er installeret.
  2. Fyld en mikronål med 3 pi 0,4 um-filtreret phosphatbuffer saltvand (PBS; 137 mM NaCl; 2,7 mM KCI; 10 mM Na 2 HPO 4 1.8 mM KH 2 PO 4; pH 7,4) under anvendelse af en 20 pi microloader pipette tip.
  3. Opsætning af mikro-nål på en mikropipette holder på en mikromanipulator fastgjort til et tryk indsprøjtningssystemet. Indstil indsprøjtningstryk til 30 PSI og impulsvarigheden på 30 msek.
  4. Ved hjælp af en petriskål med destilleret vand, sænke mikro-nål indtil 1/5 af nålen er i vandet. Clip mikro-nål with fine pincet lige under vandoverfladen. Bring mikronål ud af vandet og skubbe pedalen flere gange, indtil en bolus vises.
  5. Mål diameteren af ​​bolus ved at sænke mikronål på et hæmocytometer lag med en dråbe af type A nedsænkning olie. Juster impulslængde at opnå den ønskede mængde (se tabel 1).
  6. Indstil modtryk for bolus at forblive stabil i olie (sænke trykket, hvis bolus øger volumen og øge modtrykket hvis bolusvolumen falder). Optag pulsvarigheden for hver mikro-nål.
  7. Fjern PBS fra mikro-nål ved sugning den med en microloader pipettespids og udvise venstre-over PBS ved at placere det tilbage på injektoren og spejlvende den kontinuerlige puls switch. Reserve hver mikro-nål.

3. Candida Forberedelse

  1. Streak Candida albicans transformeret med kodonoptimeret dTomato, GFP, BFP, EOS eller langtRed fra en frossen stamopløsning (-80 ° C stock i 25% glycerol) ved anvendelse af en steril træ dyvel på en gær peptine dextrose (YPD) agarplade (10 g / L gærekstrakt, 20 g / L peptone, 20 g / L dextrose 20 g / L agar, autoklaveret og hældes 25 ml i petriskåle) og inkuberes natten over ved 30 ° C.
  2. Vælg en koloni ved anvendelse af en steril træ dyvel og pode til 5 ml YPD væske (10 g / L gærekstrakt, 20 g / L peptone, 20 g / L dextrose, autoklaveret og aseptisk aliquotted i 5 ml i 16 x 150 mm glas kultur rør).
  3. Inkuber natten over ved 30 ° C i en rulle tromlen ved 60 rpm.
  4. Saml 1 ml C. albicans kultur og overførsel til et 1,7 ml sterilt centrifugerør.
  5. Centrifuger ved 5.000 xg i et par sekunder. Tøm supernatanten, og der tilsættes 1 ml sterilt PBS, vortex grundigt. Gentag dette to gange.
  6. Kolonierne anvendelse af et hæmocytometer ved fortynding af 1 ml stamopløsning 1: 1.000 i sterilt PBS.

4. Injektion Zebrafisk iDet swimbladder

  1. Varm en injektion skålen (2% agarose) i 30 minutter i en 33 ° C inkubator.
  2. På det ønskede tidspunkt, fjerne 100 af de 150 ml E3 + PTU fra 15 cm petriskål indeholdende fisken at indsprøjte anvendelse af en 25 ml pipette uden opsugning nogen zebrafisk.
  3. Bedøver 4 dpf zebrafisk ved tilsætning af 2 ml af en 4 mg / ml buffered tricaine methansulfonat lager (TR) til 50 ml medier resterende (slutkoncentration 200 ug / ml), og vent i 15 minutter.
  4. Under et dissektionsmikroskop Vælg fisk med en oppustet swimbladder. Fisk kan også screenes på det tidspunkt for homogen fænotype, såsom neutrofil fordeling i MPO: GFP linje ved hjælp af et epifluorescens dissektionsmikroskop.
  5. Fortynd C. albicans lager fra sin oprindelige koncentration (trin 3.8) til 1,5 x 10 7 kolonidannende enheder per ml (cfu / ml) i PBS.
  6. Overfør 30 zebrafisk på injektion skålen ved hjælp af en plast transfer pipette og fjerne det overskydende medier.
  7. Ved hjælp af en fiskeri-wire værktøj (0,012 tommer fiskeri diameter line super-limet ind i en borosilikat kapillarrør), lave 3 linjer af 10 fisk, ved at holde indsprøjtning skålen lodret og orientere fisken lodret.
  8. Fjern overskydende medier.
  9. Grundigt vortexes rør med 1,5 x 10 7 cfu / ml C. albicans.
  10. Fyld en mikro-nål med 3 pi C. albicans ved hjælp af en ny microloader pipettespids og indstil puls varighed til den relevante indstilling (se trin 2.9).
  11. Drej injektion skålen til at foretage en vinkel på 20 ° mellem mikro-nål og hovedet af fisken, der sigter mod bagsiden af swimbladder (figur 3A).
  12. Skub mikro-nål i swimbladder, og sørg for boring af nålen er i lumen, og tryk på pedalen en gang.
  13. Gentag for hver fisk og overføre til et opsving fad (25 ml E3 + PTU) ved at oversvømme fad med E3 end tømme den i recovery fad.
  14. Overfør anden 30 fisk til injektionen skålen.
  15. Gentag injektion med en ny mikro-nål fyldt med grundigt hvirvlet C. albicans.
  16. Afslut ved at indsprøjte PBS kontrol, om nødvendigt ved hjælp af en anden injektion skål for at undgå forurening og overføre til en separat opsving skål (trin 4.10).

5. Screening af Fisk til Ønsket Inoculum

  1. Forbered 40 ml 0,4% lavtsmeltende agarose opløsning (LMA) ved tilsætning af 160 mg af lavtsmeltende agarose til 40 ml af E3, kogning ved tilberedning i mikrobølgeovn indtil opløsning, og afkøling til 37 ° C. Der tilsættes 400 pi TR (slutkoncentration 200 ug / ml) efter afkøling.
  2. Efter 30 min nyttiggørelse, bedøve fiskene som beskrevet (trin 4.3 ved hjælp af kun 1 ml TR i 25 ml E3 + PTU, slutkoncentration 200 ug / ml).
  3. Transfer 30 fisk (med så lidt medier som muligt) til 2 ml af LMA i et vægtforhold båd.
  4. Aspirer enkelte fisk med en overførsel pipette og pladen fisk med 1 dråber LMA i en 96-brønds imaging plade, der kun bruger de 10 x 6 centrale brønde.
  5. Gentag, indtil alle fisk til skærmen er indlæst til imaging plate.
  6. Lad medierne størkne ved stuetemperatur i 5 min.
  7. Placer fisken på deres side, og sørg for at de er i kontakt med glasbund.
  8. Brug af 20X målsætning om en omvendt epifluorescens / konfokal mikroskop og den passende filter, registrere antallet af C. albicans gærceller i hver fisk s swimbladder.
  9. Vælg fisk med 15-25 gærceller i swimbladder (eller ønsket inokulum) aflive ikke udvalgt fisk (800 ug / ml TR i E3) og vende tilbage udvalgt fisk til en dyb petriskål med 50 ml E3 + PTU ved tilsætning 3 dråber E3 til imaging plate udvalgte brønde og opsugning fisk med en plast transfer pipette.
  10. Inkuber ved 33 ° C for den ønskede varighed.

6. Imaging fisk Post-screening

  1. På det ønskede tidspunkt, fjerne 25 af de 50 ml af E3 + PTU medier fra den dybe petriskål indeholdende fisk til billedet.
  2. Bedøve fisken som beskrevet (trin 4.3 ved hjælp af kun 1 ml TR i 25 ml E3 + PTU resterende, slutkoncentration 200 ug / ml).
  3. Plate fisken i en 96-brønds imaging plate og position passende (trin 5,3-5,7).
  4. Billede ved at scanne konfokal mikroskopi under anvendelse af de relevante lasere og emissionsfiltre. Første fokus på fisken ved hjælp af 4X mål i differential kontrast interferens (DIC) og erhverve billeder af området af interesse ved hjælp 20X målet med konfokale lasere i scanningstilstand med 2 usek / pixel hastighed og 1024 x 600 pixel aspekt ratio. Anskaf Z-stakke med 1 um trin størrelse, anvendelse af Kalman filter tilstand af 3 rammer.
  5. Retur til en dyb petriskål med 50 ml E3 + PTU eller ind individual brønde (24-brønds dyrkningsplade, 3 ml E3 + PTU) og inkuber ved 33 ° C.

7. dissekere swimbladder

  1. Fyld en 10 ml sprøjte med højvakuum fedt.
  2. En 2% LMA (trin 5,3 med 160 mg af lavtsmeltende agarose i 8 ml E3).
  3. På det ønskede tidspunkt, bedøve fiskene (trin 5.2).
  4. Transfer 10 fisk til et 1,7 ml centrifugerør med 1 ml E3 og aflive ved tilsætning af 200 pi af 4 mg / ml tricaine (slutkoncentration 800 ug / ml) til centrifugerøret og inkubering i 15 minutter ved stuetemperatur.
  5. Forbered et billeddannende objektglas ved at placere 4 dråber vakuum fedt i en firkant, 1 cm fra hinanden på en mikroobjektglas (75 x 25 mm, figur 2).
  6. Placer 2 dråber 2% LMA i midten af ​​pladsen.
  7. Placer en fisk på en separat glasplade under et dissektionsmikroskop og kontroller, at hjertet er holdt op med at slå, fjerne overskydende vand.
    8. (figur 4A).
  8. Løft swimbladder af pneumatiske kanal med venstre pincet, der adskiller den fra fordøjelseskanalen, og placer den i midten af ​​de 2% LMA, før det størkner.
  9. Placer en cover-slip (18 x 18 mm) på toppen af imaging objektglas og skub det, indtil det rører vakuum fedt samt LMA (figur 2).
  10. Billede inden for 10 min af dissektion som beskrevet i trin 6.4. Gentag trin 7,7-7,11 med de andre fisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikroinjektion i den bageste swimbladder

Den eksperimentelle metode præsenteres her beskriver injektion af en konsekvent dosis C. albicans gærceller i swimbladder 4 dpf zebrafisk. Tidligere arbejde med fordybelse model tyder på, at svar på swimbladder immun overfor C. albicans ligner pattedyr mucosal candidiasis 32. Her demonstrere vi en modificeret infektion metode, der er mere ligetil, reproducerbar og hurtig; flere hundrede zebrafisk kan injiceres og screenes inden for et par timer.

Nøjagtig og reproducerbar infektion i swimbladder opnås ved at målrette den bageste område af orglet ved mikroinjektion. Injektion i swimbladder er lettere at lære end de fleste andre mikroinjektion ruter til larver eller embryonale zebrafisk (f.eks intravenøs eller baghjerne ventrikel). Fremstillingen af ​​fisken før injektion er SimiLAR til andre injektionssteder, med den undtagelse, at swimbladder skal pustes så fiskene er ældre. Ca. 75% af de fisk, der rejses ved 33 ° C har en oppustet swimbladder med 4 dpf (data ikke vist). Den swimbladder er placeret under en epidermal samt tynde muskel lag og det mikro-nål, der anvendes til at injicere fisken skal affaset. Den vinkel, hvor fisken injiceres (figur 3A) også i høj grad forbedrer hastigheden og lethed af proceduren. Injektion af bolus på bagsiden af ​​swimbladder er vigtigt, da det tillader visualisering af alle gærcellerne ved screening og undgår tilstedeværelsen af ​​gærceller på hver side af swimbladder, som vil forvrænge udvælgelsen rækkevidde. Injektion mod bagsiden af ​​swimbladder undgår også et muligt tab af inoculum gennem den pneumatiske ledning og derefter ned i fordøjelseskanalen. Kontrol hvilke fisk er blevet indsprøjtet er forholdsvis let som bolus fortrænger luftboblen ogbagsiden af swimbladder fyldes efterfølgende med medier (figur 3C). Det er også muligt at anvende phenolrødt ved injektion, hvilket vil gøre visualisering lettere. På grund af størrelsen af C. albicans gærceller (3-4 um), er inokulum dosis begrænset til koncentrationer under 5 x 10 7 cfu / ml på grund af tilstopning af mikro-nål. Dette tillader indsprøjtning på mellem en og 250 gærceller inden for en 5 nl bolus. I vores hænder, indsprøjtning 4 nl på 1-1,5 x 10 7 cfu / ml gav de mest konsistente resultater. Dette resulterede i en række af 10-50 gærceller pr fisk. Indsnævring af inokulum til 15-25 gærceller (figur 3B) giver en strammere fænotype og svar. Ved anvendelse af disse betingelser, ca. 50% af den injicerede fisk har passende inokulum sortiment med over 95% overlevelse 24 timer efter injektion (data ikke vist). Det er også muligt at holde fisk med en højere / lavere inokulum for at undersøge effekten af ​​patogenet byrdesygdomsudvikling.

Den swimbladder er ca. 100 nl totale volumen (400 x 200 x 200 um, L x H x B, ved hjælp af formlen for rumfanget af en ellipsoide), så injektion af større mængder er også muligt (op til 3 pulser af 4 nl har været anvendes uden nogen signifikant virkning på overlevelsen af ​​fisk; data ikke vist).

Longitudinal intravital billeddannelse af fisk til at følge både vært og patogen adfærd

Adfærd både vært og patogen kan følges ikke-invasivt i flere dage ved hjælp af denne model. Evnen til at afbilde udviklingen af infektionen ved høj opløsning in vivo kan og er blevet anvendt til at undersøge patogenesen af mukøs candidiasis. Neutrofiler spiller en central rolle i resistens over for candidiasis i mus og mennesker 35-38. Brug af MPO: GFP zebrafisk 39 (neutrofiler udtrykker grønt fluorescerende protein), og C. albicans udtrykker dTomATO rødt fluorescerende protein 32, har vi observeret neutrophil- Candida dynamik under tidlig infektion (figur 4).

Neutrofiler er de første medfødte celletype at blive ansat til stedet for slimhinde-infektion, og infektion i swimbladder med levende C. albicans fører til en hurtig og kontinuerlig rekruttering af neutrofiler (figur 4A, B). Det er interessant, neutrofiler ikke væsentligt rekrutteret til swimbladder når varmedræbte gærceller blev injiceret (figur 4A, B).

Filamenter udvikle sig hurtigt efter injektion af gærceller og C. albicans fortsat at spire i de første 48 timer efter injektion (HPI). Men efter dette punkt antal filamenter aftager (figur 4D), og andelen af gær stiger (ikke vist). Evnen til at følge enkelte fisk ikke-invasivt kan sikre disse længdesnitsundersøgelser (plade med 24 brøndevævskulturskåle) og sætter fokus på de individuelle forskelle i sygdomsprogression og vært responser (figur 4C). Sådanne detaljerede undersøgelser opregner svampe- og immunceller på stedet for infektion i løbet af flere dage forbliver upraktisk i mus.

En hurtig swimbladder dissektion teknik til at forbedre billeddannelse

Imaging interaktionen af immune eller epitelceller med C. albicans er forholdsvis let i modellen præsenteres her. Men i visse tilfælde, tilstedeværelsen af ​​luftboblen og tykkelsen af ​​det væv, der omgiver swimbladder, hud og muskler, kompromitterer detaljeret rumlig opløsning. For at forbedre billedkvaliteten har vi udviklet en metode til at dissekere swimbladder ud af zebrafisk og billede, den hurtigt (inden for 10 min) ved konfokal mikroskopi (figur 5A). Dette er især nyttigt, når billeddannelse transgene fisk strækninger, hvor fluorescens udtrykkes ubikvitærtog der er uvedkommende fluorescens i det omgivende væv, såsom NF-KB: GFP 40 eller α-catenin: Citrin linier 41,42 (figur 5B, C). Teknikken kræver fingerfærdighed og praksis at udføre hurtigt, men det er muligt fuldstændigt billede 95% af alle fisk forsøgt.

Figur 1
Figur 1: Micro-nål form for swimbladder injektion. (A) Oversigt over mikro-nål form og måling. (B) Forstørrelse af mikro-nålespidsen fra A. Hver større lodret streg i B er 0,2 mm.

Figur 2
Figur 2: Billedbehandling dias. En 2% LMA dråbe er placeret i midten af ​​4 prikker af vakuum fedt, 1 cm fra hinanden på en glasplade. Den theseCTED swimbladder er placeret i midten af ​​LMA og et dækglas sænkes oven, indtil den kommer i kontakt med LMA og vakuum fedt.

Figur 3
Figur 3: Injektion af C. albicans i swimbladder forbliver lokaliseret til injektionsstedet. (A) Skematisk af orientering og placering af mikro-nål at injicere C. albicans ind bag på swimbladder i 4 dpf zebrafisk larver. (B) Repræsentant inokulum efter selektion til injektion bolus på 15-25 gærceller ved epifluorescens mikroskopi 3 forskellige grupper af fisk. Middel og standardfejl af middelværdien er repræsenteret, n = 17, 17, og 20 for gruppe A, B og C. (C) Repræsentative billeder af C. albicans (CaF2-dTom, rød fluorescens udtrykker Candida) infektion i AB juvenile zebrafisk straks efter Injektion. Billeder er erhvervet med 10X og 20X mål (venstre og højre paneler, henholdsvis) og er kompositter af maksimale fremskrivninger i den røde kanal (12 og 19 skiver, henholdsvis) med en enkelt skive i DIC-kanalen. Oversigt over luftboblen (gul) og epitelforingen (hvid) er repræsenteret i venstre panel. Scale søjler repræsenterer 250 og 50 um, henholdsvis. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4: swimbladder injektion tillader spatio-temporale dissektion af host patogen dynamik. (A) Repræsentative billeder af MPO: GFP fisk linje injiceret med levende eller varme dræbt (HK) CaF2-dTom i swimbladder ved 4 dpf og filmede 48 HPI. Billeder er kompositter af maksimal projektion på det grønne and røde kanaler (20 skiver) og en enkelt skive i DIC-kanalen. Skalapanelerne repræsenterer 100 um. (B, C). Værtsrespons til C. albicans infektion. Neutrofiler rekrutteres til stedet for infektion (SOI) så tidligt som 6 HPI og holde på stigende i antal i løbet af 48 timer. Muligheden for at billede og holde de enkelte fisk separeret (plade med 24 brønde) giver detaljerede immune dynamik visualiseres. (D) Patogen respons. C. albicans gærceller spire i de første 24 HPI men vende tilbage til gærceller fra 24 HPI. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Dissektion af swimbladder tillader finere detaljer, der skal afbildes. (A) Skematisk repræsentation af than trin i dissektion af swimbladder i 4-5 dpf zebrafisk. Blå pile angiver retningen af at trække med en pincet (L for venstre og H for højre). (B, C). Repræsentative billeder af dissekeret swimbladder fra α-catenin: citrine fisk line 41,42 (grønne tight junctions) injiceret ved 4 dpf med C. albicans (CaF2-dTom) og afbildet ved konfokal mikroskopi 2 hpi. Paneler er kompositter af maksimale projektioner i de røde og grønne kanaler (25 skiver for B og 3 skiver for C) og en enkelt skive for DIC i panelet B. Scale stænger 100 um i B og 100 um og 10 um i C. Venligst klik her for en større version af dette tal.

Volumen (nl) 1 2 3 4 5
Diameter (mm) 0,124 0,156 0,179 0,197 0.212

Tabel 1: bolusvolumen til diameter forholdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskud og begrænsninger i swimbladder mikroinjektion sygdomsmodel

Modellen præsenteres her er en forlængelse af slimhinde-candidiasis fordybelse model beskrevet i Gratacap et al (2013).; det tilføjer fordelene ved en kontrolleret infektion tid, en meget reproducerbar infektion dosis og derfor forbedret effektivitet. Vi viser her nye metoder, der tillader ikke-invasiv tidsmæssig dokumentation af infektion dynamik i stor detalje samt højere opløsning ex vivo billeddannelse af swimbladder. Disse procedurer bør lette studiet af C. albicans -innate immunsystem interaktion dynamik på slimhinden. Et begrænset antal slimhindeinfektion modeller er blevet beskrevet i zebrafisk, alle begrænset til fordøjelseskanalen forstyrrelse / infektioner 24,43. Den swimbladder model præsenteres her udvider steder med infektion til et organ, der deler nogle ligheder til lungerne og tilbyder en begrænset webstedinfektion, med mindre mulighed for patogenet at blive vasket væk.

Der er flere kritiske faktorer, der skal tages i betragtning ved mastering disse teknikker. Det vigtigste punkt er kravet om en oppustet swimbladder. Dette kræver, at fisk, der skal lagres på 5 dpf når opdrættes ved 28 ° C eller 4 dpf ved 33 ° C. Denne højere temperatur anvendes til at fremskynde udviklingen af fisk og bedre tilnærme fysiologiske række Pattedyrsepithelcelle temperaturer (musehud temperatur er 33,1 ° C 44). Begrænsning af denne model til især dette temperaturområde skal dog være opmærksom på, og observerede fænotyper skal kontrolleres i et pattedyr for mere komplet fortolkning. Injektionsstedet (den bageste swimbladder) er også kritisk, da den pneumatiske kanal forbliver åben i physostomous fisk (som omfatter zebrafisk) og højtryks-injSEKTION andetsteds i organet kan skubbe patogenet forbi swimbladder og ind i fordøjelseskanalen. Kvantificering af inoculum er også mindre nøjagtige, hvis gærcellerne er ikke alle på bagsiden af ​​swimbladder, fordi tykkelsen af ​​fisken i bagagerummet gør det vanskeligt at visualisere begge sider af swimbladder. Dissektion af swimbladder kræver fingerfærdighed og billeddannelse skal finde sted umiddelbart efter at undgå artefakter på grund af den fysiske traumer af proceduren.

Begrænsningerne i teknikken er hovedsageligt relateret til udviklingsstadiet af fisken. Dette begrænser brugen af ​​morpholino teknologi til et par dage af undersøgelsen, og knockdown effekt skal nøje testet for at diskriminere mellem hel eller delvis effekt. Morpholino aktivitet denne sent i udvikling er blevet tidligere rapporteret, og vi har også med succes brugt morpholinos i denne model, med validerede splejse-blokering, der var stadig effektiv ved 5 dpf. Anvendelsen af ​​pharmacological lægemidler kan være et godt alternativ i denne model, da der ikke er nogen begrænsning for en alder af fisken. Brugen af ​​fisk forbi 72 timer efter befrugtningen kræver nogle gange mere tilsyn end at arbejde med larver zebrafisk, afhængigt af de institutionelle dyr pleje og brug udvalg. Længden af undersøgelsen er også hæmmet, da zebrafisk ikke overlever ved høje satser for mere end 10 dage i statiske laboratorieforhold 45. På den anden side, ved hjælp af juvenile fisk af 5 dpf udvikling i stedet for yngre fostre eller larver muliggør studier, hvor alle organer såsom nyrer, lever eller bugspytkirtel er fuldt funktionelle 46-49. Sammenlignet med in vitro-cellekultur eller in vivo murine modeller, antallet af reagenser tilgængelige (antistoffer og kemiske antagonister-agonister) er begrænset i zebrafisk; dog mulighed for at tilføje kemikalier direkte til medierne er en fordel. Antallet af knockout og banke-på zebrafisk er stadig begrænset, men RISe af målrettet genom redigering åbner spændende muligheder for generering af mutanter. Kombinationen af ​​den relative lethed at konstruere fluorescerende reporter linjer (celletype-specifik eller signalvejen-specifik) med gennemsigtigheden af ​​unge zebrafisk fortsat et af de primære og unikke fordele ved dette system.

Ser frem

Zebrafisken swimbladder infektion model udvider rækken af ​​spørgsmål, som kan blive bedt om værtspatogene interaktion på hvirveldyr slimhindeepitelet, der tilbyder en ny smittevej for andre patogener, der invaderer gennem epitelet og fremhæve nytten af ​​dette organ til sondering hvirveldyr sygdom .

Zebrafisk modeller af epitelial infektion på slimhinde-niveau er blevet offentliggjort, at sonde virkningerne af tarmkanalen forstyrrelse af narkotika eller patogen 24,43. Men denne mucosal candidiasis model er den første til at udnytte swimbstige og dermed udvider række steder med infektion, der kan undersøges i zebrafisk over fordøjelseskanalen. Forskelle mellem swimbladder slimhindeoverfladen og pattedyrs lunger er ikke fuldstændigt belyst og fortolkning / oversættelse af data fra denne model højere hvirveldyr bør foretages med forsigtighed.

Den swimbladder infektion udfylder et nuværende hul i hvirveldyr infektionsmodeller og åbner et vindue til afbildning samspillet mellem medfødte immun / epitelceller med et patogen. Nu er en bred vifte af spørgsmål, der tidligere off-grænser, er muligt at udforske. Vi kan bestemme interaktionerne mellem forskellige medfødte immunceller med hinanden og med epitelceller, deres spatio-temporale rekruttering, og arten af C. albicans proliferation og morfologiske skift i forhold til immunangreb og sygdomsprogression i et ikke-immunsupprimerede vært. Muligheden for at billedet en intakt vært i flere timer til dage i grepå detaljer repræsenterer en indlysende og væsentlig fordel ved dette system.

Endelig ontologiske og genekspression ligheder mellem swimbladder og pattedyr lunge yderligere foreslå, at målrette dette organ med gen knockdown eller kemiske stoffer kan afsløre konserverede mekanismer mikrobiel-lunge interaktion og immunologi 50-52.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Le Trinh og Dr. Tobin for generøst giver den α-catenin: citrin fisk linje og Bill Jackman for at tillade os at gøre optagelserne i sit laboratorium. Forfatterne anerkender finansieringskilderne National Institutes of Health (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 og R15AI094406) og USDA (Projekt # ME0-H-1-00517-13). Dette håndskrift er offentliggjort som Main landbrug og skovbrug Experiment Station publikation nummer 3371.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 ml tubes Axygen MCT-175-C
Deep Petri dishes Fisher Scientific 89107-632
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726
Peptone VWR Scientific 90000-264
Dextrose Fisher Scientific D16-1
Agar VWR Scientific 90000-760
Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) Fine Science Tools 11251-30
Wooden dowels VWR Scientific 10805-018
Low melt agarose VWR Scientific 12001-722
Flaming Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Borosilicate capillary Sutter Instruments BF120-69-10
MPPI-3 injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222
Dissecting microscope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
20X microscope objective Olympus UPlanSApo 20x/0.75
Roller drum New Brunswick Scientific TC-7
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
Glass culture tubes (16 x 150 mm) VWR Scientific 60825-435
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
HEPES (Corning) VWR Scientific BDH4520-500GP
Children clay (Play-Doh) Hasbro
CaCl2 Fisher Scientific C69-500
Methylene blue VWR Scientific VW6276-0
PTU Sigma P7629-10G
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712
Hemocytometer (Hausser scientific) VWR Scientific 15170-172
Type A immersion oil Blue Marble Products 51935
Centrifuge Eppendorf 5424
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
Agarose (Lonza) VWR Scientific 12001-870
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Fishing wire Stren
96 well imaging plate (Sensoplate) Greiner Bio-One 655892
High vacuum grease (Dow Corning) VWR Scientific 59344-055
Microslide (25 x 75 mm) VWR Scientific 48300-025
Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 VWR Scientific 48366-045
15 cm Petri dish (Olympus plastics) Genesee Scientific 32-106
Glycerol (EMD chemicals) VWR Scientific EMGX0185-5
24-well culture dish (Olympus plastics) Genesee Scientific 25-107
Weight boats (8.9 cm) VWR Scientific 89106-766

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675 (2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815 (2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019 (2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549 (2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

Tags

Immunologi zebrafisk mucosal candidiasis mucosal infektion epitelbarriere epitelceller medfødte immunitet swimbladder,
Modeling Mucosal Candidiasis i Larve Zebrafisk af swimbladder Injection
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C.,… More

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection. J. Vis. Exp. (93), e52182, doi:10.3791/52182 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter