Abstract
Frühe Verteidigung gegen Krankheitserreger Schleimhaut besteht sowohl eine Epithelbarriere und angeborenen Immunzellen. Die immunocompetency von beiden, und ihre Zwischenverbindung, an erster Stelle stehen für den Schutz vor Infektionen. Die Wechselwirkungen von Epithelzellen und Zellen des angeborenen Immunsystems mit einem Pathogen besten in vivo, wo komplexe Verhalten entfaltet über Zeit und Raum untersucht. Allerdings sind bestehende Modelle nicht für den einfachen Raum-Zeit-Bildgebung der Kampf mit Krankheitserregern an der Schleimhautniveau ermöglichen.
Die hier entwickelten Modell erstellt eine Schleimhaut-Infektion durch direkte Injektion des Pilzpathogen, Candida albicans, in die Schwimmblase der jugendlichen Zebrafisch. Die daraus resultierende Infektion ermöglicht hochauflösende Bildgebung von epithelialen und angeborenen Immunzellverhaltens in der gesamten Entwicklung der Mucosal Disease. Die Vielseitigkeit dieser Methode ermöglicht die Abfrage des Host, um die detaillierte Abfolge der Ereignisse, die zu Immun pH-Sondeagocyte Rekrutierung und die Rollen von bestimmten Zelltypen und molekulare Signalwege in Schutz zu untersuchen. Darüber hinaus kann das Verhalten des Erregers als Funktion der Immunangriff gleichzeitig unter Verwendung fluoreszierende Protein exprimierenden C. abzubildenden albicans. Erhöhte räumliche Auflösung der Wirt-Pathogen-Interaktion ist auch möglich, mit dem beschriebenen schnellen Schwimmblase Dissektionstechnik.
Die hier beschriebene Schleimhaut-Infektionsmodell ist einfach und sehr gut reproduzierbar, so dass es ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der Schleimhautinfektionen. Dieses System kann auch allgemein übersetzbar andere Schleimhautpathogene, wie beispielsweise mykobakteriellen, bakterielle oder virale Keime, die normalerweise durch epitheliale Oberflächen infizieren.
Protocol
HINWEIS: Alle Zebrafisch Pflegeprotokolle und die Experimente wurden in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien unter Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Protokoll A2012-11-03 geführt.
1. Zebrafisch Aufzucht bis 4 Tage nach der Befruchtung
- Sammeln AB Zebrafisch oder andere transgene Linien, innerhalb der ersten 3 Stunden nach der Befruchtung, wie in einem anderen Video 34 gezeigt.
- Inkubieren 120 Eier in eine 15 cm Petrischalen mit 150 ml E3 Medien (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgCl 2, 2 mM HEPES; pH 6,8) mit Methylenblau (0,3 ug / ml final Konzentration) in einem 33 ° C Inkubator mit 12/12 Hell / Dunkel-Photoperiode.
- Ersetzen Sie die Medien nach 6 Stunden mit E3 + PTU (1-Phenyl-2-thioharnstoff, 10 ug / ml Endkonzentration) und entfernen Sie die toten Eiern.
- Inkubieren für 4 Tage bei 33 ° C, die Medien mit frischen E3 + PTU Austausch nach 2 Tagen.
2.Projektions Micro-Nadel Vorbereitung
- Ziehen Borosilikat Kapillare (OD 1,2 mm; 0,69 mm ID) in eine Mikronadel mit einem Nadelzieher mit den folgenden Einstellungen (550 Wärme; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time).
HINWEIS: Die Einstellungen werden vom Filament variieren Filament ähnlich geformte Mikronadeln zu erhalten (siehe Abbildung 1) und muss neu eingestellt werden, wenn ein neues Filament eingebaut ist. - Füllen einer Mikronadel mit 3 & mgr; l von 0,4 & mgr; m-filtriert Phosphatpuffersalzlösung (PBS; 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na 2 HPO 4; 1,8 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) unter Verwendung einer 20 ul-Pipette Microloader Tipp.
- Richten Sie das Mikro-Nadel auf einer Mikropipette Halter auf einem Mikromanipulator mit einem Druckinjektionssystem befestigt. Stellen Sie den Einspritzdruck auf 30 PSI und der Impulsdauer bei 30 ms.
- Mit einer Petrischale mit destilliertem Wasser, senken Sie die Mikronadel, bis 1/5 der Nadel in das Wasser. Clip der Mikronadel with feinen Pinzette gerade unter dem Wasserspiegel. Bringen Sie die Mikronadel aus dem Wasser, und drücken Sie das Pedal mehrmals, bis ein Bolus erscheint.
- Den Durchmesser des Bolus durch Absenken der Mikronadel auf einem Hämocytometer mit einem Tropfen des Typs A Sionsöl geschichtet. Stellen Sie die Impulsdauer, um die gewünschte Lautstärke zu erhalten (siehe Tabelle 1).
- Stellen Sie den Gegendruck für den Bolus in Öl stabil bleiben (senken Sie den Druck, wenn der Bolus-Volumen erhöht und erhöht den Gegendruck, wenn der Bolus-Volumen nimmt ab). Notieren Sie sich die Pulsdauer für jede Mikronadel.
- Entfernen Sie das PBS aus der Mikronadel durch Absaugen es mit Hilfe eines Microloader Pipettenspitze und vertreiben die übrig gebliebenen PBS, indem Sie es wieder auf dem Injektor und spiegeln die kontinuierliche Impulsschalter. Reservieren Sie jede Mikronadel.
3. Candida Vorbereitung
- Streak Candida albicans mit codonoptimierten dTomato, GFP, BFP, EOS oder Far verwandeltRot aus einem gefrorenen Lager (-80 ° C lagerfähig in 25% Glycerin) mit einer sterilen Holzstab auf eine Hefe peptine Dextrose (YPD) Agar-Platte (10 g / l Hefeextrakt, 20 g / l Pepton, 20 g / l Dextrose , 20 g / l Agar, autoklaviert und goss 25 ml in Petrischalen) und Inkubation über Nacht bei 30 ° C.
- Wählen Sie eine Kolonie mit einer sterilen Holzdübel und impfen zu 5 ml YPD-Flüssigkeit (10 g / l Hefeextrakt, 20 g / l Pepton, 20 g / l Dextrose, autoklaviert und aseptisch in 5 ml in 16 x 150 mm Glaskultur aliquotiert Röhren).
- Inkubieren über Nacht bei 30 ° C in einer Rollentrommel bei 60 Upm.
- Sammeln Sie 1 ml C albicans-Kultur und den Transfer in ein 1,7 ml steriles Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren bei 5.000 xg für ein paar Sekunden. Leeren Sie den Überstand und 1 ml sterilem PBS, gründlich vortexen. Wiederholen Sie dies zweimal.
- Zählen Sie die Kolonien mit einer Zählkammer durch Verdünnung der 1 ml Lager 1: 1000 in sterilem PBS.
4. Einspritzen in Zebrafischdie Schwimmblase
- Erwärmen eines Injektionsform (2% Agarose) für 30 min in einem 33 ° C Inkubator.
- Zum gewünschten Zeitpunkt, zu entfernen 100 der 150 ml E3 + PTU von der 15 cm Petrischale die Fische, die zum Einspritzen mit einer 25 ml Pipette ohne Absaugen keine Zebrafisch.
- Anesthetize 4 dpf Zebrafisch durch Zugabe von 2 ml einer 4 mg / ml gepufferte Tricaine Methansulfonat Lager (TR), um die verbleibenden die 50 ml Medium (Endkonzentration 200 ug / ml), und warten Sie 15 Minuten.
- Unter einem Binokular, wählen Sie Fisch mit einem aufgeblasenen Schwimmblase. Fisch kann zu diesem Zeitpunkt auch für homogene Phänotyp gescreent werden, wie beispielsweise neutrophile Verteilung in MPO: GFP-Leitung mit Epifluoreszenz Präpariermikroskop.
- Verdünnen Sie die C albicans Lager aus seiner ursprünglichen Konzentration (Schritt 3.8) in 1,5 x 10 7 koloniebildenden Einheiten pro ml (cfu / ml) in PBS.
- Übertragen Sie 30 Zebrafisch auf die Injektions Gericht mit einem Kunststoffüberführungsrohrtte und entfernen Sie das überschüssige Medien.
- Mit einem Fischerdraht-Werkzeug (in ein Borosilikatglas Kapillaren 0,012 Zoll Durchmesser Angelschnur super geklebt), stellen Sie 3 Zeilen 10 Fische, indem Sie die Injektions Teller vertikal und orientieren die Fische vertikal.
- Entfernen Sie die überzähligen Medien.
- Das Röhrchen gründlich vortexen mit 1,5 × 10 7 cfu / ml C. albicans.
- Füllen einer Mikronadel mit 3 ul C. albicans mit einem neuen Microloader Pipettenspitze und stellen Sie die Pulsdauer auf die entsprechende Einstellung (siehe Schritt 2.9).
- Drehen Sie den Einspritz Gericht, um einen Winkel von 20 ° zwischen der Mikro-Nadel und der Kopf des Fisches zu machen, mit dem Ziel in Richtung der Rückseite des Schwimmblase (3A).
- Drücken Sie den Mikro-Nadel in die Schwimmblase, um sicherzustellen, die Bohrung der Nadel in das Lumen, und drücken Sie das Pedal einmal.
- Wiederholen Sie für jeden Fisch und übertragen zu einer Erholung Schale (25 ml E3 + PTU) durch Fluten der Schale mit einem E3d Entleerung in die stabile Schale.
- Übertragen Sie weitere 30 Fische an der Einspritz Gericht.
- Wiederholen Sie die Injektion mit einer neuen Mikro-Nadel mit gut gefüllten verwirbelt C. albicans.
- Fertig durch Einspritzen der PBS-Kontrolle, wenn nötig, mit einem anderen Gericht Injektion zur Vermeidung von Verunreinigungen und Transfer zu einem separaten Recovery Gericht (Schritt 4.10).
5. Screening der Fisch zum Wunsch Inokulum
- Vorbereitung 40 ml 0,4% niedrigschmelz Agaroselösung (LMA) durch Zusatz von 160 mg des niedrigen Schmelz Agarose zu 40 ml E3, siedet durch Mikrowellenbehandlung bis zur Auflösung und Abkühlen auf 37 ° C. Fügen Sie 400 ul TR (Endkonzentration 200 ug / ml) nach dem Abkühlen.
- Nach 30 Minuten Erholung, betäuben die Fische, wie beschrieben (Schritt 4.3 mit nur 1 ml TR in 25 ml E3 + PTU, Endkonzentration 200 ug / ml).
- Übertragungs 30 Fisch (mit möglichst wenig Medien wie möglich), um 2 ml LMA in einem Gewichts Boot.
- Saugen Sie einzelne Fische mit einer Transferpipette und Platte den Fisch mit 1 Tropfen LMA in einen 96-Loch-Bildplatte, nur mit den 10 x 6 zentralen Brunnen.
- Wiederholen, bis alle Fische zu Bildschirm werden der Bildplatte geladen.
- Lassen Sie das Medium erstarren bei Raumtemperatur für 5 min.
- Positionieren Sie den Fisch auf ihrer Seite, dafür, dass sie in Kontakt mit dem Glasboden gibt.
- Mit dem 20x-Objektiv auf einem umgekehrten Epifluoreszenz / Konfokalmikroskop und der entsprechenden Filter, notieren Sie die Anzahl der C albicans Hefe-Zellen in jeder Fischschwimmblase.
- Wählen Sie den Fisch mit 15-25 Hefezellen in der Schwimmblase (oder gewünschte Inokulum) euthanize nicht ausgewählte Fisch (800 ug / ml TR in E3) und zurück gewählt Fische einer tiefen Petrischale mit 50 ml E3 + PTU durch Zugabe von 3 Tropfen E3 auf die Bildplatte ausgewählt Brunnen und Absaugen der Fisch mit einer Plastiktransferpipette.
- Inkubiere bei 33 ° C für die gewünschte Dauer.
6. Visualisierung der Fisch-Post-Screening
- Zu der gewünschten Zeit, entfernen Sie 25 der 50 ml E3 + PTU Medien aus dem tiefen Petrischale die Fische Bild enthält.
- Betäuben des Fisches wie beschrieben (Schritt 4.3 mit nur 1 ml TR in 25 ml E3 + PTU verbleibenden, Endkonzentration 200 ug / ml).
- Platte der Fische in eine 96-Loch-Speicherfolie und Position entsprechend (Schritte von 5,3 bis 5,7).
- Bild durch Scannen der konfokalen Mikroskopie mit den entsprechenden Laser und Emissionsfilter. Zuerst auf den Fisch im 4x Ziel unter differentiellem Interferenzkontrast (DIC) und Bilder der interessierenden Region unter Verwendung der 20X-Objektiv mit der konfokalen Laser im Scanning-Modus mit 2 & mgr; s / Pixel Geschwindigkeit und 1024 x 600 Pixel-Seitenverhältnis zu erwerben. Erwerben Sie Z-Stapel mit 1 & mgr; m-Schrittweite, die Anwendung Kalman-Filter-Modus von 3 Bildern.
- Die Rückkehr zu einem tiefen Petrischale mit 50 ml E3 + PTU oder in individual Vertiefungen (24-well-Kulturschale, 3 ml E3 + PTU) und Inkubation bei 33 ° C.
7. Grundlagen zur Schwimmblase
- Füllen Sie einen 10-ml-Spritze mit Hochvakuumfett.
- Vorbereiten einer 2% LMA (Schritt 5.3 mit 160 mg des niedrig schmelzender Agarose in 8 ml E3).
- Zu der gewünschten Zeit, betäuben die Fische (Schritt 5.2).
- Übertragungs 10 Fische einer 1,7 ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml E3 und euthanize durch Zugabe von 200 & mgr; l 4 mg / ml Tricaine (Endkonzentration 800 ug / ml) in das Zentrifugenröhrchen und Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie eine Imaging-Objektträger, indem Sie 4 Tropfen Vakuumfett in einem Quadrat, 1 cm voneinander entfernt auf einem Mikroobjekt (75 x 25 mm, Abbildung 2).
- Platzieren Sie 2 Tropfen 2% LMA in der Mitte des Platzes.
- Setzen Sie einen Fisch auf einem separaten Glasobjektträger unter einem Binokular und überprüfen, ob das Herz hat aufgehört zu schlagen, entfernen Sie das überschüssige Wasser.
- Nehmen Sie den Schwimmblase durch den pneumatischen Kanal mit den linken Pinzette und trennt sie vom Verdauungstrakt, und legen Sie sie in der Mitte der 2% LMA, bevor es erstarrt.
- Legen Sie ein Deckglas (18 x 18 mm) an der Oberseite des bildgebenden Glasplatte und schieben Sie es, bis es die Vakuumfett sowie die LMA (Abbildung 2) berührt.
- Bild innerhalb von 10 Minuten der Dissektion, wie in Schritt 6.4 beschrieben. Wiederholen Sie die Schritte 7,7-7,11 mit den anderen Fischen.
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Representative Results
Mikroinjektion in der hinteren Schwimmblase
Die hier präsentierten experimentellen Methode beschreibt die Injektion von einem konsistenten Dosis C. albicans Hefezellen in der Schwimmblase von 4 dpf Zebrafisch. Frühere Arbeiten mit der Immersions Modell schlägt vor, dass der Schwimmblase Immunantwort auf C. albicans ähnelt Säugerschleimhaut Candidiasis 32. Hier zeigen wir eine modifizierte Infektionsmethode, die einfacher, reproduzierbare und schnelle ist; mehrere hundert Zebrafisch kann injiziert und innerhalb von ein paar Stunden zu sehen sein.
Genaue und reproduzierbare Infektion der Schwimmblase ist, indem sie auf den hinteren Bereich des Organs durch Mikroinjektion durchgeführt. Injektion in die Schwimmblase ist einfacher zu lernen als die meisten anderen Mikroinjektion Routen für die Larven oder embryonalen Zebrafisch (zB intravenös oder Hinterhirn Ventrikel). Die Vorbereitung der Fische vor der Injektion Similich wie bei anderen Injektionsstellen, mit der Ausnahme, dass der Schwimmblase muß aufgeblasen werden, damit die Fische älter sind. Etwa 75% der Fische auf 33 ° C erhöht haben einen aufgeblasenen Schwimmblase von 4 dpf (Daten nicht gezeigt). Die Schwimmblase unter der Epidermis sowie dünnen Muskelschicht und die Mikrokanüle zum Injizieren der verwendete Fisch befindet muss abgeschrägt sein. Der Winkel, in dem die Fische injiziert (3A) auch die Geschwindigkeit und die Einfachheit des Verfahrens stark verbessert. Injektion des Bolus an der Rückseite des Schwimmblase ist wichtig, da es ermöglicht die Visualisierung aller Hefezellen beim Screening und vermeidet die Anwesenheit von Hefezellen auf jeder Seite der Schwimmblase, die den Auswahlbereich Abweichungen. Einspritzen in Richtung der Rückseite des Schwimmblase vermeidet auch einen möglichen Verlust des Inokulums über die pneumatische Leitung und dann nach unten im Verdauungstrakt. Überprüfen die Fische eingespritzt worden ist relativ einfach, wie der Bolus verdrängt die Luftblase und derRückseite der Schwimmblase wird anschließend mit Medium (3C) gefüllt. Es ist auch möglich, Phenolrot verwenden bei der Injektion, die machen die Visualisierung einfacher wird. Aufgrund der Größe des C. albicans Hefezellen (3-4 & mgr; m) wird das Inokulum Dosis auf Konzentrationen unter 5 x 10 7 cfu / ml durch Zusetzen des Mikronadel begrenzt. Dies ermöglicht die Injektion von zwischen einem und 250 Hefezellen innerhalb von 5 nl Bolus. In unseren Händen, Spritzen 4 nl bei 1 bis 1,5 x 10 7 cfu / ml gab den konstantesten Ergebnisse. Dies resultierte in einem Bereich von 10-50 Hefezellen pro Fisch. Verengen des Inokulums zu 15-25 Hefezellen (3B) gibt eine engere Phänotyp und Reaktion. Mit diesen Bedingungen etwa 50% der Fisch injiziert die entsprechende Impfstoff Bereich mit mehr als 95% Überlebensrate von 24 Stunden nach der Injektion (Daten nicht gezeigt). Es ist auch möglich, Fische mit einer niedrigeren / höheren Inokulum, um die Wirkung von pathogenen Belastung untersuchen haltenKrankheitsentwicklung.
Die Schwimmblase ungefähr 100 nl Gesamtvolumen (400 x 200 x 200 um, L x H x B mit der Formel für das Volumen eines Ellipsoids) so Injektion höhere Mengen auch möglich (bis zu 3 Impulse von 4 nl wurden ohne signifikante Wirkung auf das Überleben der Fische; Daten nicht gezeigt).
Längsintravital Imaging einzelner Fische, sowohl Wirt und Pathogen Verhalten folgen
Das Verhalten der beiden Wirt und Pathogen kann nicht-invasiv für mehrere Tage mit diesem Modell folgen. Die Fähigkeit, Bild die Entwicklung der Infektion mit einer hohen Auflösung in vivo und wurde genutzt, um die Pathogenese der Schleimhaut Candidiasis zu untersuchen. Neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle im Widerstand gegen Candidiasis bei Mäusen und Menschen 35-38. Verwendung MPO: GFP Zebrabärbling 39 (Neutrophile exprimieren grün fluoreszierendes Protein), und C. albicans Expression des DTOMato rot fluoreszierendes Protein 32 haben wir neutrophil- Candida Dynamik während der frühen Infektion (4) beobachtet.
Neutrophile sind die erste angeborenen Zelltyp an der Stelle der Schleimhautinfektion gewonnen werden, und die Infektion der Schwimmblase mit Live C. albicans führt zu einem schnellen und kontinuierlichen Rekrutierung von Neutrophilen (4A, B). Interessanterweise Neutrophilen keiner wesentlichen der Schwimmblase rekrutiert, wenn Hitze abgetöteten Hefezellen wurden injiziert (4A, B).
Filamente entwickeln sich schnell nach der Injektion von Hefezellen und C. albicans weiterhin für die ersten 48 Stunden nach der Injektion (hpi) keimen. Jedoch nach diesem Punkt die Anzahl der Filamente abnimmt (4D) und der Anteil der Hefe erhöht (nicht gezeigt). Die Fähigkeit, folgen die einzelnen Fische nicht-invasiv können diese Längsschnittstudien (24-Well-PlatteGewebekulturschalen) und zeigt die individuellen Unterschiede in der Krankheitsprogression und Wirtsreaktionen (4C). Solche detaillierten Studien Aufzählen Pilz- und Immunzellen an den Ort der Infektion über mehrere Tage bleiben unpraktisch in der Maus.
Eine schnelle Schwimmblase Dissektionstechnik Bildgebung zu verbessern
Abbildung der Interaktion von Immun- oder Epithelzellen mit C. albicans ist in dem hier vorgestellten Modell relativ einfach. Jedoch unter bestimmten Umständen die Anwesenheit der Luftblase und die Dicke der rund um die Schwimmblase, Haut und Muskeln Gewebe beeinträchtigt detaillierte räumliche Auflösung. Um die Bildqualität zu verbessern, haben wir eine Methode, um die Schwimmblase aus dem Zebrafisch und Bild es schnell (innerhalb von 10 min) durch konfokale Mikroskopie (5A) zu sezieren entwickelt. Dies ist besonders nützlich beim Abbilden Transgenfisch Linien, wobei der Fluoreszenz wird ubiquitär exprimiertund es gibt Fremd Fluoreszenz im umgebenden Gewebe, wie NF & kgr; B: GFP 40 oder α-Catenin: Citrine Leitungen 41,42 (5B, C). Die Technik erfordert Geschicklichkeit und Praxis, schnell durchzuführen, aber es möglich ist, vollständig Bild 95% aller Fische Versuch ist.
Abbildung 1: Micro-Nadelform für Schwimmblase Injektion. (A) Übersicht über die Mikro-Nadelform und Messung. (B) Vergrößerung des Mikronadelspitze von A. Jede größere vertikale Linie in B 0,2 mm.
Abbildung 2: Imaging Rutsche. Eine 2% LMA Abfall wird in der Mitte von 4 Punkten der Vakuumfett, 1 cm Abstand auf einem Glasträger platziert. Die dissected Schwimmblase ist in der Mitte des LMA angeordnet, und ein Deckglas wird oben abgesenkt, bis er in Kontakt mit der LMA und dem Vakuumfett.
Abbildung 3: Injektion von C. albicans in der Schwimmblase lokalisiert bleibt an der Stelle der Injektion. (A) Schematische Darstellung der Orientierung und Position der Mikronadel bis C. albicans in der Rückseite des Schwimmblase in 4 dpf Zebrabärblingembryonen injizieren. (B) Repräsentative Inokulum nach Auswahl Injektions Bolus von 15-25 Hefezellen durch Epifluoreszenzmikroskopie für 3 verschiedene Gruppen von Fischen. Mittelwert und Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt ist, n = 17, 17 und 20 für die Gruppen A, B und C auf. (C) Repräsentative Bilder der C. albicans-Infektion unmittelbar nach inje (CaF2-DTOM, rote Fluoreszenz Candida Ausdruck) in AB Jugendzebrafischction. Die Bilder wurden mit 10X und 20X Ziele erworben (linken und rechten Fenster, beziehungsweise) und Verbundwerkstoffe der maximalen Projektionen im roten Kanal (12 und 19 Scheiben, beziehungsweise) mit einer einzigen Scheibe in der DIC-Kanal. Überblick über die Luftblase (gelb) und der epithelialen Auskleidung (weiß) sind auf der linken Seite dargestellt. Maßstabsbalken repräsentieren 250 und 50 um, auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4: Schwimmblase Einspritzung ermöglicht die räumlich-zeitliche Zerlegung der Wirt-Pathogen-Dynamik. (A) Repräsentative Bilder der mpo: GFP Angelschnur mit Live oder Hitze getötet (HK) Caf2-DTOM in der Schwimmblase bei 4 dpf injiziert und 48 hpi abgebildet. Die Bilder sind Verbundwerkstoffe aus maximaler Vorsprung an der grünen einnd roten Kanälen (20 Scheiben) und eine einzelne Scheibe in der DIC-Kanal. Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m. (B, C). Host-Reaktion auf C. albicans-Infektion. Neutrophile werden an den Ort der Infektion (SOI) bereits nach 6 hpi eingestellt und auf die Erhöhung in der Anzahl mehr als 48 h zu halten. Die Möglichkeit, Bild und halten Sie die einzelnen Fische getrennt (24-Well-Platte) ermöglicht eine detaillierte Immundynamik zu visualisieren. (D) Pathogen Antwort. C. albicans Hefezellen keim für die ersten 24 hpi aber zurück, um Hefezellen aus 24 hpi. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5: Dissektion der Schwimmblase ermöglicht feinere Details abgebildet werden. (A) Schematische Darstellung der ter tritt in Dissektion der Schwimmblase in 4-5 dpf Zebrafisch beteiligt. Blaue Pfeile zeigen die Richtung des Ziehens mit der Pinzette (L für links und R für rechts). (B, C). Repräsentative Bilder seziert Schwimmblase von α-Catenin: Citrin Fisch Linie 41,42 (grün tight junctions) injiziert bei 4 dpf mit C. albicans (CaF2-DTOM) und durch konfokale Mikroskopie 2 hpi abgebildet. Panels sind Verbundwerkstoffe aus maximal Vorsprünge in den roten und grünen Kanäle (25 Scheiben für B und 3 Scheiben für C) und eine einzelne Scheibe für die DIC in Feld B Maßstabsbalken 100 um B und 100 um und 10 um in C Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Volume (nl) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Durchmesser (mm) | 0,124 | 0,156 | 0,179 | 0,197 | 0,212 |
Tabelle 1: Bolusvolumen zu Durchmesser Verhältnis.
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Discussion
Fortschritte und Grenzen der Schwimmblase Mikroinjektion Krankheitsmodell
Das hier vorgestellte Modell ist eine Erweiterung des in Gratacap et al Schleimhaut Candidiasis Tauch Modell (2013). es fügt die Vorteile eines kontrollierten Infektion Zeit eine hoch reproduzierbare Infektionsdosis und damit eine verbesserte Effizienz. Wir zeigen hier neue Methoden, die nicht-invasive zeitliche Dokumentation der Infektionsdynamik im Detail als auch eine höhere Auflösung Ex-vivo-Bildgebung des Schwimmblase zu ermöglichen. Diese Verfahren sollten das Studium zu erleichtern C. albicans -innate Immunsystem Interaktionsdynamik an der Schleimhaut. Eine begrenzte Anzahl von Schleimhautinfektion Modelle im Zebrafisch beschrieben worden, die alle auf Verdauungstrakt Störung / Infektionen 24,43 begrenzt. Die Schwimmblase Modell hier präsentierten sich die Stellen der Infektion zu einem Organ, die einige Ähnlichkeiten mit der Lunge Aktien und bietet eine beschränkte Websiteeiner Infektion, mit weniger Möglichkeit für den Erreger weg gewaschen werden.
Es gibt mehrere wichtige Faktoren, die bei der Bewältigung dieser Techniken, getroffen werden müssen. Der wichtigste Punkt ist die Voraussetzung für einen aufgeblasenen Schwimmblase. Dies erfordert die Fische bis 5 dpf gealtert wenn bei 33 ° C aufgezogen, auf 28 ° C oder 4 dpf werden Diese höhere Temperatur verwendet wird, um die Entwicklung der Fische zu beschleunigen und eine bessere Annäherung an den physiologischen Bereich von Säuger-Epithelzell Temperaturen (Maus Hauttemperatur beträgt 33,1 ° C 44). Die Beschränkung dieses Modells zu diesem bestimmten Temperaturbereich muss jedoch bedacht werden, und beobachteten Phänotypen sollte in einem Säugetiersystem für mehrere vollständige Interpretation verifiziert werden. Die Injektionsstelle (die hintere Schwimmblase) ist ebenfalls kritisch, da die Luftleitung bleibt in physostomous Fisch offen (das Zebrafisch umfasst) und der Hochdruck injReflexion an anderer Stelle im Organ kann den Erreger an der Schwimmblase und in den Verdauungstrakt zu schieben. Quantifizierung des Inokulums ist auch weniger genau, wenn die Hefezellen sind und nicht alle an der Rückseite des Schwimmblase, da die Dicke des Fisches in den Kofferraum macht es schwierig, beide Seiten der Schwimmblase visualisieren. Dissektion der Schwimmblase erfordert Geschicklichkeit und Bildgebung stattfinden muss sofort nach, um Artefakte zu vermeiden, durch die körperliche Traumata des Verfahrens.
Die Grenzen der Technik sind vor allem im Zusammenhang mit dem Entwicklungsstadium der Fische. Dies schränkt die Verwendung von Morpholino-Technologie, um ein paar Tage der Studie und Zuschlags Wirksamkeit muss sorgfältig geprüft, um zwischen Voll- oder Teil Wirksamkeit zu unterscheiden. Morpholino Aktivität dieses spät in der Entwicklung wurde bereits berichtet, und wir haben auch erfolgreich in diesem Modell verwendet Morpholino, mit validierten Spleiß-blockierend, die noch bei 5 dpf wirksam war. Die Verwendung pharmacological Arzneimittel könnte eine gute Alternative in diesem Modell zu sein, da es keine Beschränkung für das Alter der Tiere. Die Verwendung von Fisch vergangenen 72 Stunden nach der Befruchtung erfordert manchmal mehr Kontrolle als mit Larven Zebrafisch, abhängig von den institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschüsse. Die Länge der Studie ist auch eingeschränkt, da Zebrafisch nicht mit hohen Raten für mehr als 10 Tagen in einem statischen Laborbedingungen 45 überleben. Auf der anderen Seite, mit Jungfische von 5 dpf Entwicklung statt jüngere Embryos oder Larven ermöglicht Untersuchungen, bei denen alle Organe wie Niere, Leber oder Pankreas sind voll funktions 46-49. Im Vergleich zu in-vitro-Zellkultur oder in vivo-Mausmodell, die Anzahl der verfügbaren Reagenzien (Antikörper und chemische Antagonisten-Agonisten) im Zebrafisch beschränkt; jedoch ist die Möglichkeit, Chemikalien direkt auf die Medien hinzuzufügen Vorteil. Die Anzahl der K.-o.-und Schlag-Zebrafisch ist noch begrenzt, aber die rise gezielter Genom Bearbeitungs öffnet aufregende Möglichkeiten für die Erzeugung von Mutanten. Die Kombination der relativen Leichtigkeit fluoreszierenden Reporterlinien (zelltypspezifische oder Signalweg spezifisch) mit der Transparenz des juvenilen Zebrafisch vor einer der primären und einzigartigen Vorteile dieses Systems zu konstruieren.
Ich freue mich auf
Der Zebrafisch Schwimmblase Infektionsmodell erweitert das Spektrum der Fragen, die über die Wirt-Pathogen-Interaktion an der Wirbel Schleimhautepithel gebeten werden kann, bietet einen neuen Weg der Infektion für andere Krankheitserreger, die durch das Epithel eindringen und Hervorhebung der Nützlichkeit dieses Organ zur Sondierung Wirbelkrankheit .
Zebrafisch-Modelle von epithelialen Infektion an der Schleimhautniveau veröffentlicht worden, die die Auswirkungen von Darmtrakt Störungen durch Medikamente oder Erreger 24,43 sondieren. Allerdings ist diese Schleimhaut Candidiasis Modell der Erste, der den swimb nutzenLeiter und erstreckt sich somit den Bereich der Infektionsstellen, die in dem Zebrafisch außerhalb des Verdauungstraktes untersucht werden kann. Die Unterschiede zwischen der Schwimmblase Schleimhautoberfläche und dem Säugetier Lunge sind nicht vollständig aufgeklärt und Interpretation / Übersetzung von Daten aus diesem Modell zu höheren Wirbeltieren sollte mit Vorsicht erfolgen.
Die Schwimmblase Infektion füllt eine bestehende Lücke in Wirbeltierinfektionsmodellen und öffnet sich ein Fenster für die Abbildung der Wechselwirkungen der angeborenen Immun / Epithelzellen mit einem Pathogen. Nun wird ein breites Spektrum von Fragen, die zuvor tabu ist möglich, zu erkunden. Wir können die Wechselwirkungen der verschiedenen Zellen des angeborenen Immunsystems untereinander und mit Epithelzellen, die räumlich-zeitliche Einstellung zu bestimmen, und die Art des C. albicans Proliferation und morphologische Umschalten in Bezug auf den Immunangriff und Fortschreiten der Erkrankung in einem nicht-immununter Host. Die Möglichkeit, ein fehlerfreies Host für mehrere Stunden bis Tage in grebei Detail stellt eine offensichtliche und Hauptvorteil dieses Systems.
Schließlich sind die ontologischen und Genexpression Ähnlichkeiten zwischen der Schwimmblase und der Lunge von Säugetieren weiter darauf hin, dass dieses Organ mit Targeting-Gen Knockdown oder chemische Medikamente können konservierte Mechanismen mikrobieller-Lungen-Interaktion und Immunologie 50-52 offenbaren.
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Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Le Trinh und Dr. Tobin für die großzügige Bereitstellung der α-Catenin: Citrin Angelschnur und Bill Jackman für die Erlaubnis, die Dreharbeiten in seinem Labor zu tun. Die Autoren erkennen die Finanzierungsquellen National Institutes of Health (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 und R15AI094406) und USDA (Projekt # ME0-H-1-00517-13). Dieses Manuskript ist als Haupt Land- und Forstwirtschaft Experiment Station Veröffentlichungsnummer 3371 veröffentlicht.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Deep Petri dishes | Fisher Scientific | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Wooden dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| Low melt agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Flaming Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate capillary | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |
| MPPI-3 injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| 20X microscope objective | Olympus | UPlanSApo 20x/0.75 | |
| Roller drum | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Glass culture tubes (16 x 150 mm) | VWR Scientific | 60825-435 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| HEPES (Corning) | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Children clay (Play-Doh) | Hasbro | ||
| CaCl2 | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Methylene blue | VWR Scientific | VW6276-0 | |
| PTU | Sigma | P7629-10G | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Hemocytometer (Hausser scientific) | VWR Scientific | 15170-172 | |
| Type A immersion oil | Blue Marble Products | 51935 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| Agarose (Lonza) | VWR Scientific | 12001-870 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Fishing wire | Stren | ||
| 96 well imaging plate (Sensoplate) | Greiner Bio-One | 655892 | |
| High vacuum grease (Dow Corning) | VWR Scientific | 59344-055 | |
| Microslide (25 x 75 mm) | VWR Scientific | 48300-025 | |
| Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 | VWR Scientific | 48366-045 | |
| 15 cm Petri dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 32-106 | |
| Glycerol (EMD chemicals) | VWR Scientific | EMGX0185-5 | |
| 24-well culture dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 25-107 | |
| Weight boats (8.9 cm) | VWR Scientific | 89106-766 |
References
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