Abstract
La défense précoce contre les agents pathogènes des muqueuses consiste à la fois une barrière épithéliale et les cellules immunitaires innées. Le immunocompétence des deux, et de leur intercommunication, sont primordiaux pour la protection contre les infections. Les interactions de cellules immunitaires innées et épithéliales avec un agent pathogène sont les mieux étudiés in vivo, où le comportement complexe se déroule dans le temps et l'espace. Cependant, les modèles existants ne permettent pas facile imagerie spatio-temporelle de la bataille avec des agents pathogènes au niveau de la muqueuse.
Le modèle développé ici crée une infection de la muqueuse par injection directe de l'agent pathogène fongique, Candida albicans, dans la vessie natatoire du poisson zèbre juvénile. L'infection résultant permet imagerie à haute résolution du comportement des cellules épithéliales et immunitaire innée à travers le développement de la maladie des muqueuses. La polyvalence de cette méthode permet pour interrogatoire de l'hôte à sonder la séquence détaillée des événements immunitaire conduisant à phagocyte recrutement et d'examiner les rôles de types cellulaires particuliers et voies moléculaires dans la protection. De plus, le comportement de l'agent pathogène en fonction de l'attaque immunitaire peut imager simultanément en utilisant la protéine fluorescente exprimant C. albicans. Résolution spatiale accrue de l'interaction hôte-pathogène est également possible en utilisant la technique de dissection vessie natatoire rapide décrite.
Le modèle d'infection de la muqueuse décrite ici est simple et hautement reproductible, ce qui en fait un outil précieux pour l'étude de la candidose buccale. Ce système peut également être largement traduisible à d'autres pathogènes des muqueuses comme les microbes mycobactériennes, bactériennes ou virales qui infectent normalement à travers des surfaces épithéliales.
Protocol
REMARQUE: Tous les protocoles et les expériences de soins de poisson zèbre ont été effectuées conformément aux directives du NIH sous institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) A2012-11-03 protocole.
1. poisson zèbre élevage pour quatre jours après la fécondation
- Recueillir AB poisson zèbre, ou d'autres lignées transgéniques, dans le premier poste de fertilisation 3 heures, comme montré dans un autre 34 vidéo.
- Incuber 120 oeufs dans un 15 cm boîtes de Pétri contenant 150 ml de milieu E3 (mM de NaCl 5; KCl mM 0,17; 0,33 mM de CaCl2; 0,33 mM de MgCl2, 2 mM d'HEPES, pH 6,8) avec du bleu de méthylène (0,3 ug / ml final concentration) dans un incubateur à 33 ° avec la lumière 12/12 / photopériode sombre.
- Remplacez le support après 6 h avec E3 + PTU (1-phényl-2-thiourée, 10 pg / ml de concentration finale) et retirer les oeufs morts.
- Incuber pendant 4 jours à 33 ° C, l'échange avec les médias frais E3 + PTU après deux jours.
2. Dansprojection Micro-aiguille Préparation
- Tirez borosilicate capillaire (OD 1,2 mm; ID 0,69 mm) dans un micro-aiguille à l'aide d'un extracteur de l'aiguille avec les paramètres suivants (550 chaleur; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time).
REMARQUE: Les paramètres varient d'filament filament pour obtenir des micro-aiguilles de forme similaire (voir la figure 1) et devra être réajusté chaque fois qu'un nouveau filament est installé. - Remplir une micro-aiguille avec 3 pi de 0,4 um filtré la solution saline de tampon phosphate (PBS; NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4; pH 7,4) en utilisant un microloader pipette 20 ul pointe.
- Mettre en place la micro-aiguille sur un support de micropipette sur un micromanipulateur relié à un système d'injection sous pression. Régler la pression d'injection à 30 PSI et la durée d'impulsion à 30 ms.
- Utilisation d'une boîte de Pétri avec de l'eau distillée, abaisser la micro-aiguille jusqu'à 1/5 de l'aiguille est dans l'eau. Clip de la micro-aiguille with pinces fines juste en dessous du niveau de l'eau. Apportez la micro-aiguille hors de l'eau et pousser la pédale à plusieurs reprises jusqu'à ce qu'un bolus apparaît.
- Mesurer le diamètre du bol par l'abaissement de la micro-aiguille sur un hémocytomètre en couches avec une goutte de type A de l'huile d'immersion. Réglez la durée d'impulsion pour obtenir le volume souhaité (voir tableau 1).
- Régler la contre-pression pour le bolus de rester stable dans l'huile (abaisser la pression si le bolus augmente le volume et augmenter la contre-pression si le volume de bolus diminue). Enregistrer la durée d'impulsion pour chaque micro-aiguille.
- Retirez le PBS de la micro-aiguille en aspirant à l'aide d'une pipette de microloader et d'expulser les restes de PBS en la replaçant sur l'injecteur et appuyer sur l'interrupteur d'impulsion continue. Réservez chaque micro-aiguille.
3. Préparation Candida
- Streak Candida albicans transformées avec codon optimisé dTomato, GFP, BFP, EOS ou en Extrême-Rouge à partir d'un stock congelé (-80 ° C stock de 25% de glycérol) en utilisant une cheville en bois stérile sur un dextrose levure Peptine (YPD) plaque de gélose (10 g d'extrait / L de levure, 20 g / L peptone, 20 g / L de dextrose , / L agar 20 g; autoclave et versé 25 ml dans des boîtes de Pétri) et incuber une nuit à 30 ° C.
- Choisir une colonie en utilisant une cheville en bois stérile et inoculer à 5 ml de liquide YPD (10 g d'extrait / l de levure, 20 g / L de peptone, 20 g / l de dextrose, autoclavé et aseptique aliquoté dans 5 ml de culture en verre de 16 x 150 mm tubes).
- Incuber pendant une nuit à 30 ° C dans un rouleau tambour à 60 tours par minute.
- Prélever 1 ml de C. culture albicans et le transfert dans un tube à centrifuger stérile de 1,7 ml.
- Centrifuger à 5000 g pendant quelques secondes. Vider le surnageant et ajouter 1 ml de PBS stérile, vortex soigneusement. Répéter deux fois.
- Compter les colonies en utilisant un hémocytomètre en diluant le 1 ml stock 1: 1000 dans du PBS stérile.
4. Injection de poisson zèbre dansla vessie natatoire
- Réchauffer un plat d'injection (2% d'agarose) pendant 30 min dans un incubateur à 33 °.
- Au moment désiré, retirer 100 des 150 ml de l'E3 + PTU du plat 15 cm de Pétri contenant le poisson d'injecter en utilisant une pipette de 25 ml, sans aspirer toute poisson zèbre.
- Anesthésier 4 dpf poisson zèbre en ajoutant 2 ml d'un 4 mg / ml tamponnée tricaïne méthane sulfonate stock (TR) pour les 50 ml restants médias (concentration finale de 200 pg / ml) et attendre 15 min.
- Sous un microscope de dissection, choisir des poissons avec une vessie natatoire gonflée. Le poisson peut également être projeté à ce moment pour phénotype homogène, comme la distribution des neutrophiles dans mpo: ligne GFP en utilisant un microscope à dissection épifluorescence.
- Diluer le C. albicans stock à partir de sa concentration d'origine (étape 3.8) à 1,5 x 10 7 unités formatrices de colonies par ml (cfu / ml) dans du PBS formage.
- Transférer 30 poisson zèbre sur le plat d'injection à l'aide d'un tuyau de transfert en plastiqueTTE et retirez l'excès médias.
- En utilisant un outil de pêche fil (0,012 pouce la ligne de pêche de diamètre super-collés dans un capillaire de borosilicate), faire 3 lignes de 10 poissons, en tenant le plat d'injection verticale et orienter le poisson verticalement.
- Retirer l'excès médias.
- Bien agiter au vortex le tube avec 1,5 x 10 7 ufc / ml C. albicans.
- Remplir une micro-aiguille avec 3 pi de C. albicans en utilisant une nouvelle pointe de pipette microloader et définir la durée d'impulsion sur le réglage approprié (voir l'étape 2.9).
- Tourner le plat d'injection pour faire un angle de 20 ° entre la micro-aiguille et la tête du poisson, visant vers l'arrière de la vessie natatoire (figure 3A).
- Poussez la micro-aiguille dans la vessie natatoire, assurant que le trou de l'aiguille est dans la lumière, et appuyez sur la pédale fois.
- Répétez l'opération pour chaque poisson et de les transférer à un bac de récupération (25 ml E3 + PTU) en inondant le plat avec un E3d vider dans le bac de récupération.
- Transbordement, un autre 30 poissons à l'antenne d'injection.
- Répéter l'injection avec une nouvelle micro-aiguille remplie de fond au vortex C. albicans.
- Finition en injectant le contrôle PBS, si nécessaire, en utilisant une boîte d'injection différent pour éviter la contamination et les transférer à un plat de récupération séparée (étape 4.10).
5. Dépistage du poisson pour inoculum désiré
- Préparer 40 ml de 0,4% bas point de fusion solution d'agarose (LMA) en ajoutant 160 mg d'agarose à bas point de fusion 40 ml de E3, l'ébullition par micro-ondes jusqu'à dissolution et refroidissement à 37 ° C. Ajouter 400 ul de TR (concentration finale 200 ug / ml) une fois refroidi.
- Après 30 min de récupération, anesthésier le poisson comme décrit (étape 4.3 en utilisant seulement 1 ml de TR dans 25 ml E3 + PTU, concentration finale de 200 pg / ml).
- Transfert 30 poissons (avec aussi peu que possible les médias) à 2 ml de LMA dans un bateau de poids.
- Aspirer chaque poisson avec une pipette de transfert et plaque le poisson avec une gouttes de LMA dans une plaque d'imagerie 96 puits, en utilisant seulement les 10 x 6 puits central.
- Répétez jusqu'à ce que tous les poissons à l'écran sont chargés à la plaque d'imagerie.
- Que les médias se solidifient à la température ambiante pendant 5 min.
- Placez le poisson de leur côté, en se assurant qu'ils sont en contact avec le fond de verre.
- En utilisant l'objectif 20X sur une épifluorescence / microscope confocal inversé et le filtre approprié, enregistrer le nombre de C. des cellules de levure dans la vessie natatoire albicans de chaque poisson.
- Sélectionnez le poisson avec de 15 à 25 cellules de levure dans la vessie natatoire (ou inoculum désiré), euthanasier non sélectionnée poissons (800 ug / ml de TR en E3) et revenir poissons sélectionné pour une boîte de Petri profonde avec 50 ml de l'E3 + PTU par ajoutant 3 gouttes de E3 à la plaque de formation d'image sélectionnés puits et en aspirant le poisson avec une pipette de transfert en plastique.
- Incuber à 33 ° C pendant la durée souhaitée.
6. Imagerie du poisson post-dépistage
- Au moment désiré, retirer 25 des 50 ml de milieu E3 + PTU du plat profond Petri contenant le poisson à l'image.
- Anesthésier le poisson comme décrit (étape 4.3 en utilisant seulement 1 ml de TR dans 25 ml E3 + PTU reste, concentration finale de 200 pg / ml).
- Plate le poisson dans une plaque d'imagerie de 96 puits et la position appropriée (étapes 5.3 à 5.7).
- Image par microscopie confocale en utilisant les lasers appropriés et les filtres d'émission. Première accent sur le poisson en utilisant l'objectif 4X vertu contraste interférentiel différentiel (DIC) et acquérir des images de la région d'intérêt en utilisant l'objectif 20X avec les lasers confocale en mode de balayage avec 2 vitesses ps / pixel et 1024 x 600 ratio d'aspect de pixel. Acquérir Z-piles avec une taille de pas um, en appliquant le mode de filtre de Kalman de 3 images.
- Retour à une boîte de Petri profonde avec 50 ml E3 + PTU ou en individual puits (plat de 24 puits de culture, 3 ml E3 + PTU) et incuber à 33 ° C.
7. Dissection de la vessie natatoire
- Remplir une seringue de 10 ml avec de la graisse à vide élevé.
- Préparer un LMA 2% (étape 5.3 avec 160 mg de bas point de fusion agarose dans 8 ml de l'E3).
- À l'heure souhaitée, anesthésier le poisson (étape 5.2).
- 10 Transfert des poissons dans un tube de centrifugeuse de 1,7 ml avec 1 ml de E3 et euthanasie par addition de 200 ul de 4 mg / ml de tricaïne (concentration finale de 800 ug / ml) dans le tube de centrifugation et en incubant pendant 15 min à température ambiante.
- Préparer une lame de verre de formation d'image en plaçant quatre gouttes de graisse à vide dans un carré, 1 cm de distance sur une microlame (75 x 25 mm, figure 2).
- Placez deux gouttes de 2% LMA dans le milieu de la place.
- Placez un poisson sur une lame de verre séparée sous un microscope de dissection et vérifiez que le cœur a cessé de battre, retirez l'excès d'eau.
- Ramassez la vessie natatoire par le conduit pneumatique avec les pincettes gauche, le séparant du tube digestif, et le placer au centre de la LMA 2% avant qu'il se solidifie.
- Placez une lamelle (18 x 18 mm) sur le dessus de la lame de verre d'imagerie et poussez-le jusqu'à ce qu'il touche la graisse à vide ainsi que le LMA (Figure 2).
- Image à l'intérieur 10 min de la dissection comme décrit dans l'étape 6.4. Répétez l'étape 7.7 à 7.11 avec les autres poissons.
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Representative Results
La micro-injection dans la vessie natatoire postérieure
La méthode expérimentale présentée ici décrit l'injection d'une dose constante de C. des cellules de levure albicans dans la vessie natatoire des 4 dpf poisson zèbre. Des travaux antérieurs avec le modèle d'immersion suggère que la réponse immunitaire de la vessie natatoire à C. albicans est similaire à mammifère candidose des muqueuses 32. Ici, nous démontrons une méthode d'infection modifié qui est plus simple, reproductible et rapide; plusieurs centaines de poisson zèbre peuvent être injectés et criblés sein d'un couple d'heures.
Infection précise et reproductible de la vessie natatoire est réalisée en ciblant la région postérieure de l'organe par micro-injection. L'injection dans la vessie natatoire est plus facile à apprendre que la plupart des autres routes de microinjection pour le poisson zèbre larves ou embryonnaires (par exemple, le ventricule intraveineuse ou cerveau postérieur). La préparation du poisson avant l'injection est SimiLAR à celle des autres sites d'injection, à l'exception que la vessie natatoire doit être gonflé de sorte que les poissons sont plus âgés. Environ 75% des poissons élevés à 33 ° C ont une vessie natatoire gonflée par 4 dpf (données non présentées). La vessie natatoire se trouve sous une épidermique ainsi que mince couche musculaire et de la micro-aiguille utilisée pour l'injection du poisson doit être biseauté. L'angle auquel les poissons sont injectés (figure 3A) améliore aussi considérablement la vitesse et la facilité de la procédure. L'injection de bolus à l'arrière de la vessie natatoire est importante car elle permet la visualisation de toutes les cellules de levure lors du dépistage et évite la présence de cellules de levure, de chaque côté de la vessie natatoire, qui biaiser l'intervalle de sélection. L'injection vers l'arrière de la vessie natatoire permet également d'éviter une perte possible de l'inoculum par le conduit pneumatique et ensuite dans le tube digestif. Vérification de poissons qui a été injecté est relativement facile car le bol déplace la bulle d'air et de laarrière de la vessie natatoire est ensuite rempli avec les médias (figure 3C). Il est également possible d'utiliser le rouge de phénol lors de l'injection, ce qui rendra plus facile la visualisation. En raison de la taille de C. albicans cellules de levure (3-4 um) de la dose d'inoculum est limitée à des concentrations inférieures à 5 x 10 7 cfu / ml en raison de l'obstruction de la micro-aiguille. Cela permet à l'injection est comprise entre un et 250 cellules de levure dans un bol 5 nl. Dans nos mains, en injectant quatre nl à 1-1,5 x 10 7 ufc / ml ont donné les résultats les plus cohérents. Il en résulte une gamme de 10 à 50 cellules de levure par les poissons. Réduire l'inoculum à 15-25 cellules de levure (figure 3B) donne un phénotype serré et la réponse. En utilisant ces conditions, environ 50% des poissons ont injecté la gamme d'inoculum approprié avec l'injection de plus de 95% de survie 24 heures de poste (données non présentées). Il est également possible de conserver le poisson avec un inoculum inférieur / supérieur afin d'étudier l'effet de la charge de l'agent surdéveloppement de la maladie.
La vessie natatoire est d'environ 100 nl volume total (400 x 200 x 200 um, L x H x P, en utilisant la formule pour le volume d'un ellipsoïde) afin injection de volumes plus élevés est également possible (jusqu'à trois impulsions de quatre nl ont été utilisé sans aucun effet significatif sur la survie du poisson; données non présentées).
Imagerie intravitale longitudinale d'un poisson à suivre à la fois hôte et le comportement de l'agent pathogène
Le comportement de l'hôte et l'agent pathogène peut être suivie de manière non invasive pendant plusieurs jours en utilisant ce modèle. La capacité de l'image du développement de l'infection à haute résolution in vivo peut et a été utilisé pour examiner la pathogenèse de la candidose des muqueuses. Les neutrophiles jouent un rôle essentiel dans la résistance à la candidose chez les souris et les humains 35-38. Utilisation MPO: poisson zèbre GFP 39 (neutrophiles expriment la protéine fluorescente verte), et C. albicans exprimant le DTOMato protéine fluorescente rouge 32, nous avons observé la dynamique Candida neutrophiles lors de l'infection précoce (Figure 4).
Les neutrophiles sont le premier type cellulaire innée à être recrutés pour le site de l'infection de la muqueuse et l'infection de la vessie natatoire avec Live C. albicans conduit à un recrutement rapide et continue des neutrophiles (figure 4A, B). Fait intéressant, les neutrophiles recrutés ne soient pas substantiellement à la vessie natatoire lorsque des cellules de levure tuées par la chaleur ont été injectés (figure 4A, B).
Les filaments se développent rapidement après l'injection de cellules de levure et C. albicans continue à germer pour la première post-injection de 48 heures (HPI). Toutefois, après ce point, le nombre de filaments diminue (figure 4D) et la proportion de levure augmente (non représenté). La capacité à suivre chaque poisson permet non invasive ces études longitudinales (plaque de 24 puitsdes boîtes de culture de tissus) et met en évidence les différences individuelles dans la progression de la maladie et réponses de l'hôte (Figure 4C). Ces études détaillées énumérant les cellules fongiques et immunitaire au site de l'infection pendant plusieurs jours restent peu pratique chez la souris.
Une technique rapide vessie natatoire de dissection pour améliorer l'imagerie
Imagerie l'interaction des cellules immunitaires ou épithéliales de C. albicans est relativement facile dans le modèle présenté ici. Cependant, dans certaines circonstances, la présence de la bulle d'air et l'épaisseur du tissu entourant la vessie natatoire, de la peau et des muscles, compromet la résolution spatiale détaillée. Pour améliorer la qualité de l'image que nous avons développé une méthode pour disséquer la vessie natatoire sur le poisson zèbre et de l'image qu'il rapidement (en 10 min) par microscopie confocale (figure 5A). Ceci est particulièrement utile lors de l'imagerie de poissons transgéniques lignes où la fluorescence est exprimé de façon ubiquitaireet il n'y a fluorescence parasite dans les tissus environnants, tels que NF-kB: la GFP ou 40 α-caténine: lignes de citrine 41,42 (figure 5B, C). La technique exige de la dextérité et de la pratique pour effectuer rapidement, mais il est possible de l'image complètement 95% de tous les poissons tentative.
Figure 1: la forme de micro-aiguille pour l'injection de vessie natatoire. (A) Vue d'ensemble de la forme micro-aiguille et de mesure. (B) Agrandissement de la pointe de micro-aiguille de A. Chaque ligne verticale majeur dans B sont 0,2 mm.
Figure 2: Imagerie diapositive. Une chute de 2% LMA est placé au milieu de quatre points de la graisse à vide, de 1 cm sur une lame de verre. Le disseDECT vessie natatoire est placé dans le milieu de la LMA et une lamelle est abaissé sur le dessus jusqu'à ce qu'il entre en contact avec le LMA et la graisse à vide.
Figure 3: Injection de C. albicans dans la vessie natatoire reste localisée au site d'injection. (A) Représentation schématique de l'orientation et de la position de la micro-aiguille pour injecter C. albicans dans le dos de la vessie natatoire à 4 dpf larves de poisson zèbre. (B) de l'inoculum représentant, après sélection de bolus d'injection de 15 à 25 cellules de levure par microscopie à épifluorescence pour trois groupes différents de poissons. Moyenne et l'écart type de la moyenne est représentée, n = 17, 17, et 20 pour les groupes A, B, et C respectivement. (C) des images représentatives de C. albicans (CAF2-DTOM, fluorescence rouge exprimant Candida) chez le poisson zèbre AB mineurs immédiatement après injection. Les images ont été acquises avec 10X et 20X objectifs (panneaux gauche et droit, respectivement) et sont des composites de projections maximales dans le canal rouge (12 et 19 tranches, respectivement) avec une seule tranche dans le canal DIC. Aperçu de la bulle d'air (jaune) et la paroi épithéliale (blanc) sont représentés sur le panneau gauche. Barres d'échelle représentent 250 et 50 um, respectivement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: injection vessie natatoire permet pour la dissection spatio-temporelle de la dynamique hôte-pathogène. (A) des images représentatives de mpo: ligne de poissons de la GFP injectées vivants ou tués par la chaleur (HK) CAF2-DTOM dans la vessie natatoire à 4 dpf et imagés 48 HPI. Les images sont composites de projection maximale sur le vertnd canaux rouges (20 tranches) et une seule tranche dans le canal DIC. Barres d'échelle représentent 100 um. (B, C). Hôte réponse à C. infection albicans. Les neutrophiles sont recrutés sur le site de l'infection (SOI) dès 6 HPI et continuent à augmenter en nombre plus de 48 h. La possibilité de l'image et garder les poissons individuelle séparée (plaque de 24 puits) permet pour la dynamique immunitaires détaillés pour être visualisées. (D) la réponse de l'agent pathogène. C. des cellules de levure albicans germent pour les 24 premiers HPI mais reviennent à cellules de levure du 24 HPI. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Dissection de la vessie natatoire permet pour plus de détails plus fins à imager. (A) Représentation schématique de la til étapes impliquées dans la dissection de la vessie natatoire dans 4-5 dpf poisson zèbre. Les flèches bleues indiquent la direction de tirer avec la pince à épiler (L pour gauche et R pour Right). (B, C). Des images représentatives de la vessie natatoire disséqué de α-caténine: citrine ligne de poissons 41,42 (jonctions serrées vertes) injectés à 4 dpf avec C. albicans (CAF2-DTOM) et imagés par microscopie confocale à deux HPI. Panneaux composites sont des projections maximales dans les canaux rouge et vert (25 tranches pour B et trois tranches pour C) et une seule tranche pour le DIC dans le panneau B. Barres d'échelle 100 pm B et 100 um et 10 um en C. Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Volume (nl) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Diamètre (mm) | 0,124 | 0,156 | 0,179 | 0,197 | 0,212 |
Tableau 1: Volume de bolus relation de diamètre.
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Discussion
Les progrès et les limites du modèle de la maladie de la micro-injection de vessie natatoire
Le modèle présenté ici est une extension du modèle d'immersion de la candidose des muqueuses décrit dans Gratacap et al (2013).; il ajoute les avantages d'un temps d'infection contrôlée, une dose d'infection hautement reproductibles, et donc une meilleure efficacité. Nous démontrons ici de nouvelles méthodes qui permettent la documentation temporelle non-invasive de la dynamique de l'infection en détail ainsi que la résolution plus élevée imagerie ex vivo de la vessie natatoire. Ces procédures devraient faciliter l'étude de C. albicans -innate immunitaires dynamiques d'interaction du système au niveau des muqueuses. Un nombre limité de modèles d'infection des muqueuses ont été décrits dans le poisson zèbre, toutes limitées aux voies digestives perturbations / infections 24,43. Le modèle de vessie natatoire présentée ici étend les sites d'infection à un organe qui partage quelques similitudes avec le poumon et offre un site confinéd'infection, avec moins de possibilité pour l'agent pathogène à être emportés.
Il ya plusieurs facteurs critiques qui doivent être prises en compte lors de la maîtrise de ces techniques. Le point le plus important est l'exigence d'une vessie natatoire gonflée. Cela nécessite le poisson à être âgés à 5 dpf lorsqu'ils sont élevés à 28 ° C ou 4 dpf à 33 ° C Cette température élevée est utilisée pour accélérer le développement des poissons et une meilleure approximation de la gamme physiologique de températures épithéliales de mammifères (température de la peau de la souris est de 33,1 ° C 44). Cependant, la restriction de ce modèle à cette plage de température particulière doit être gardé à l'esprit et phénotypes observés doivent être vérifiées dans un système mammifère pour une interprétation plus complète. Le site d'injection (la vessie natatoire postérieure) est également essentielle, car le conduit pneumatique reste ouverte dans les poissons physostome (qui comprend le poisson-zèbre) et inj haute pressionection ailleurs dans l'organe peut pousser l'agent pathogène passé la vessie natatoire et dans le tube digestif. La quantification de l'inoculum est également moins précise si les cellules de levure ne sont pas tous au fond de la vessie natatoire, parce que l'épaisseur du poisson dans le coffre, il est difficile de visualiser les deux côtés de la vessie natatoire. Dissection de la vessie natatoire requiert de la dextérité et de l'imagerie doit avoir lieu immédiatement après afin d'éviter des artefacts à cause du traumatisme physique de la procédure.
Les limites de la technique sont principalement liée à la phase de développement du poisson. Cette limite l'utilisation de la technologie de morpholino à quelques jours de l'étude, et l'efficacité knockdown doit être soigneusement testé pour distinguer entre l'efficacité totale ou partielle. Morpholino activité en cette fin de développement a déjà été signalé, et nous avons également utilisé avec succès morpholinos dans ce modèle, avec épissage blocage validé qui était encore en vigueur à 5 dpf. L'utilisation de pharmacological médicaments pourraient être une bonne alternative dans ce modèle particulier car il n'y a pas de restriction pour l'âge du poisson. L'utilisation de poissons passé 72 heures après la fécondation nécessite parfois plus de surveillance que de travailler avec le poisson zèbre larvaire, selon les comités de protection des animaux et l'utilisation institutionnels. La durée des études est également limitée, comme le poisson zèbre ne survivent pas à des taux élevés de plus de 10 jours dans des conditions statiques de laboratoire 45. D'autre part, en utilisant juvéniles 5 dpf développement au lieu d'embryons plus jeunes ou des larves permet études où tous les organes tels que les reins, le foie ou du pancréas sont entièrement fonctionnel 46-49. Par rapport à la culture de cellules in vitro ou dans des modèles murins in vivo, le nombre de réactifs disponibles (anticorps antagonistes et des agonistes chimiques) est limitée dans le poisson zèbre; Cependant, la possibilité d'ajouter des produits chimiques directement à la presse est un avantage. Le nombre de knock-out et le poisson zèbre knock-in est encore limitée mais le rise de l'édition de génomique ciblée ouvre des possibilités passionnantes pour la génération de mutants. La combinaison de la facilité relative de construire des lignes reporter fluorescentes avec la transparence du poisson-zèbre (juvénile ou spécifiques à la voie de signalisation spécifique de type cellulaire) reste l'un des principaux avantages et unique de ce système.
Avoir hâte de
Le modèle d'infection de la vessie natatoire du poisson zèbre étend la gamme de questions qui peuvent être posées à propos de l'interaction hôte-pathogène à l'épithélium des vertébrés de la muqueuse, offrant une nouvelle voie d'infection pour les autres agents pathogènes qui envahissent à travers l'épithélium et en soulignant l'utilité de cet organe pour sonder la maladie de vertébrés .
Poisson zèbre modèles d'infection épithéliale au niveau de la muqueuse ont été publiés qui sonde les effets des perturbations de tractus intestinal par médicaments ou pathogène 24,43. Toutefois, ce modèle de candidose de la muqueuse est la première à utiliser la swimbéchelle et se étend ainsi la gamme des sites d'infection qui peuvent être étudiés dans le poisson zèbre au-delà du tube digestif. Les différences entre la surface de la muqueuse vessie natatoire et le poumon de mammifère ne sont pas complètement élucidés et l'interprétation / traduction des données de ce modèle vertébré supérieur doivent être faites avec prudence.
L'infection de la vessie natatoire comble une lacune actuelle dans des modèles d'infection vertébrés et ouvre une fenêtre pour imager les interactions des cellules épithéliales / immunitaires innées par un agent pathogène. Maintenant un large éventail de questions, auparavant hors-limites, est réalisable à explorer. On peut déterminer les interactions des cellules immunitaires innées différents entre eux et avec les cellules épithéliales, leur recrutement spatio-temporel, ainsi que la nature de C. albicans prolifération et la commutation morphologique par rapport à l'attaque immunitaire et la progression de la maladie chez un hôte non immunodéprimés. La possibilité de l'image d'un hôte intacte pendant plusieurs heures à quelques jours de greau détail représente un avantage évident et majeur de ce système.
Enfin, les similitudes d'expression ontologiques et de gènes entre la vessie natatoire et le poumon de mammifère suggèrent en outre que le ciblage cet organe avec knockdown de gènes ou de drogues chimiques peut révéler des mécanismes conservés d'interaction microbienne du poumon et de l'immunologie 50-52.
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Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Le Trinh et le Dr Tobin pour fournir généreusement l'α-caténine: ligne de poissons de citrine et Bill Jackman pour nous permettre de faire le tournage dans son laboratoire. Les auteurs reconnaissent les sources de financement Instituts nationaux de la santé (subventions 5P20RR016463, 8P20GM103423 et R15AI094406) et l'USDA (Projet # ME0-H-1-00517-13). Ce manuscrit est publié en tant que principal Agriculture et foresterie Expérience publication station numéro 3371.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Deep Petri dishes | Fisher Scientific | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Wooden dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| Low melt agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Flaming Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate capillary | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |
| MPPI-3 injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| 20X microscope objective | Olympus | UPlanSApo 20x/0.75 | |
| Roller drum | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Glass culture tubes (16 x 150 mm) | VWR Scientific | 60825-435 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| HEPES (Corning) | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Children clay (Play-Doh) | Hasbro | ||
| CaCl2 | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Methylene blue | VWR Scientific | VW6276-0 | |
| PTU | Sigma | P7629-10G | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Hemocytometer (Hausser scientific) | VWR Scientific | 15170-172 | |
| Type A immersion oil | Blue Marble Products | 51935 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| Agarose (Lonza) | VWR Scientific | 12001-870 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Fishing wire | Stren | ||
| 96 well imaging plate (Sensoplate) | Greiner Bio-One | 655892 | |
| High vacuum grease (Dow Corning) | VWR Scientific | 59344-055 | |
| Microslide (25 x 75 mm) | VWR Scientific | 48300-025 | |
| Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 | VWR Scientific | 48366-045 | |
| 15 cm Petri dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 32-106 | |
| Glycerol (EMD chemicals) | VWR Scientific | EMGX0185-5 | |
| 24-well culture dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 25-107 | |
| Weight boats (8.9 cm) | VWR Scientific | 89106-766 |
References
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