Isolering af Primary Murine Brain mikrovaskulære endotelceller

Introduction

Brain mikrovaskulære endotelceller (BMEC) danner monolag, der er en integrerende del af den højt specialiserede blod-hjerne-barrieren (BBB). BMECs er indbyrdes forbundet ved forbindelsesepitoper proteiner bundet til en basalmembran. Sammen med pericytter, glatte muskelceller, astrocytiske ende fødder og cirkulerende blodceller de opbygger den såkaldte neurovascular enhed (NVU) ^1. Mod tidligere forestilling om en uigennemtrængelig barriere mellem blod og centralnervesystemet-systemet (CNS), at NVU er en dynamisk, meget specifikke og regulerede grænseflade, der styrer overgangen af væske, molekyler og celler mellem cerebrale blodkar og CNS ² . En dysfunktion eller dysregulering af NVU kan initiere og / eller bidrage til en række neurovaskulære, infektiøse, inflammatoriske eller degenerative CNS-sygdomme, såsom iskæmisk slagtilfælde, HIV-encefalopati, dissemineret sklerose, Alzheimers eller Parkinsons sygdom ^3-6.

_content "> The BMEC monolayer er tæt forseglet med en junctional kompleks bestående af stram (TJ) og adherensovergange (AJ) ^7. Den høje elektriske modstand og den lave paracellulære permeabilitet af BBB er hovedsageligt baseret på TJ proteiner ^8. TJs er komplekser dannet af de transmembrane proteiner af claudin og occludin familie, som er knyttet til cytoskelettet af endothelcellerne af adaptormolekyler, såsom zonulaoccludens (ZO) proteiner ZO1-3 ^4. adherensovergange primært samlet af integreret membranprotein vaskulær endotel (VE) -cadherin, som er knyttet til cytoskelettet via catenins ^8.

Den tætte forsegling af BBB forhindrer fri udveksling af substrater og celler mellem blod og CSF. Undtagelser fra denne regel er lipofile, små molekyler med en molekylvægt <400 Da, som er i stand til at krydse BBB ved lipidmedieret diffusion ^9. Passagen af ​​større og / ellerhydrofile molekyler, såsom glucose, aminosyrer, peptider, proteiner og mange stoffer er begrænset til stærkt kontrollerede transcellulær transportsystemer ^10, der kan klassificeres i fem hovedkategorier: carrier-medieret transport, ion transport, aktiv udstrømning transport, receptor-medieret transport og caveolae-medieret transport ^4. Disse transportør systemer hjælper opretholde homeostase i CNS, som er nødvendig for en nøjagtig generation signal transduktion og integration. Desuden BMECs er i stand til aktivt at styre overgangen særskilte molekyler af ekspressionen af ​​en række ectoenzymes. Disse enzymer er lokaliseret på celleoverfladen og ændre specifikke endogene og exogene substrater hindre eller tillade overgang BBB ^11.

Hvorimod CNS blev betragtet som en immun-privilegeret organ for en lang tid, de seneste resultater tyder på en temmelig dynamisk og stramt reguleret system af immun Oveillance af CNS. De BMECs er kritisk involveret i reguleringen af ​​immun celle sjælevandring. Ved ekspression af selectiner på deres overflade lymfocytter selektivt induceres til løst fastgøre til endotel. Sekretionen af ​​chemokiner, der støder med specifikke receptorer på leukocytter fører til ekspression eller konforme ændringer i leukocyt-integriner, såsom LFA-1 (lymfocytfunktion-associeret antigen-1) og VLA-4 (meget sent antigen-4). Integrinerne medierer en fast adhæsion ved at binde deres endotelceller counterreceptors, fx VCAM-I (vaskulær celleadhæsionsmolekyle), ICAM-I (intercellulært adhæsionsmolekyle) muliggør transmigration i hjerneparenkymet mellem eller gennem BMECs af BBB ^12-14. Disse og andre resultater bekræfter, at aktiv rolle endotel selv i reguleringen immuncellemigrering.

Desuden BMECs som en del af NVU er involveret i reguleringen af ​​den cerebrale blodgennemstrømning linked lokale neuronale metaboliske krav. Ved astrocytisk stimulation endotelceller producerer vasoaktive stoffer, såsom nitrogenoxid, der fører til afslapning af vaskulære glatte muskelceller ^15.

Angiogenese og neurogenesis i udviklingslandene såvel som i den voksne hjerne show parallel mønster og udvikling og deler mange egenskaber i regel ^{1, 4.} Endotelceller kritisk involveret i disse processer ^{16, 17.}

Sammenfattende BMECs indeholde vigtige funktioner til at berettige en ordentlig udvikling og funktion af CNS. BBB dysfunktion er forbundet med mange alvorlige neurologiske lidelser. Imidlertid har kun meget få mål blevet identificeret på hjernen-kar-interface til en specifik og effektiv behandling ^18. Forenklet in vitro modeller er blevet brugt til at forstå de mekanismer, der er involveret i funktion og regulering af komplekse fysiologiske systemer til en long tid. Den som beskrevet af dette manuskript og in vitro-undersøgelse af murine BMECs, i betragtning af den brede vifte af specifik muse knockout-stammerne isolation, kunne give en yderligere forståelse af BBB funktion og regulering under fysiologiske og patofysiologiske tilstande åbner op for nye terapeutiske muligheder.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af de lokale myndigheder ("LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW, Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz, Recklinghausen, Tyskland") og gennemføres i henhold til den tyske lov om dyrebeskyttelse.

1. Generelle kommentarer til museforsøg

1. Udfør alle forsøg med mus i overensstemmelse med retningslinjerne i de respektive Institutional Animal Care og brug Udvalg.
2. Hold musene under patogenfrie forhold og give dem mulighed for at få adgang til mad og vand ad libitum.
3. Brug alders- og køn-matchede mus i eksperimentelle grupper, fordi biologiske egenskaber kan variere med alder og køn.
4. Når det er muligt forsøge at reducere, raffinere eller erstatte dyreforsøg.

2. Fremstilling af Percoll Gradient

1. Bland 19 ml 1x PBS med 1 ml 10x PBS, 1 ml FCS og 10 ml Percoll.
2. Udfør sterile filtrering i et glasrør (diameter af filterporer: 0,2 um). Derefter opbevares opløsningen ved 4 ° C.

3. Forberedelse af Endothelium Cell Medium og Coating af cellekulturplader

1. Endotelcelle medium:
   1. Fremstilling af 500 ml medium: (. Ca. 20%) Bland 400 ml DMEM medium (. Ca. 80%) med 100 ml PDS, 0,25 ml bFGF (. 20 ug / ml; ca. 0,05%), 0,5 ml heparin (100 pl / ml;. ca. 0,1%) og 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml;. ca. 0,1%). Tilføj pyrumycin kun cellekulturmedium anvendes i de første 2 dage af kultur.
   2. Udføre steril filtrering i et glasrør (diameter af filterporer: 0,2 um). Derefter opbevares opløsningen ved 4 ° C.
2. Coating af cellekulturplader:
   1. Til 1 ml af coatingopløsningen forberede en opløsning af 500 pi Hedeselskabet ₂ O, 400 pi collagen IV (0,4 mg / ml) og 100 pi fibronectin (0,1 mg / ml).
   2. Dækker hele overfladen af ​​EACh brønd celledyrkningspladen med coatingopløsningen. Opbevar pladen ved 4 ° C natten over.

4. Isolering af murint Brain mikrovaskulære endotelceller (MBMEC)

1. Sacrifice 10 voksne mus (8-12 uger er C57BL / 6) ved cervikal dislokation. Bagefter isolere muse-hjerner og butik i 5 ml PBS (Advarsel:! Work steril).
2. Fjern hjerne stilke, cerebella og Thalami med en pincet. Frigør meninges ved forsigtigt rullende hjernerne på et sterilt trækpapir. Saml de resulterende meninges-fri forhjernerne.
3. Overfør hjerne til et 50 ml Falcon-rør fyldt med 13,5 ml DMEM.
4. Hakke vævet, først med en 25 ml pipette, og derefter med en 10 ml pipette, indtil mediet bliver mælkeagtig.
5. Derefter fordøje vævet med en blanding af 0,6 ml collagenase CLS2 (10 mg / ml i DMEM) og 0,2 ml DNAse (1 mg / ml i PBS) i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) i 1 time ved 37 ° C på en orbital ryster ved 180 rpm.
6. Der tilsættes 10 ml DMEM tilsat til vævssuspension og centrifugeres cellerne ved 1.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
7. Kassér supernatant (Advarsel:! PELLET let at miste)
8. At fjerne myelin, resuspender pellet med en 25 ml pipette i 25 ml BSA-DMEM (20% w / v) (ca. 25 gange), og der centrifugeres ved 1.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
9. Kassér den øvre myelin lag (mælket) med et glasskår Pasteur pipette med større diameter, og derefter kassere BSA lag med en normal Pasteur pipette.
10. Pellet resuspenderes i 9 ml DMEM og der tilsættes 1 ml collagenase / dispase (slutkoncentration 1 mg / ml) og 0,1 ml DNAse. Fordøje løsning i 1 time ved 37 ° C på en orbitalryster ved 180 rpm (advarsel: ikke bruger pipette til resuspender - celler kan gå tabt).
11. Under fordøjelsen, centrifugeres Percoll løsning at oprette densitetsgradient ved anvendelse af en ultracentrifuge ved 3.000 xg i 1 time ved 4 ° C, med acceleration, without bremse.
12. Der tilsættes 10 ml DMEM til de fordøjede celle suspension. Centrifuger suspensionen ved 1.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Så kassér supernatanten, og pellet resuspenderes i 2 ml DMEM.
13. Tilsæt de resuspenderede celler forsigtigt på toppen af ​​Percoll gradient og centrifugeres ved 700 xg i 10 minutter ved 4 ° C uden acceleration og bremse. Bemærk: Cellerne er synlige som en sky i interfasen.
14. Tage ca.. 12 ml interfasen med celler med en lang steril kanyle og sæt den i en ny 50 ml Falcon med 5 ml DMEM.
15. Centrifugeres cellerne igen ved 1.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Bagefter pellet resuspenderes i endotelcelle medium (brug ca. 0,2 ml medium per 1 ^cm2 overflade af cellekultur plade).
16. Fjern coatingopløsning fra overtrukne cellekulturplader (se trin 3.2) og skylles hver brønd med sterilt PBS i to på hinanden følgende vasketrin.
17. Opretholde cellekulturer i endotelcelle medium ved 37 ° C og 5% _CO2 i en steril inkubator. Skift medium hver to til tre dage. Split celler ved 90% sammenflydning.

Representative Results

Umiddelbart efter isolering, murine BMECs og kontaminerende celler danner konglomerater flydende i celledyrkningsmediet (figur 1A, dag 0). Behandlingen med pyrumycin fører til et udvalg af murine BMECs eftersom de udtrykker høje niveauer af effluxtransportører såsom P-glycoprotein, der fører til en relativ resistens mod giftstoffer. Kontaminerende celler er meget mere modtagelige for pyrumycin cytotoksicitet ^19. Under processen med pyrumicin udvælgelse, kontaminerende celler ind apoptotiske eller nekrotisk celledød, mens MBMECs begynder at knytte til de kollagen IV / fibronectincoatede belagt cellekulturplader (figur 1A, dag 1 og dag 2). Indtil dag 5 kan MBMECs formere sig til en densitet på ca.. 80-90%. De er kendetegnet ved den typiske spindel-formet udseende. Ved konfluens, danner et monolag af tætpakkede, i længderetningen på linie og ikke-overlappende kontakt-inhiberede celler (figur 1A, dag 5). Vedpyrumicin udvælgelse, en høj renhed på op til 99% MBMEC nås som det fremgår af endotelcelle markør CD31 (PECAM1, figur 1B). De MBMECs danner Tætsluttende monolag indbyrdes forbundet af tight junction proteiner. Efter 7-8 dages dyrkning endotelcellen lag opbygge stabile værdier for elektrisk modstand (nå typiske værdier mellem 20 - 30 Ω x cm _^2). Og kapacitans (Figur 1C) På dette tidspunkt-punkt funktionelle assays, såsom celle- migrationseksperimenter ^{3, 20,21} og permeabilitet tests, for eksempel med Evans blå eller dextran, bør udføres.

Figur 1. Morfologiske og funktionelle egenskaber af murine BMECs. (A) Repræsentant tidsforløb af dyrkede BMECs set ved transmission lys mikromikroskopi over 5 dage. Scale bar gælder for alle billeder. (B) Immunfluorescensfarvning til endotelcelle markør CD31 på dag 5. CD31 (grøn) og DAPI (blå). (C) Celler blev fordyrket i 5 dage og derefter overført til et automatiseret system til analyse af biofysiske egenskaber (modstand og kapacitans). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

Blod-hjerne-barrieren dysfunktion er kendetegnende for forskellige skadelige CNS-sygdomme, fx en opdeling af BBB i multipel sklerose i udstrakt grad letter CNS invasion af autoreaktive immunceller og muliggør mødet og destruktion af oligodendrocytter. Iskæmisk slagtilfælde afbrydelse af BBB og den efterfølgende dannelse af hjerneødem er kritiske faktorer, der påvirker sekundær infarkt vækst og den samlede overlevelse af patienterne ^6. Endvidere ved ændringer af BBB i fjerntliggende områder fokale iskæmiske læsioner er i stand til at fremkalde omfattende funktionelle ændringer i hjernen. Men de underliggende molekylære mekanismer er stort set ukendte ^5. I modsætning hertil høj tæthed og mangfoldighed af effluxtransportører i funktionelle BMECs nedsætter koncentrationen af ​​gavnlige stoffer som kemoterapeutika for hjerne maligniteter eller antibiotika til infektionssygdomme. Derfor en dybere forståelse af blod-hjerne-barRier funktion under fysiologiske og patofysiologiske tilstande er nødvendig for at udvikle farmakologiske midler, der er i stand til specifikt at regulere barriere funktion i den foretrukne retning ^21. Pålidelig in vitro modeller af BBB er uundværlige værktøjer til at studere reguleringsmekanismer på BBB.

Mange udødeliggjort hjerne endotel cellelinjer er blevet etableret og ansat som in vitro BBB-modeller ^22. Disse cellelinier giver visse fordele i forhold til de primære BMECs som de vokser hurtigere og holde visse BBB egenskaber over flere passager. Dog kan endoteliale cellelinjer ikke fuldt ud erstatte primære celler som vigtige egenskaber er ændret, der blander sig med overførsel af eksperimentelle resultater til den in vivo situation. For eksempel murine hjerne endotelcellelinje bEnd.5 kun udtrykker lave niveauer af diskontinuerligt fordelt tight junction proteiner fører til høj Paracellular permeabilitet ^23. BEnd.3, en anden hyppigt anvendt murine hjerne endotelcellelinje, viser tætte og kontinuerlige distribuerede tight junctions, en høj transendotheliale modstand, flere effluxtransportører og lav paracellulær permeabilitet. Men bEND.3 cellelag i forhold til primære BMECs mangler en reel diskrimination med hensyn til gennemtrængning af visse transcellulær og paracellulære substrater ^24.

I præparater af primære cellekulturer, kan kontaminerende celler væsentligt forstyrre gyldigheden af ​​eksperimentelle resultater. I den beskrevne protokol, er pyrumicin anvendes som et selektivt middel til endothelceller for at opnå høj renhed. Ikke desto mindre er uundgåeligt behov for en regelmæssig kvalitetskontrol af cellekulturen for at sikre pålidelige forsøg. Der er flere metoder til kvalitetskontrol, foruden typiske morfologiske egenskaber af endotelceller (se figur 1A), den transendotheliakan måles l resistens eller ekspressionen af endotelcelle markør, såsom CD31 (se figur 1B) eller von Willebrand faktor (vWF) kan evalueres.

Antallet af hjernens endotelceller isoleret fra musehjerne er forholdsvis lav, og at etablere en ordentlig cellekultur for flere forsøg, hjernerne fra flere mus skal samles. Det er vores erfaring, mindst 10 mus skal benyttes til et eksperiment, som kan være en begrænsende faktor afhængigt af ressourcer respektive dyr facilitet. For at undgå afvigelser og confoundere, bør kun mus med et identisk genetisk og miljømæssig baggrund samles. I modsætning hertil kvæg og svin hjerne endotelcelle præparater levere et stort antal af hjernens endotelceller tilgængelige i en hjerne. Men ud over den ukomplicerede avl og boliger, den brede og stadigt voksende repertoire af tilgængelige transgene mus gør primære murine BMECs som et idealmodel til at studere blod-hjerne-barriere-funktion.

Flere vigtige konklusioner vedrørende funktioner BBB og de underliggende molekylære mekanismer er kommet fra undersøgelser i 2D vævskultursystemer. For nylig har 3D dyrkningssystemer blevet udviklet ^25, hvor endotelceller er placeret i en collagenmatrix muligt for dem at danne hulrum og rørformede net. Disse nye celledyrkningssystemer giver mulighed for en endnu mere nøjagtig gengivelse af vaskulære processer i den intakte organisme in vivo. Inddragelsen af yderligere celler af NVU i 3D cellekultur systemer, såsom pericytter og astrocytter kan revolutionere in vitro undersøgelse af blod-hjerne-barriere-funktion; første modeller er for nylig blevet udviklet ^26.

Der er nogle anbefalinger til fejlfinding. Først og fremmest sterile bearbejdning er afgørende for kvaliteten af ​​endothelial cellekultur. For det andet bør pyrumycin kun tilsættes for celledyrkningsmedium anvendt i de første 2 dage af kultur, kan længere anvendelse føre til øget MBMEC celledød og lav kvalitet barriere funktion. For det tredje bør de enzymer, der anvendes i denne protokol skal anvendes og opbevares i henhold til producentens anvisninger; ellers deres rette funktion kan blive kompromitteret. Desuden kan belægningen af ​​cellekulturplader ændres, hvis endotelceller ikke vedhæfte. Koncentrationer af fibronectin og collagen kan ændres eller andre matrixproteiner kan tilføjes til coatingopløsningen. Endelig, alder, køn, sæson betingelser året og miljømæssige inden dyreanlægget er vigtige faktorer, der kan påvirke kvaliteten af ​​MBMEC isolation og sammenligneligheden af ​​eksperimenter. Det bør sikres, at vilkårene er sammenlignelige mellem uafhængige forsøg.

Den beskrevne protokol bør betragtes som en grundlæggende neuroimmunologiske fremgangsmåde til isolering af murine BMECs. De isolerede celler kan være used for en bred vifte af applikationer til at opnå yderligere indsigt i BBB funktion, såsom migration assays, gen- og proteinekspressionssystemer undersøgelser, elektrofysiologiske evalueringer eller permeabilitet eksperimenter. Som nævnt ovenfor, kan 3D-cellekultur systemer BMECs give nye muligheder for at studere de komplekse mekanismer, der er involveret i reguleringen af ​​BBB i forbindelse med NVU. Derfor vil isolering af primære endotelceller forblive en uvurderlig teknik inden for BBB forskning i fremtiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A9418	Bovine serum albumin
Collagenase CLS2	Worthington	LS004176	High relative level of protease activity
Collagenase-dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV	Sigma Aldrich	C0543	From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM	Sigma Aldrich	D5030	Warm in 37 °C water bath before use
DNAse	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin	Sigma Aldrich	H3393	Anticoagulant
PDS	First Link UK Ltd.	60-00-850	Plasma-derived serum
Percoll	Sigma Aldrich	P1644	Warm to room temperature before use
Pyrumycin	Sigma Aldrich	P8833	Should only be used in first 2 days of culture