Abstract
Difesa precoce contro i patogeni delle mucose consiste sia una barriera epiteliale e cellule immunitarie innate. La immunocompetency di entrambi, e la loro intercomunicazione, sono di primaria importanza per la protezione contro le infezioni. Le interazioni di cellule immunitarie innate epiteliali e con un agente patogeno è meglio studiati in vivo, in cui il comportamento complesso si sviluppa nel tempo e nello spazio. Tuttavia, i modelli esistenti non consentono un facile spazio-temporale delle immagini della battaglia con i patogeni a livello della mucosa.
Il modello sviluppato qui crea un'infezione della mucosa con iniezione diretta del patogeno fungino, Candida albicans, nella vescica natatoria di zebrafish giovanile. L'infezione risultante permette imaging ad alta risoluzione di comportamenti epiteliale e innata cellule immunitarie durante lo sviluppo della malattia della mucosa. La versatilità di questo metodo permette di interrogatorio di accoglienza per sondare la sequenza riportata di eventi immunitari che portano a phreclutamento agocyte e di esaminare il ruolo di particolari tipi di cellule e percorsi molecolari nella protezione. Inoltre, il comportamento del patogeno come funzione di attacco immunitario può essere ripreso simultaneamente utilizzando proteine esprimono fluorescente C. albicans. Risoluzione spaziale Aumento della interazione ospite-patogeno è possibile anche utilizzando la tecnica rapida vescica natatoria dissezione descritta.
Il modello di infezione della mucosa descritto qui è semplice e altamente riproducibile, che lo rende uno strumento prezioso per lo studio della mucosa candidosi. Questo sistema può anche essere sostanzialmente traducibile ad altri patogeni mucosali come microbi micobatteri, batteriche o virali che normalmente infettano attraverso superfici epiteliali.
Protocol
NOTA: Tutti i protocolli di cura zebrafish ed esperimenti sono stati eseguiti in conformità alle linee guida NIH sotto Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocollo A2012-11-03.
1. Zebrafish allevamento a 4 giorni dopo la fecondazione
- Raccogliere AB zebrafish, o qualsiasi altra linee transgeniche, entro il primo 3 ore dopo la fecondazione, come mostrato in un altro video 34.
- Incubare 120 uova in un 15 centimetri piastre Petri contenenti 150 ml di E3 Media (5 NaCl mm 0,17 mM KCl; 0,33 mm CaCl 2; 0,33 mm MgCl 2; 2 HEPES mM; pH 6.8) con il blu di metilene (0,3 mg / ml finale concentrazione) in un incubatore a 33 ° con 12/12 luce / buio fotoperiodo.
- Sostituire la media dopo 6 ore con E3 + PTU (1-fenil-2-tiourea, 10 mg / ml concentrazione finale) e rimuovere le uova morti.
- Incubare per 4 giorni a 33 ° C, lo scambio dei mezzi con fresca E3 + PTU dopo 2 giorni.
2. Inproiezione Micro-ago Preparazione
- Estrarre borosilicato capillare (OD 1,2 millimetri; ID 0,69 millimetri) in un micro-ago con un estrattore ago con le seguenti impostazioni (550 Calore, 0 Pull, 130 Velocity; 110 Time).
NOTA: Le impostazioni variano da filamento a filamento per ottenere micro-aghi di forma simile (vedi Figura 1) e dovrà essere riadattato ogni volta che viene installato un nuovo filamento. - Riempire un micro-ago con 3 ml di 0,4 micron filtrata salina tampone fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4; 1,8 mm KH 2 PO 4; pH 7.4) con un 20 microlitri microloader pipetta tip.
- Impostare il micro-ago su un supporto micropipetta su un micromanipolatore collegata ad un sistema di iniezione a pressione. Impostare la pressione di iniezione a 30 PSI e la durata dell'impulso a 30 msec.
- Utilizzando una piastra di Petri con acqua distillata, abbassare il micro-ago fino a 1/5 dell'ago è nell'acqua. Agganciare il micro-ago with pinzette sottili appena sotto il livello dell'acqua. Portare il micro-ago fuori dall'acqua e spingere il pedale più volte fino a visualizzare un bolo.
- Misurare il diametro del bolo abbassando il micro-ago su un emocitometro strati con una goccia di tipo A olio per immersione. Regolare la durata dell'impulso per ottenere il volume desiderato (vedi tabella 1).
- Impostare la contropressione per il bolo di rimanere stabile in olio (abbassare la pressione se il bolo aumenta il volume e aumentare la contropressione se il volume di bolo diminuisce). Registrare la durata dell'impulso per ogni micro-ago.
- Rimuovere la PBS dal micro-ago aspirando usando un puntale microloader ed espellere la sinistra-over PBS ponendolo nuovamente l'iniettore e lanciando l'interruttore di impulso continuo. Prenotare ogni micro-ago.
3. Candida Preparazione
- Streak Candida albicans trasformate con codone ottimizzato dTomato, GFP, BFP, EOS o RemotoRed da uno stock congelati (-80 ° C magazzino in 25% glicerolo) utilizzando un bastoncino di legno su una sterile destrosio lievito peptine (YPD) piastra di agar (10 g estratto / L di lievito, 20 g / L peptone, 20 g / L di destrosio , 20 g / L di agar, autoclave e versò 25 ml in piastre di Petri) e incubare una notte a 30 ° C.
- Scegliere una colonia utilizzando un bastoncino di legno sterile e inoculare 5 ml di liquido YPD (estratto di 10 g / L di lievito, 20 g / L peptone, 20 g / L di destrosio, autoclavato e asetticamente aliquotato in 5 ml di 16 x 150 mm coltura vetro tubi).
- Incubare per una notte a 30 ° C in un tamburo a rulli a 60 rpm.
- Raccogliere 1 ml di C. cultura albicans e il trasferimento in un 1,7 ml provetta da centrifuga sterile.
- Centrifugare a 5.000 g per un paio di secondi. Svuotare il surnatante e aggiungere accuratamente 1 ml di PBS sterile, vortice. Ripetere due volte.
- Contare le colonie usando un emocitometro diluendo 1 ml di brodo 1: 1000 in PBS sterile.
4. Iniettare Zebrafish inla vescica natatoria
- Riscaldare un piatto di iniezione (2% agarosio) per 30 min in un incubatore a 33 °.
- Al tempo desiderato, rimuovere il 100 dei 150 ml di E3 + PTU dalla piastra Petri 15 centimetri contenente il pesce per iniettare utilizzando una pipetta 25 ml senza aspirare alcun zebrafish.
- Anestetizzare 4 dpf zebrafish aggiungendo 2 ml di un / ml tamponato tricaine metano sulfonato magazzino 4 mg (TR) per i 50 ml supporti rimanenti (concentrazione finale di 200 mg / ml) e attendere 15 min.
- Sotto un microscopio da dissezione, selezionare il pesce con una vescica natatoria gonfiato. Pesce può anche essere proiettato in quel momento per fenotipo omogeneo, come la distribuzione dei neutrofili in mpo: linea GFP utilizzando un epifluorescenza dissezione microscopio.
- Diluire il C. albicans magazzino dalla sua concentrazione iniziale (fase 3.8) a 1,5 x 10 7 unità formanti colonia per ml (ufc / ml) in PBS.
- Trasferire 30 zebrafish sul piatto di iniezione con un tubo di plastica di trasferimentotte e rimuovere il supporto in eccesso.
- Utilizzando uno strumento di pesca-wire (0,012 pollici di diametro filo da pesca super-incollato in un capillare borosilicato), fare 3 linee di 10 pesci, tenendo il piatto iniezione verticale e orientare il pesce in verticale.
- Togliere la carta in eccesso.
- Vortice accuratamente il tubo con 1,5 x 10 7 CFU / ml C. albicans.
- Riempire un micro-ago con 3 ml di C. albicans utilizzando una nuova punta microloader pipetta e impostare la durata dell'impulso per l'impostazione appropriata (vedere il punto 2.9).
- Ruotare il piatto iniezione per formare un angolo di 20 ° tra il micro-ago e la testa del pesce, puntando verso la parte posteriore della vescica natatoria (Figura 3A).
- Premere il micro-ago nella vescica natatoria, assicurandosi che il foro dell'ago sia nel lume, e premere il pedale una volta.
- Ripetere l'operazione per ogni pesce e trasferire a un piatto di recupero (25 ml E3 + PTU) inondando il piatto con un E3d svuotamento nel piatto di recupero.
- Trasferire altri 30 pesce al piatto iniezione.
- Ripetere l'iniezione con un nuovo micro-ago riempito con fondo in agitazione C. albicans.
- Fine iniettando controllo PBS, se necessario, usando un piatto diversi di iniezione per evitare la contaminazione e versare in un piatto di recupero separato (passo 4.10).
5. Screening il pesce per desiderata Inoculum
- Preparare 40 ml di 0,4% bassofondente soluzione di agarosio (LMA) aggiungendo 160 mg di agarosio a basso punto di fusione 40 ml di E3, in ebollizione da microonde fino a completa dissoluzione e raffreddamento a 37 ° C. Aggiungere 400 ml di TR (concentrazione finale di 200 mg / ml), una volta raffreddato.
- Dopo 30 min di recupero, anestetizzare il pesce come descritto (passo 4.3 usando solo 1 ml di TR in 25 mL E3 + PTU, concentrazione finale 200 mg / ml).
- Trasferimento 30 pesci (con il minor numero possibile di mezzi) a 2 ml di LMA in una barca di peso.
- Aspirare singoli pesci con una pipetta di trasferimento e piatto il pesce con 1 goccia di LMA in una piastra di imaging a 96 pozzetti, utilizzando solo i 10 x 6 pozzi centrali.
- Ripetere fino a quando tutti i pesci di schermo vengono caricati alla piastra di imaging.
- Ai media solidificano a temperatura ambiente per 5 min.
- Posizionare il pesce dalla loro parte, facendo in modo che siano a contatto con il fondo di vetro.
- Usando l'obiettivo 20X su un epifluorescenza / microscopio confocale invertita e il filtro appropriato, registrare il numero di C. cellule di lievito albicans in vescica natatoria di ogni pesce.
- Selezionare il pesce con 15-25 cellule di lievito nella vescica natatoria (o inoculo desiderato), eutanasia non selezionata pesce (800 ug / ml di TR in E3) e ritornare pesci selezionato in un piatto profondo Petri con 50 ml di E3 + PTU by aggiungendo 3 gocce di E3 alla piastra di imaging pozzetti selezionati ed aspirando il pesce con una pipetta di plastica trasferimento.
- Incubare a 33 ° C per la durata desiderata.
6. Imaging the Fish post-selezione
- Al momento desiderato, eliminare 25 dei 50 ml di media E3 + PTU dalla capsula di Petri profondo contenente il pesce di immagine.
- Anestetizzare il pesce come descritto (passo 4.3 usando solo 1 ml di TR in 25 ml E3 + PTU rimanente, la concentrazione finale di 200 mg / ml).
- Piatto il pesce in un piatto di imaging 96-bene e la posizione in modo appropriato (passi 5,3-5,7).
- Immagine di scansione microscopia confocale utilizzando i laser appropriati e filtri di emissione. Prima concentrarsi sul pesce con l'obiettivo 4X in contrasto interferenziale differenziale (DIC) e di acquisire immagini della regione di interesse utilizzando l'obiettivo 20X con i laser confocale in modalità di scansione con 2 velocità msec / pixel e 1024 x 600 pixel aspect ratio. Acquisire Z-stack con 1 micron dimensione del passo, applicando modalità filtro Kalman di 3 fotogrammi.
- Ritorno a un piatto fondo di Petri con 50 ml E3 + PTU o in individuapozzi l (piatto 24 pozzetti cultura, 3 ml E3 + PTU) e incubare a 33 ° C.
7. Dissecting la vescica natatoria
- Riempire una siringa da 10 ml con grasso alto vuoto.
- Preparare una LMA 2% (passo 5,3 con 160 mg di bassa fusione agarosio in 8 ml di E3).
- Al momento desiderato, anestetizzare il pesce (fase 5.2).
- Trasferire 10 pesci in una provetta 1,7 ml centrifuga con 1 ml di E3 e euthanize aggiungendo 200 ml di 4 mg / ml Tricaine (concentrazione finale 800 mg / ml) al tubo da centrifuga e incubando per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare un vetrino di imaging ponendo 4 gocce di grasso per vuoto in un quadrato, distanti 1 cm su un MicroSlide (75 x 25 mm, Figura 2).
- Mettere 2 gocce di 2% LMA nel centro della piazza.
- Posizionare un pesce su un vetrino separato sotto un microscopio da dissezione e verificare che il cuore ha smesso di battere, rimuovere l'acqua in eccesso.
- Sollevare la vescica natatoria dal condotto pneumatico con le pinzette sinistra, separandolo dal tratto digerente, e posizionarlo al centro della LMA 2% prima che solidifica.
- Inserire una copertura antiscivolo (18 x 18 mm) sulla parte superiore del vetrino imaging e spingerla fino a toccare il grasso per vuoto, nonche la LMA (Figura 2).
- Immagine entro 10 minuti di dissezione, come descritto al punto 6.4. Ripetere il passaggio 7,7-7,11 con gli altri pesci.
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Representative Results
Microiniezione nella vescica natatoria posteriori
Il metodo sperimentale qui presentato descrive l'iniezione di una dose costante di C. cellule di lievito albicans nella vescica natatoria di 4 dpf zebrafish. Lavoro precedente con il modello di immersione suggerisce che la risposta immunitaria vescica natatoria a C. albicans è simile a mammiferi mucosa candidosi 32. Qui mostriamo un metodo di infezione modificato che è più semplice, riproducibile e rapida; diverse centinaia di zebrafish può essere iniettato e proiettati all'interno di un paio di ore.
Infezione accurata e riproducibile della vescica natatoria si ottiene mira la zona posteriore del organo di microiniezione. Iniezione nella vescica natatoria è più facile da imparare rispetto a molti altri percorsi microiniezione di zebrafish larvale o embrionali (ad esempio, per via endovenosa o ventricolo rombencefalo). La preparazione del pesce prima dell'iniezione è similare a quello per gli altri siti di iniezione, con l'eccezione che la vescica natatoria deve essere gonfiato in modo che i pesci sono più vecchi. Circa il 75% dei pesci allevati a 33 ° C hanno una vescica natatoria gonfiato da 4 DPF (dati non riportati). La vescica natatoria si trova sotto un epidermica nonché strato muscolare sottile e il micro-ago usato per iniettare il pesce deve essere smussato. L'angolo a cui il pesce è iniettato (Figura 3A) migliora notevolmente la velocità e la facilità della procedura. Iniezione del bolo sul retro della vescica natatoria è importante in quanto permette di visualizzare tutte le cellule di lievito quando vagliatura ed evita la presenza di cellule di lievito su ciascun lato della vescica natatoria, che inclinare l'intervallo di selezione. Iniettando verso il retro della vescica natatoria evita anche una possibile perdita dell'inoculo attraverso il condotto pneumatico e poi lungo il tratto digestivo. Verifica che il pesce è stato iniettato è relativamente facile come il bolo sposta la bolla d'aria e laposteriore della vescica natatoria viene successivamente riempito con i media (Figura 3C). È anche possibile utilizzare rosso fenolo l'iniezione, che renderà più facile la visualizzazione. A causa delle dimensioni di C. cellule di lievito albicans (3 - 4 micron), la dose di inoculo è limitata a concentrazioni inferiori a 5 x 10 7 cfu / ml causa intasamento del micro-ago. Ciò consente l'iniezione di tra uno e 250 cellule di lievito a 5 bolo nl. Nelle nostre mani, iniettando 4 nl a 1-1,5 x 10 7 CFU / ml hanno dato i risultati più consistenti. Ciò ha determinato un intervallo di 10-50 cellule di lievito per pesci. Restringendo l'inoculo di 15-25 cellule di lievito (Figura 3B) dà un fenotipo più stretto e la risposta. Utilizzando queste condizioni, circa il 50% dei pesci iniettati ha la gamma inoculo appropriata con iniezione oltre il 95% di sopravvivenza dopo 24 ore (dati non mostrati). È anche possibile mantenere i pesci con un / più elevato inoculo inferiore per investigare l'effetto del patogeno oneresviluppo della malattia.
La vescica natatoria è di circa 100 volume totale nl (400 x 200 x 200 micron, L x H x W, utilizzando la formula per il volume di un ellissoide) in modo iniezione di volumi è anche possibile (fino a 3 impulsi di 4 nl stato utilizzato senza alcun effetto significativo sulla sopravvivenza del pesce; dati non mostrati).
Longitudinale di imaging intravitale di esemplari da seguire sia host e comportamento patogeno
Il comportamento di entrambi ospite e patogeno può essere seguito in modo non invasivo per diversi giorni, utilizzando questo modello. La capacità di immagine allo sviluppo dell'infezione ad alta risoluzione in vivo può ed è stato utilizzato per esaminare la patogenesi della candidiasi mucosale. I neutrofili giocano un ruolo chiave nella resistenza alla candidosi in topi e nell'uomo 35-38. Usando mpo: zebrafish GFP 39 (neutrofili esprimono la proteina fluorescente verde), e C. albicans esprimendo il dTomato proteina fluorescente rosso 32, abbiamo osservato le dinamiche Candida neutrophil- durante l'infezione precoce (Figura 4).
I neutrofili sono il primo tipo di cellula innata di essere reclutati per il sito di infezione della mucosa, e l'infezione della vescica natatoria con live C. albicans porta ad una rapida e continua il reclutamento di neutrofili (Figura 4A, B). È interessante notare che i neutrofili non sono sostanzialmente reclutati per la vescica natatoria quando le cellule di lievito-calore uccise sono state iniettate (4A, B).
Filamenti sviluppano rapidamente dopo l'iniezione di cellule di lievito e C. albicans continua a germinare per il primo post iniezione 48 ore (HPI). Tuttavia, dopo questo punto il numero di filamenti diminuisce (Figura 4D) e la percentuale di aumenti di lievito (non mostrato). La possibilità di seguire ogni singolo pesce consente in modo non invasivo questi studi longitudinali (24-pozzettipiastre di coltura dei tessuti) e mette in evidenza le differenze individuali nella progressione della malattia e di risposta dell'ospite (Figura 4C). Tali studi approfonditi enumerazione cellule fungine e immunitarie al sito di infezione per diversi giorni rimangono impraticabile nel topo.
Una rapida tecnica di vescica natatoria dissezione per migliorare l'imaging
Imaging l'interazione delle cellule immunitarie o epiteliali con C. albicans è relativamente facile nel modello qui presentato. Tuttavia, in alcune circostanze, la presenza di bolle d'aria e lo spessore del tessuto circostante la vescica natatoria, pelle e muscoli, compromette risoluzione spaziale dettagliata. Per migliorare la qualità delle immagini che abbiamo messo a punto un metodo per analizzare la vescica natatoria dalla zebrafish e immagini rapidamente (entro 10 min) mediante microscopia confocale (Figura 5A). Ciò è particolarmente utile quando l'imaging linee transgeniche di pesce in cui la fluorescenza è ubiquitariamente espressae vi è la fluorescenza estranei nel tessuto circostante, quali NF-kB: GFP 40 o α-catenina: linee citrino 41,42 (Figura 5B, C). La tecnica richiede destrezza e pratica effettuare rapidamente, ma è fattibile completamente immagine 95% di tutti i pesci tentativo.
Figura 1: forma Micro-ago per l'iniezione vescica natatoria. (A) Panoramica della forma e misura micro-ago. (B) ingrandimento della punta micro-ago dalla A. Ogni linea verticale importante in B tra 0,2 mm.
Figura 2: Imaging scivolo. Un 2% LMA calo si trova nel bel mezzo di 4 punti di grasso per vuoto, 1 cm di distanza su un vetrino. Il DisseCTED vescica natatoria si trova nel centro della LMA e un vetrino si abbassa in cima fino a quando non entra in contatto con la LMA e il grasso per vuoto.
Figura 3: Iniezione di C. albicans nella vescica natatoria rimane localizzata al sito di iniezione. (A) Schema del orientamento e la posizione del micro-ago per iniettare C. albicans nella parte posteriore della vescica natatoria in 4 dpf larve zebrafish. (B) inoculo rappresentante dopo selezione per bolo di 15-25 cellule di lievito mediante microscopia in epifluorescenza per 3 diversi gruppi di pesci. La media e l'errore standard della media è rappresentato, n = 17, 17, e 20 per i gruppi A, B, e C, rispettivamente. (C) Immagini rappresentative di C. albicans (CaF2-dTom, fluorescenza rossa esprimendo Candida) infezione in AB giovanile zebrafish subito dopo Injection. Le immagini sono state acquisite con 10X e 20X obiettivi (pannelli sinistro e destro, rispettivamente) e sono composti di proiezioni al massimo nel canale rosso (12 e 19 fette, rispettivamente) con una sola fetta nel canale DIC. Schema della bolla d'aria (giallo) e il rivestimento epiteliale (bianco) sono rappresentati nel pannello di sinistra. Bar Scala rappresentano 250 e 50 micron, rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: iniezione vescica natatoria consente dissezione spazio-temporale della dinamica patogeni host. (A) Immagini rappresentative della MPO: GFP linea pesce iniettati con vivo o ucciso al calore (HK) CaF2-dTom nella vescica natatoria a 4 dpf e ripreso 48 HPI. Le immagini sono composti di massima proiezione sul verde di unCanali nd rossi (20 fette) e una sola fetta nel canale DIC. Barre di scala rappresentano 100 micron. (B, C). Host risposta a C. infezione albicans. I neutrofili sono reclutati per il sito di infezione (SOI), già nel 6 HPI e continuano ad aumentare in numero superiore a 48 ore. La possibilità di immagine e mantenere singoli pesci separati (24 pozzetti) consente dinamiche immunitarie dettagliate essere visualizzati. (D) la risposta degli agenti patogeni. C. cellule di lievito albicans sono germinando per il primo 24 HPI ma tornano a cellule di lievito da 24 HPI. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: dissezione della vescica natatoria consente per i dettagli più fini per essere ripreso. (A) Rappresentazione schematica di tfa un passo coinvolto nella dissezione della vescica natatoria in 4-5 dpf zebrafish. Le frecce blu indicano la direzione di tirare con le pinzette (L per sinistra e R per Destro). (B, C). Immagini rappresentative della vescica natatoria sezionato da α-catenina: citrino linea pesce 41,42 (giunzioni strette verde) iniettati a 4 dpf con C. albicans (CaF2-dTom) e ripreso da microscopio confocale a 2 HPI. I pannelli sono composti di proiezioni al massimo nei canali rosso e verde (25 fette di B e 3 fette di C) e una sola fetta per il DIC in pannello di B. Barre di scala 100 micron di B e 100 micron e 10 micron di C. Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Volume (nl) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Diametro (mm) | 0,124 | 0,156 | 0,179 | 0,197 | 0,212 |
Tabella 1: bolo volume al rapporto diametro.
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Discussion
Anticipi e limitazioni della microiniezione modello di malattia vescica natatoria
Il modello qui presentato è un'estensione del modello di immersione mucosa candidosi descritto in Gratacap et al (2013).; aggiunge i vantaggi di un tempo un'infezione controllata, una dose un'infezione altamente riproducibile, e quindi una maggiore efficienza. Dimostriamo qui nuovi metodi che permettono non invasivo documentazione temporale delle dinamiche di infezione in modo molto dettagliato e una risoluzione più alta ex vivo imaging della vescica natatoria. Tali procedure dovrebbero facilitare lo studio di C. albicans -innate dinamiche di interazione del sistema immunitario alla mucosa. Un numero limitato di modelli di infezione mucosali sono stati descritti nel zebrafish, tutti limitati a tratto digerente disturbo / infezioni 24,43. Il modello di vescica natatoria qui presentato estende i siti di infezione a un organo che condivide alcune analogie con il polmone e offre un luogo confinatodi infezione, con meno possibilità per il patogeno per essere spazzato via.
Ci sono diversi fattori critici che devono essere presi in considerazione quando si padroneggiare queste tecniche. Il punto più importante è l'esigenza di una vescica natatoria gonfiato. Questo richiede il pesce ad essere affinato per 5 dpf quando allevati a 28 ° C o 4 dpf a 33 ° C. Questa temperatura elevata è usato per accelerare lo sviluppo del pesce e meglio approssimare la gamma di temperature fisiologica epiteliali mammiferi (temperatura cutanea mouse è 33,1 ° C 44). Tuttavia, la limitazione di questo modello a questo particolare campo di temperatura deve essere tenuto presente e fenotipi osservati dovrebbero essere verificati in un sistema di mammiferi per l'interpretazione più completa. Il sito di iniezione (la vescica natatoria posteriore) è anche critico, come il condotto pneumatico rimane aperto nei pesci physostomous (che comprende pesce zebra) e inj alta pressioneezione altrove nell'organo può spingere il patogeno oltre la vescica natatoria e nel tratto digestivo. Quantificazione dell'inoculo è anche meno accurato se le cellule di lievito non tutti sono sul retro della vescica natatoria, in quanto lo spessore del pesce nel bagagliaio rende difficile visualizzare entrambi i lati della vescica natatoria. La dissezione della vescica natatoria richiede destrezza e immagini deve avvenire subito dopo per evitare artefatti dovuti al trauma fisico della procedura.
Le limitazioni della tecnica sono principalmente legati alla fase di sviluppo del pesce. Questo limita l'uso della tecnologia morfolino a pochi giorni di studio, ed efficacia atterramento deve essere attentamente testato per discriminare tra efficacia totale o parziale. Morpholino attività di questo ritardo in sviluppo è stato riportato in precedenza, e abbiamo anche utilizzato con successo Morpholinos in questo modello, con validato giunzione-blocking che era ancora efficace a 5 dpf. L'uso di pharmfarmaci acological potrebbe essere una buona alternativa in questo particolare modello in quanto non vi è alcuna restrizione per l'età del pesce. L'uso di pesce passato 72 ore dopo la fecondazione a volte richiede più svista che lavorare con zebrafish larvale, a seconda delle commissioni cura degli animali e uso istituzionale. La durata dello studio è anche vincolata, come zebrafish non sopravvivono a tassi elevati per più di 10 giorni in condizioni di laboratorio statiche 45. D'altra parte, utilizzando avannotti 5 dpf sviluppo anziché giovani embrioni o larve consente studi in cui tutti gli organi quali i reni, fegato o del pancreas sono pienamente funzionali 46-49. Rispetto alla coltura cellulare in vitro o in modelli murini in vivo, il numero di reagenti disponibili (anticorpi e chimico antagonisti-agonisti) è limitato nel zebrafish; Tuttavia, la possibilità di aggiungere sostanze chimiche direttamente sul supporto è un vantaggio. Il numero di knockout e zebrafish knock-in è ancora limitato, ma il rise di mirati editing genoma apre interessanti possibilità per la generazione di mutanti. La combinazione della relativa facilità di costruire linee reporter fluorescente con la trasparenza del zebrafish giovanile (o di segnalazione specifico percorso specifico tipo cellulare) rimane uno dei vantaggi principali ed uniche di questo sistema.
Guardando avanti
Il modello di infezione vescica natatoria zebrafish amplia la gamma di domande che possono essere chiesto di interazione ospite-patogeno in epitelio della mucosa vertebrato, offrendo una nuova via di infezione per altri patogeni che invadono attraverso l'epitelio e mettendo in evidenza l'utilità di questo organo per sondare malattia vertebrati .
Modelli Zebrafish di infezione epiteliale a livello della mucosa sono stati pubblicati che sondare gli effetti di disturbo intestinale tratto di farmaci o agenti patogeni 24,43. Tuttavia, questo modello candidiasi mucosale è la prima di utilizzare il swimbscaletta e si estende così la gamma di siti di infezione che possono essere studiati nel zebrafish al di là del tratto digestivo. Le differenze tra la superficie della mucosa vescica natatoria e polmoni dei mammiferi non sono completamente chiariti e l'interpretazione / traduzione dei dati da questo modello di maggiore vertebrati dovrebbero essere cautela.
L'infezione vescica natatoria colma una lacuna corrente in modelli di infezione vertebrati e apre una finestra per la visualizzazione delle interazioni delle cellule epiteliali / immunitarie innate con un agente patogeno. Ora una vasta gamma di questioni, precedentemente off-limits, è possibile esplorare. Possiamo determinare le interazioni di diverse cellule immunitarie innate tra loro e con le cellule epiteliali, la loro assunzione spazio-temporale, e la natura di C. albicans proliferazione e switching morfologica in relazione attacco immunitario e la progressione della malattia in un host non immunodepressi. La possibilità di immagine un host intatta per diverse ore o giorni in grein particolare rappresenta un evidente vantaggio e importante di questo sistema.
Infine, le somiglianze di espressione genica e ontologiche tra la vescica natatoria e polmoni dei mammiferi suggeriscono inoltre che il targeting questo organo con atterramento gene o droghe chimiche può rivelare meccanismi conservati di interazione microbica-polmone e immunologia 50-52.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Dr. Le Trinh e Dr. Tobin per generosamente fornire la α-catenina: linea pesce citrino e Bill Jackman per averci permesso di fare le riprese nel suo laboratorio. Gli autori riconoscono le fonti di finanziamento National Institutes of Health (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 e R15AI094406) e USDA (Project # ME0-H-1-00517-13). Questo manoscritto è pubblicato come principale dell'agricoltura e delle foreste Esperimento numero di pubblicazione Stazione 3371.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Deep Petri dishes | Fisher Scientific | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Wooden dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| Low melt agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Flaming Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate capillary | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |
| MPPI-3 injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| 20X microscope objective | Olympus | UPlanSApo 20x/0.75 | |
| Roller drum | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Glass culture tubes (16 x 150 mm) | VWR Scientific | 60825-435 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| HEPES (Corning) | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Children clay (Play-Doh) | Hasbro | ||
| CaCl2 | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Methylene blue | VWR Scientific | VW6276-0 | |
| PTU | Sigma | P7629-10G | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Hemocytometer (Hausser scientific) | VWR Scientific | 15170-172 | |
| Type A immersion oil | Blue Marble Products | 51935 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| Agarose (Lonza) | VWR Scientific | 12001-870 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Fishing wire | Stren | ||
| 96 well imaging plate (Sensoplate) | Greiner Bio-One | 655892 | |
| High vacuum grease (Dow Corning) | VWR Scientific | 59344-055 | |
| Microslide (25 x 75 mm) | VWR Scientific | 48300-025 | |
| Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 | VWR Scientific | 48366-045 | |
| 15 cm Petri dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 32-106 | |
| Glycerol (EMD chemicals) | VWR Scientific | EMGX0185-5 | |
| 24-well culture dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 25-107 | |
| Weight boats (8.9 cm) | VWR Scientific | 89106-766 |
References
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