Abstract
Defensa temprana contra los agentes patógenos de la mucosa consiste tanto en una barrera epitelial y células inmunes innatas. La inmunocompetencia de ambos, y su intercomunicación, son de suma importancia para la protección contra las infecciones. Las interacciones de las células inmunes innatas epiteliales y con un patógeno están mejor investigados en vivo, donde el comportamiento complejo se desarrolla en el tiempo y el espacio. Sin embargo, los modelos existentes no permiten una fácil imágenes espacio-temporal de la batalla con los patógenos a nivel de la mucosa.
El modelo desarrollado aquí crea una infección de las mucosas por inyección directa del patógeno fúngico, Candida albicans, en la vejiga natatoria del pez cebra juvenil. La infección resultante permite imágenes de alta resolución de comportamiento de la célula epitelial y inmune innata en todo el desarrollo de la enfermedad de la mucosa. La versatilidad de este método permite la interrogación del huésped a la sonda la secuencia detallada de los eventos inmunológicos que conducen a phreclutamiento agocyte y examinar el papel de los tipos particulares de células y vías moleculares en la protección. Además, el comportamiento del patógeno como una función de ataque inmune se pueden obtener imágenes de forma simultánea mediante el uso de la proteína fluorescente que expresan C. albicans. El aumento de la resolución espacial de la interacción huésped-patógeno también es posible usando la técnica de disección vejiga natatoria rápido descrito.
El modelo de infección de la mucosa se describe aquí es sencillo y altamente reproducible, por lo que es una valiosa herramienta para el estudio de la candidiasis mucosa. Este sistema también puede ser ampliamente traducible a otros patógenos de la mucosa tales como microbios micobacterianas, bacterianas o virales que normalmente infectan a través de las superficies epiteliales.
Protocol
NOTA: Todos los protocolos de atención de pez cebra y los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices del NIH bajo Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) A2012-11-03 protocolo.
1. El pez cebra Cría a 4 días después de la fecundación
- Recoger AB pez cebra, o cualquier otro líneas transgénicas, dentro de la primera después de la fertilización 3 hr, como se muestra en otro vídeo 34.
- Incubar 120 huevos en unos 15 cm placas de Petri que contenían 150 ml de medio E3 (NaCl 5 mM KCl; mM 0,17; 0,33 mM CaCl 2; 0,33 mM MgCl 2, 2 mM HEPES, pH 6,8) con azul de metileno (0,3 mg / ml final concentración) en una incubadora a 33 ° con 12/12 de luz / oscuridad fotoperíodo.
- Reemplace los medios de comunicación después de 6 horas con el E3 + PTU (1-fenil-2-tiourea, / ml concentración final de 10 mg) y retirar los huevos muertos.
- Incubar durante 4 días a 33 ° C, el intercambio de los medios de comunicación con frescos E3 + PTU después de 2 días.
2. Enproyección de micro-aguja Preparación
- Tire capilar de borosilicato (OD 1,2 mm; ID 0,69 mm) en un micro-aguja usando un extractor de aguja con los siguientes ajustes (550 Heat; 0 Tire; 130 Velocity; 110 Time).
NOTA: Los ajustes variarán de filamento a filamento para obtener micro-agujas de forma similar (ver Figura 1) y tendrá que ser reajustado cada vez que se instala un nuevo filamento. - Llenar un micro-aguja con 3 l de 0,4 micras filtrada-solución salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; 10 mM Na 2 HPO 4; 1.8 mM KH 2 PO 4; pH 7,4) usando un microloader pipeta 20 l punta.
- Configure la micro-aguja en un soporte micropipeta en un micromanipulador conectada a un sistema de inyección a presión. Ajuste la presión de inyección a 30 PSI y la duración del pulso en 30 ms.
- El uso de una placa de Petri con agua destilada, baje la micro-aguja hasta 1/5 de la aguja está en el agua. Sujete el wi micro-agujath pinzas finas justo por debajo del nivel del agua. Traiga la micro-aguja fuera del agua y empujar el pedal varias veces hasta que aparezca un bolo.
- Medir el diámetro del bolo mediante la reducción de la micro-aguja en un hemocitómetro en capas con una gota de aceite de inmersión tipo A. Ajustar la duración del impulso para obtener el volumen deseado (ver Tabla 1).
- Establecer la contrapresión para el bolo se mantenga estable en aceite (bajar la presión si el bolo aumenta el volumen y aumentar la contrapresión si el volumen del bolo disminuye). Registre la duración del pulso para cada micro-aguja.
- Retire la PBS de la micro-aguja aspirando usando una punta de pipeta microloader y expulsar el sobrante PBS colocándolo de nuevo en el inyector y presionar el interruptor de pulso continuo. Reserve cada micro-aguja.
3. Candida Preparación
- Streak Candida albicans transforman con codones optimizados dTomato, GFP, BFP, EOS o RemotoRojo de una madre congelado (-80 ° C de valores en 25% de glicerol) usando una clavija de madera estéril en un peptine dextrosa de levadura (YPD) placa de agar (10 g de extracto / L de levadura, 20 g / L de peptona, 20 g / l de dextrosa , agar / L 20 g; autoclave y se vierte 25 ml en placas de Petri) y se incuba durante la noche a 30 ° C.
- Elige una colonia usando una clavija de madera estéril e inocular a 5 ml de líquido YPD (10 g de extracto / L de levadura, 20 g / L de peptona, 20 g / l de dextrosa, autoclave y asépticamente alícuotas en 5 ml en cultivo de vidrio de 16 x 150 mm tubos).
- Incubar durante la noche a 30 ° C en un tambor de rodillo a 60 rpm.
- Recoge 1 ml de C. cultura albicans y la transferencia en un tubo de centrífuga estéril 1,7 ml.
- Centrifugar a 5000 xg durante un par de segundos. Vacíe el sobrenadante y añadir 1 ml de PBS estéril, mezclar bien. Repita esto dos veces.
- Contar las colonias utilizando un hemocitómetro diluyendo el 1 ml agotadas 1: 1000 en PBS estéril.
4. La inyección de Pez Cebra enla vejiga natatoria
- Calentar un plato de inyección (2% de agarosa) durante 30 min en una incubadora a 33 °.
- En el momento deseado, retirar 100 de los 150 ml de E3 + PTU desde el plato de 15 cm de Petri que contiene el pescado para inyectar usando una pipeta de 25 ml sin aspiración de cualquier pez cebra.
- Anestesie 4 dpf pez cebra mediante la adición de 2 ml de un / ml tamponada tricaína metano sulfonato de stock 4 mg (TR) a los 50 ml restantes medios (concentración final de 200 mg / ml) y esperar 15 min.
- Bajo un microscopio de disección, seleccionar peces con una vejiga natatoria inflada. Los peces también se puede examinar en ese momento para fenotipo homogéneo, tales como la distribución de los neutrófilos en mpo: línea de GFP usando un microscopio de disección de epifluorescencia.
- Diluir la C. Stock albicans a partir de su concentración original (paso 3.8) a 1,5 x 10 7 unidades formadoras de colonias por ml (UFC / ml) se forman en PBS.
- Transfiera 30 pez cebra en el plato de la inyección con un tubo de transferencia de plásticotte y eliminar el exceso de medios de comunicación.
- Con una herramienta de hilos de pesca (línea de pesca de diámetro 0,012 pulgadas súper pegada en un capilar de borosilicato), haga 3 líneas de 10 peces, sosteniendo el plato de inyección vertical y orientar a los peces verticalmente.
- Retire el exceso de medios de comunicación.
- Agite bien en vórtex el tubo con 1,5 x 10 7 ufc / ml C. albicans.
- Llene una micro-aguja con 3 l de C. albicans utilizando una nueva punta de pipeta microloader y ajustar la duración del pulso en el valor adecuado (véase el paso 2.9).
- Gire el plato de inyección para formar un ángulo de 20 ° entre la micro-aguja y la cabeza del pez, apuntando hacia la parte posterior de la vejiga natatoria (Figura 3A).
- Empuje la micro-aguja en la vejiga natatoria, asegurándose de que el orificio de la aguja está en la luz, y presione el pedal una vez.
- Repita el procedimiento para cada pez y transferir a un plato de recuperación (25 ml E3 + PTU) inundando el plato con un E3d vaciarlo en el plato de recuperación.
- Transferencia otros 30 peces para el plato de la inyección.
- Repetir la inyección con un nuevo micro-aguja llena de fondo vórtex C. albicans.
- Finalizar inyectando el control de PBS, si es necesario, utilizando un plato de inyección diferente para evitar la contaminación y la transferencia a un plato de recuperación independiente (paso 4,10).
5. El cribado del Pescado para inóculo deseado
- Preparar 40 ml de 0,4% bajo punto de fusión solución de agarosa (LMA) mediante la adición de 160 mg de bajo punto de fusión de agarosa a 40 ml de E3, hervir en el microondas hasta que se disuelva, y enfriamiento a 37 ° C. Añadir 400 l de TR (concentración final de 200 mg / ml) una vez enfriado.
- Después de 30 min de recuperación, anestesiar el pescado tal como se describe (paso 4.3 utilizando sólo 1 ml de TR en 25 ml E3 + PTU, concentración final 200 g / ml).
- Transferencia de 30 peces (con tan poco como sea posible los medios de comunicación) a 2 ml de LMA en un barco de peso.
- Aspirar peces individuales con una pipeta de transferencia y la placa a los peces con 1 gotas de LMA en una placa de imagen de 96 pocillos, utilizando sólo los 10 x 6 pozos centrales.
- Repita hasta que todos los peces a la pantalla se cargan a la placa de imagen.
- Deje que los medios de comunicación se solidifican a temperatura ambiente durante 5 min.
- Coloque el pescado en su lado, asegurándose de que estén en contacto con el fondo de cristal.
- Usando el objetivo de 20X en una epifluorescencia / microscopio confocal invertido y el filtro adecuado, registrar el número de C. células de levadura albicans en vejiga natatoria de cada pez.
- Seleccione el pescado con 15-25 células de levadura en la vejiga natatoria (o inóculo se desea), la eutanasia de peces no seleccionado (800 g / ml de TR en E3) y volver peces seleccionado a un plato profundo de Petri con 50 ml de E3 + PTU por la adición de 3 gotas de E3 a los pocillos de placas de imágenes seleccionados y aspirar el pescado con una pipeta de transferencia de plástico.
- Incubar a 33 ° C durante la duración deseada.
6. Imaging the Fish Post-screening
- En el momento deseado, retirar 25 de los 50 ml de medio E3 + PTU de la placa de Petri profunda que contiene el pescado a la imagen.
- Anestesiar el pescado tal como se describe (paso 4.3 utilizando sólo 1 ml de TR en 25 ml E3 + PTU restante, concentración final de 200 mg / ml).
- Placa de los peces en una placa de imagen de 96 pocillos y la posición apropiada (pasos 5.3 a 5.7).
- Imagen de microscopía de barrido confocal utilizando los láseres apropiados y filtros de emisión. En primer lugar se centran en los peces usando el objetivo 4X bajo contraste de interferencia diferencial (DIC) y adquirir imágenes de la región de interés utilizando el objetivo 20X con el láser confocal en el modo de exploración con 2 velocidades microsegundos / pixel y 1024 x 600 píxeles relación de aspecto. Adquirir Z-pilas con 1 m de tamaño de paso, aplicando el modo de filtro Kalman de 3 marcos.
- Regreso a un plato hondo de Petri con 50 ml E3 + PTU o en individual pozos (24 pocillos plato cultura, 3 ml E3 + PTU) y se incuba a 33 ° C.
7. Disección de la vejiga natatoria
- Llene una jeringa de 10 ml con grasa de alto vacío.
- Preparar una LMA 2% (paso 5.3 con 160 mg de bajo punto de fusión de agarosa en 8 ml de E3).
- En el momento deseado, anestesiar el pescado (paso 5.2).
- Transferencia de 10 peces a un tubo de 1,7 ml de centrífuga con 1 ml de E3 y la eutanasia mediante la adición de 200 l de 4 mg / ml tricaína (concentración final de 800 mg / ml) al tubo de centrífuga e incubando durante 15 min a temperatura ambiente.
- Preparar un portaobjetos de vidrio de formación de imágenes mediante la colocación de 4 gotas de grasa de vacío en una plaza, 1 cm de distancia en una MicroSlide (75 x 25 mm, Figura 2).
- Coloque 2 gotas de 2% LMA en el centro de la plaza.
- Coloque un pescado en un portaobjetos de vidrio separada bajo un microscopio de disección y verifique que el corazón ha dejado de latir, eliminar el exceso de agua.
- Recoge la vejiga natatoria por el conducto neumático con las pinzas izquierda, que lo separa del tracto digestivo, y colocarlo en el centro de la LMA 2% antes de que solidifique.
- Colocar un cubre (18 x 18 mm) en la parte superior de la lámina de vidrio de imágenes y empujarlo hasta que toque la grasa de vacío, así como la LMA (Figura 2).
- Imagen dentro de los 10 min de la disección como se describe en el paso 6.4. Repita el paso 07.07 a 07.11 con los otros peces.
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Representative Results
La microinyección en la vejiga natatoria posterior
El método experimental presentado aquí describe la inyección de una dosis constante de C. células de levadura albicans en la vejiga natatoria de 4 dpf pez cebra. El trabajo previo con el modelo de inmersión sugiere que la respuesta inmune a la vejiga natatoria C. albicans es similar a la candidiasis mucosa de mamíferos 32. Aquí se demuestra un método de infección modificado que es más sencillo, reproducible y rápido; varios cientos de pez cebra se pueden inyectar y seleccionados dentro de un par de horas.
Infección exactos y reproducibles de la vejiga natatoria se lleva a cabo por la orientación de la zona posterior del órgano por microinyección. La inyección en la vejiga natatoria es fácil de aprender que la mayoría de las otras rutas de microinyección para el larvas de pez cebra o embrionaria (por ejemplo, en el ventrículo intravenosa o cerebro posterior). La preparación de los peces antes de la inyección es similar a la de otros lugares de inyección, con la excepción de que la vejiga natatoria necesita ser inflado de modo que los peces son mayores. Aproximadamente el 75% de los peces criados a 33 ° C tiene una vejiga natatoria inflada por 4 dpf (datos no mostrados). La vejiga natatoria se encuentra bajo una epidérmica, así como la capa de músculo delgado y la micro-aguja usada para inyectar el pez necesita ser biselado. El ángulo en el que se inyecta el pescado (Figura 3A) también mejora en gran medida la velocidad y la facilidad del procedimiento. La inyección de bolo en la parte posterior de la vejiga natatoria es importante ya que permite la visualización de todas las células de levadura cuando cribado y evita la presencia de células de levadura en cada lado de la vejiga natatoria, que sesgar el rango de selección. La inyección hacia la parte posterior de la vejiga natatoria también evita una posible pérdida del inóculo a través del conducto neumático y luego por el tracto digestivo. Verificación de que el pescado ha sido inyectado es relativamente fácil ya que el bolo desplaza la burbuja de aire y laparte posterior de la vejiga natatoria se llenó posteriormente con los medios de comunicación (Figura 3C). También es posible usar rojo de fenol al inyectar, lo que hará más fácil la visualización. Debido al tamaño de C. células de levadura (albicans 3 - 4 M), la dosis de inóculo se limita a concentraciones por debajo de 5 x 10 7 ufc / ml debido a la obstrucción de la micro-aguja. Esto permite la inyección de entre uno y 250 células de levadura dentro de un bolo de 5 nl. En nuestras manos, la inyección de 4 nl en 1-1,5 x 10 7 ufc / ml dieron los resultados más consistentes. Esto resultó en una gama de 10-50 células de levadura por pez. La reducción de la inóculo a 15-25 células de levadura (Figura 3B) da un fenotipo y la respuesta más fuerte. Utilizando estas condiciones, aproximadamente el 50% de los peces inyectados tienen el rango de inóculo apropiado con la inyección de más del 95% de supervivencia a 24 h después (datos no mostrados). También es posible mantener a los peces con un / superior inóculo inferior con el fin de investigar el efecto de la carga de patógenos endesarrollo de la enfermedad.
La vejiga natatoria es de aproximadamente 100 volumen total nl (400 x 200 x 200 m, L x H x W, utilizando la fórmula para el volumen de un elipsoide) para la inyección de volúmenes superiores también es posible (hasta 3 pulsos de 4 nl han sido utiliza sin ningún efecto significativo sobre la supervivencia de los peces; datos no mostrados).
Intravital de imágenes Longitudinal de ejemplares a seguir tanto el anfitrión como el comportamiento de patógenos
El comportamiento de ambos huésped y patógeno puede ser seguido de forma no invasiva durante varios días utilizando este modelo. La capacidad de imagen el desarrollo de la infección en alta resolución in vivo puede y se ha utilizado para examinar la patogénesis de la candidiasis de la mucosa. Los neutrófilos desempeñan un papel clave en la resistencia a la candidiasis en ratones y seres humanos 35-38. Usando mpo: 39 pez cebra GFP (neutrófilos expresan la proteína fluorescente verde), y C. albicans expresar la dtomato proteína fluorescente de color rojo de 32 años, hemos observado la dinámica Candida neutrophil- durante la infección temprana (Figura 4).
Los neutrófilos son el primer tipo celular innata para ser reclutados para el sitio de infección de la mucosa, y la infección de la vejiga natatoria en vivo con C. albicans conduce a un reclutamiento rápido y continuo de los neutrófilos (Figura 4A, B). Curiosamente, los neutrófilos no son reclutados sustancialmente a la vejiga natatoria cuando las células de levadura muertas por calor fueron inyectados (Figura 4A, B).
Los filamentos se desarrollan rápidamente después de la inyección de células de levadura y C. albicans sigue germinar durante la primera después de la inyección de 48 horas (HPI). Sin embargo, después de este punto, el número de filamentos disminuye (Figura 4D) y la proporción de los aumentos de levadura (no mostrado). La capacidad de seguir cada pez permite no invasiva estos estudios longitudinales (24 y placaplacas de cultivo de tejidos) y destaca las diferencias individuales en la progresión de la enfermedad y las respuestas de acogida (Figura 4C). Tales estudios detallados enumeración de células fúngicas y inmunes en el sitio de la infección durante varios días siguen siendo poco práctico en el ratón.
Una técnica de disección vejiga natatoria rápida para mejorar la formación de imágenes
Imágenes de la interacción de las células inmunes o epiteliales con C. albicans es relativamente fácil en el modelo presentado aquí. Sin embargo, en ciertas circunstancias, la presencia de la burbuja de aire y el espesor del tejido que rodea la vejiga natatoria, la piel y los músculos, compromete la resolución espacial detallada. Para mejorar la calidad de la imagen que hemos desarrollado un método para diseccionar la vejiga natatoria del pez cebra y la imagen que rápidamente (dentro de 10 min) por microscopía confocal (Figura 5A). Esto es particularmente útil cuando se generan imágenes líneas de peces transgénicos en la fluorescencia se expresa de forma ubicuay no hay fluorescencia extraña en el tejido circundante, tales como NF-kappa B: GFP 40 o α-catenina: líneas citrino 41,42 (Figura 5B, C). La técnica requiere destreza y práctica para llevar a cabo rápidamente, pero es completamente factible imagen 95% de todo el pescado tratado.
Figura 1: forma micro-aguja para la inyección vejiga natatoria. (A) Descripción general de la forma de micro-aguja y la medición. (B) Aumento de la punta de micro-aguja de A. Cada línea vertical importante en B son 0,2 mm de diferencia.
Figura 2: Imágenes de diapositivas. Una gota LMA 2% se coloca en el medio de 4 puntos de grasa de vacío, 1 cm de distancia en un portaobjetos de vidrio. El dissected vejiga natatoria se coloca en el medio de la LMA y una hoja de cubierta se baja en la parte superior hasta que hace contacto con la LMA y la grasa de vacío.
Figura 3: La inyección de C. albicans en la vejiga natatoria se mantiene localizado en el sitio de la inyección. (A) Representación esquemática de la orientación y la posición del micro-aguja para inyectar C. albicans en la parte posterior de la vejiga natatoria en 4 dpf larvas de pez cebra. (B) Representante inóculo después de la selección para la inyección en bolo de 15-25 células de levadura por microscopía de epifluorescencia por 3 grupos diferentes de peces. La media y está representado error estándar de la media, n = 17, 17, y 20 para los grupos A, B, y C, respectivamente. (C) Imágenes representativas de C. albicans (CaF2-dtom, fluorescencia roja expresar Candida) infección en AB pez cebra juvenil inmediatamente después injección. Las imágenes fueron adquiridas con 10X y 20X objetivos (paneles izquierdo y derecho, respectivamente) y son compuestos de proyecciones de máxima en el canal rojo (12 y 19 rebanadas, respectivamente), con una sola rebanada en el canal de la CID. Esquema de la burbuja de aire (amarillo) y el revestimiento epitelial (blanco) están representados en el panel izquierdo. Las barras de escala representan 250 y 50 m, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: la inyección de Swimbladder permite la disección espacio-temporal de la dinámica de patógenos de acogida. (A) Imágenes representativas de mpo: línea de peces inyectados con las buenas prácticas agrarias en vivo o muertos por calor (HK) CAF2-dtom en la vejiga natatoria en 4 dpf y la imagen 48 hpi. Las imágenes son materiales compuestos de máxima proyección en el verdecanales nd rojos (20 porciones) y una sola rebanada en el canal DIC. Las barras de escala representan 100 micras. (B, C). Anfitrión respuesta a C. infección albicans. Los neutrófilos son reclutados al sitio de infección (SOI) a las 6 hpi y siguen aumentando en número en 48 horas. La posibilidad de la imagen y mantener peces individuales separados (placa de 24 pocillos) permite una dinámica inmunes detallados para ser visualizados. (D) Respuesta de patógenos. C. células de levadura albicans están germinando por primera 24 hpi pero vuelven a células de levadura de 24 hpi. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La disección de la vejiga natatoria permite detalles más finos para obtener imágenes. (A) Representación esquemática de tque los pasos involucrados en la disección de la vejiga natatoria en 5.4 dpf pez cebra. Las flechas azules indican la dirección de tirar con las pinzas (L para la izquierda y R para la derecha). (B, C). Imágenes representativas de vejiga natatoria diseccionado de α-catenina: línea peces citrino 41,42 (verdes uniones herméticas) inyectados a 4 dpf con C. albicans (CaF2-dtom) y la imagen de microscopía confocal de 2 hpi. Los paneles están compuestos de proyecciones de máxima en los canales rojo y verde (25 rebanadas de B y 3 rebanadas de C) y una sola rebanada de la DIC en el panel B. Las barras de escala 100 micras en B y 100 micras y 10 micras de C. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Volumen (nl) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Diámetro (mm) | 0,124 | 0,156 | 0,179 | 0,197 | 0,212 |
Tabla 1: El volumen del bolo a la relación de diámetro.
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Discussion
Avances y limitaciones del modelo de enfermedad microinyección vejiga natatoria
El modelo que se presenta aquí es una extensión del modelo de inmersión candidiasis mucosa se describe en Gratacap et al (2013).; que añade las ventajas de un tiempo de infección controlada, una dosis infección altamente reproducible, y por lo tanto mejora de la eficiencia. Se demuestra aquí nuevos métodos que permitan la documentación temporal no invasiva de la dinámica de la infección en gran detalle, así como una resolución más alta de formación de imágenes ex vivo de la vejiga natatoria. Estos procedimientos deben facilitar el estudio de C. albicans -innate dinámicas de interacción del sistema inmune en la mucosa. Un número limitado de modelos de infección de la mucosa se han descrito en el pez cebra, todos limita a del tracto digestivo de perturbación / infecciones 24,43. El modelo presentado aquí vejiga natatoria extiende los sitios de infección a un órgano que comparte algunas similitudes con el pulmón y ofrece un sitio confinadode la infección, con menos posibilidad de que el agente patógeno de ser arrastrado.
Hay varios factores críticos que deben ser tenidos en cuenta a la hora de dominar estas técnicas. El punto más importante es la exigencia de una vejiga natatoria inflada. Esto requiere que el pescado para ser envejecido a 5 dpf cuando son criados a 28 ° C o 4 dpf a 33 ° C. Esta temperatura más alta se utiliza para acelerar el desarrollo de los peces y mejor aproximación de la gama fisiológica de temperaturas epiteliales de mamíferos (temperatura de la piel del ratón es 33,1 ° C 44). Sin embargo, la restricción de este modelo para este rango de temperatura particular tiene que ser tenido en cuenta y fenotipos observados deben ser verificados en un sistema de mamífero para la interpretación más completa. El sitio de la inyección (la vejiga natatoria posterior) es también un factor crítico, ya que el conducto neumático permanece abierta en el pescado fisóstomos (que incluye el pez cebra) y inj de alta presiónreflexión en otra parte en el órgano puede empujar el patógeno más allá de la vejiga natatoria y en el tracto digestivo. Cuantificación del inóculo también es menos preciso si las células de levadura no todos se encuentran en la parte posterior de la vejiga natatoria, debido a que el espesor de los peces en el tronco hace que sea difícil visualizar ambos lados de la vejiga natatoria. La disección de la vejiga natatoria requiere destreza y la imagen debe tener lugar inmediatamente después para evitar artefactos debido al trauma físico del procedimiento.
Las limitaciones de la técnica están relacionados principalmente con la etapa de desarrollo de los peces. Esto limita el uso de la tecnología de morfolino a unos pocos días de estudio, y la eficacia de abatimiento tiene que ser cuidadosamente probado para discriminar entre la eficacia total o parcial. Morfolino actividad esta tarde en el desarrollo se ha informado anteriormente, y también hemos utilizado con éxito morfolinos en este modelo, con validado empalme de bloqueo que todavía era eficaz en 5 dpf. El uso de pharmmedicamentos acological podrían ser una buena alternativa en este modelo en particular ya que no hay restricción para la edad de los peces. El uso de los pescados más allá después de la fertilización de 72 horas a veces requiere más supervisión que trabajar con larvas de pez cebra, en función de los comités de cuidado animal y el uso institucional. La duración de los estudios también se ve limitado, como el pez cebra no sobreviven a altas tarifas de más de 10 días en condiciones estáticas de laboratorio 45. Por otro lado, el uso de los juveniles de 5 dpf desarrollo en lugar de embriones más jóvenes o larvas permite estudios en los que todos los órganos como los riñones, el hígado o el páncreas son completamente funcional 46-49. En comparación con el cultivo celular in vitro o en modelos murinos in vivo, el número de reactivos disponibles (anticuerpos y químicos antagonistas-agonistas) se limita en el pez cebra; sin embargo, la posibilidad de añadir los productos químicos directamente a los medios de comunicación es una ventaja. El número de nocaut y pez cebra knock-in es aún limitada pero la rise de la edición genoma dirigida abre interesantes posibilidades para la generación de mutantes. La combinación de la relativa facilidad para construir líneas indicadoras fluorescentes (de tipo específico o de señalización de la vía específica de la célula) con la transparencia del pez cebra menores sigue siendo una de las ventajas primarias y únicas de este sistema.
Viendo hacia adelante
El modelo de infección de vejiga natatoria del pez cebra se extiende la gama de preguntas que pueden ser preguntado por la interacción huésped-patógeno en el epitelio de la mucosa de los vertebrados, que ofrece una nueva vía de infección para otros patógenos que invaden a través del epitelio y poner de relieve la utilidad de este órgano para sondear la enfermedad de los vertebrados .
Modelos de pez cebra de infección epitelial a nivel de la mucosa se han publicado que la sonda los efectos de las perturbaciones tracto intestinal de las drogas o el patógeno 24,43. Sin embargo, este modelo candidiasis de la mucosa es el primero en utilizar el swimbescalera y por lo tanto extiende el rango de sitios de infección que pueden investigarse en el pez cebra más allá del tracto digestivo. Las diferencias entre la superficie de la mucosa vejiga natatoria y el pulmón de mamíferos no están totalmente aclarados y la interpretación / traducción de los datos de este modelo a un mayor vertebrados deben hacerse con cautela.
La infección de vejiga natatoria llena un vacío actual en modelos de infección de vertebrados y se abre una ventana para obtener imágenes de las interacciones de las células epiteliales / inmune innata con un patógeno. Ahora, una amplia gama de preguntas, previamente fuera de límites, es factible explorar. Podemos determinar las interacciones de las diferentes células inmunes innata entre sí y con las células epiteliales, su reclutamiento espacio-temporal, y la naturaleza de C. proliferación albicans y conmutación morfológica en relación con el ataque inmunológico y progresión de la enfermedad en un huésped no inmunodeprimidos. La posibilidad de una imagen anfitrión intacto durante varias horas o días en green detalle representa una ventaja obvia y más importante de este sistema.
Por último, las similitudes de expresión ontológica y genes entre la vejiga natatoria y el pulmón de mamíferos sugieren además que la orientación de este órgano con genes desmontables o drogas químicas puede revelar mecanismos conservadas de interacción microbiana-pulmonar e inmunología 50-52.
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Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. Le Trinh y el Dr. Tobin generosamente para proporcionar la α-catenina: línea de peces citrino y Bill Jackman para permitirnos hacer el rodaje en su laboratorio. Los autores reconocen las fuentes de financiación Institutos Nacionales de la Salud (Becas 5P20RR016463, 8P20GM103423 y R15AI094406) y USDA (Proyecto # ME0-H-1-00517-13). Este manuscrito se publica como principal Agricultura y Silvicultura Experimento Estación publicación número 3371.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Deep Petri dishes | Fisher Scientific | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Wooden dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| Low melt agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Flaming Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate capillary | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |
| MPPI-3 injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| 20X microscope objective | Olympus | UPlanSApo 20x/0.75 | |
| Roller drum | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Glass culture tubes (16 x 150 mm) | VWR Scientific | 60825-435 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| HEPES (Corning) | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Children clay (Play-Doh) | Hasbro | ||
| CaCl2 | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Methylene blue | VWR Scientific | VW6276-0 | |
| PTU | Sigma | P7629-10G | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Hemocytometer (Hausser scientific) | VWR Scientific | 15170-172 | |
| Type A immersion oil | Blue Marble Products | 51935 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| Agarose (Lonza) | VWR Scientific | 12001-870 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Fishing wire | Stren | ||
| 96 well imaging plate (Sensoplate) | Greiner Bio-One | 655892 | |
| High vacuum grease (Dow Corning) | VWR Scientific | 59344-055 | |
| Microslide (25 x 75 mm) | VWR Scientific | 48300-025 | |
| Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 | VWR Scientific | 48366-045 | |
| 15 cm Petri dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 32-106 | |
| Glycerol (EMD chemicals) | VWR Scientific | EMGX0185-5 | |
| 24-well culture dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 25-107 | |
| Weight boats (8.9 cm) | VWR Scientific | 89106-766 |
References
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