Introduction
고도로 전문화 된 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)의 일부입니다 뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMEC) 형태의 단일 층. BMECs은 기저막에 부착 접합부 단백질에 의해 서로 연결되어있다. 함께 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 성상 교세포 단부 피트와 순환 혈구 그들은 소위 신경 혈관 부 (NVU)를 하나 구축. 혈액과 중앙 신경계 (CNS) 간의 불 투과성 장벽의 이전의 개념에 대하여, NVU은 뇌 혈관 및 CNS (2) 사이의 유체 분자와 세포의 전이를 제어하는 동적 고도로 특이적이고 규제 인터페이스 . NVU의 장애 또는 이상 조절이 개시 및 / 또는 허혈성 뇌졸중, HIV-뇌증, 다발성 경화증, 알츠하이머 병 또는 파킨슨 병과 같은 3-6 CNS의 신경 혈관, 감염성 염증성 또는 퇴행성 질환의 종류에 기여할 수있다.
_content "> BMEC 단층 단단히 꽉 (TJ)로 구성 접합부 복잡한에 의해 밀봉되어 (AJ) 7. 높은 전기 저항과 BBB의 낮은 세포층의 투과성은 주로 TJ 단백질을 기반으로 접합 8. TJS은 adherens 이러한 zonulaoccludens (ZO) 단백질과 같은 어댑터 분자에 의해 내피 세포의 세포 골격에 연결되어 클라우딘 및 occludin 가족 경막 단백질에 의해 형성된 복합체 ZO1-3 4 Adherens 접합은 주로 막 관통 단백질에 의해 조립된다. catenins (8)를 통해 세포 골격에 연결되어 혈관 내피 세포 (VE) -cadherin.BBB의 기밀 유지는 혈액과 뇌척수액 사이의 기판과 세포의 무료 교환을 방지 할 수 있습니다. 이 규칙에 예외가 지질 매개 확산 9 BBB를 통과 할 수있는 분자량 <400 다와 친 유성, 작은 분자이다. 통로의 더 큰 및 / 또는글루코스, 아미노산, 펩티드, 단백질 및 많은 약물 친수성 분자는 다섯 가지 주요 범주로 분류 될 수 고도로 제어 된 세포 횡단 운송 시스템 (10)으로 제한된다 : 캐리어 매개 수송, 이온 수송 활성 유출 수송 수용체 매개 전송 및 카베 올래 매개 교통편 4. 이러한 수송 시스템은 정확한 신호 생성, 전달 및 통합에 필요한 CNS의 항상성을 유지하는 데 도움. 더욱이 BMECs 적극적 ectoenzymes의 다양한 표현에 의해 구별 분자의 전환을 제어 할 수있다. 이러한 효소 저해 또는 BBB (11)의 전환을 가능하게 특정 내인성 및 외인성 기질 세포 표면 상에 집중하고 수정할 수있다.
CNS는 오랜 시간 동안 면역 권한 기관으로 간주 된 반면, 최근의 연구 결과는 면역 surv의 다소 역동적이고 엄격하게 규제 시스템을 제안CNS의 eillance. BMECs 비판적으로 면역 세포 윤회의 조절에 관여한다. 그들의 표면 림프구에 셀렉틴의 발현에 의해 선택적으로 느슨하게 내피 세포에 부착하도록 유도한다. 백혈구의 특정 수용체 발생할 케모카인의 분비 발현 또는 LFA-1과 백혈구 인테그린의 구조 변화, 리드 (림프구 기능 관련 항원 1) 및 VLA-4 (매우 늦은 항원 -4). 인테그린 사이 또는 BBB 12-14 BMECs 통해 뇌 실질 내로 이주 있도록 그들의 내피 counterreceptors, 예를 들면 VCAM-I (혈관 세포 부착 분자), ICAM-I (간 부착 분자)를 결합함으로써 밀착성을 매개한다. 이들 및 다른 연구 결과는 면역 세포의 이동을 조절하는 내피 세포 자체의 적극적인 역할을 강조한다.
또한, BMECs NVU의 일부 뇌 혈류 리튬의 조절에 관여 된 바와지역 신경 세포의 신진 대사 요구에 nked. 성상 세포 자극시 내피 세포는 혈관 평활근 세포 (15)의 이완에 산화 질소로 혈관 활성 물질을 생산한다.
현상뿐만 아니라 성인 뇌 쇼 평행 패터닝 및 개발 및 규제 1,4 많은 속성을 공유하는 신생 혈관 형성 및 신경. 내피 세포는 비판적으로 이러한 프로세스 (16), (17)에 참여하고 있습니다.
요약하면, BMECs는 CNS의 적절한 개발과 기능을 보장하기 위해 필수적인 기능을 제공합니다. BBB 장애는 많은 심각한 신경 학적 장애에 연결되어 있습니다. 그러나, 매우 소수의 대상은 특정하고 효율적인 치료 18 뇌 혈관계 계면에서 확인되었다. 시험 관내 모델에서 간소화가 싸다 대한 함수 복잡한 생리 학적 시스템의 조절에 관여하는 메커니즘을 이해하는 데 사용되어왔다NG 시간. 이 원고와 쥐의 BMECs의 체외 연구에 의해 설명 된 특정 마우스 녹아웃-균주의 다양한 주어진 격리, 새로운 치료 길을 열어 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건에서 BBB 기능 및 규제의 또 다른 이해를 제공 할 수 있습니다.
Protocol
동물 보호의 독일 법에 따라 실시하고 모든 동물 실험은 지방 자치 단체 ( "Recklinghausen에서, 독일; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz LandesamtfürNatur, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz 노르 트라 인 베스트 팔렌")에 의해 승인되었다.
마우스 실험 1. 일반 댓글
- 각각의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 마우스를 사용하여 모든 실험을 수행합니다.
- 무균 조건 하에서 쥐를 보관하고 음식과 물을 임의로에 액세스 할 수 있도록.
- 생물학적 특성은 나이와 성별에 따라 달라질 수 있기 때문에 실험 그룹의 나이와 성별에 일치하는 마우스를 사용합니다.
- 가능한 한 것은, 감소 수정 또는 동물 실험을 대체하려고합니다.
퍼콜 그라데이션 2. 준비
- 1 ml의 10 배 PBS, 1 ML의 FCS 및 10 ml의 퍼콜와 1X PBS 19 ml의 혼합.
- 인트를 수행유리관에 여과 (0.2 ㎛의 필터 기공의 직경)을 화나게. 그 후 4 ℃에서 솔루션을 저장합니다.
내피 세포 중간 및 세포 배양 플레이트의 코팅 3. 준비
- 내피 세포 매체 :
- 500㎖의 매질의 제조 : (. 약 20 %) 100 ㎖의 PDS 400 ml의 DMEM 배지 (. 약 80 %)을 섞어, 0.25 ml의 bFGF를 (. 20 ㎍ / ml의 약 0.05 %), 0.5 ml의 헤파린 (100 μL / ㎖;. 약 0.1 %) 및 0.5 ml의 pyrumycin (4 ㎎ / ㎖]. 약 0.1 %). 단지 문화의 제 2 일 내에 사용되는 세포 배양 배지 용 pyrumycin 추가.
- 유리관 내의 멸균 여과 (0.2 ㎛의 필터 기공의 직경)을 수행. 그 후 4 ℃에서 솔루션을 저장합니다.
- 세포 배양 플레이트의 코팅 :
- 도포 액 1ml를 들어, 500 μL의 DDH 2 O, 400 μl의 콜라겐 IV (0.4 ㎎ / ㎖) 100 ㎕를 피브로넥틴 (0.1 ㎎ / ㎖)의 용액을 제조 하였다.
- EAC의 전면을 덮코팅 용액으로 세포 배양 플레이트의 웰 시간. 4 ° C에서 하룻밤 접시를 저장합니다.
설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 4. 분리 (MBMEC)
- 경추 탈구로 - (12 주 이전, C57BL / 6 ~ 8) (10) 성인 쥐를 희생. 그 후 PBS 5ml에 마우스 두뇌와 저장소를 분리 (경고 :! 작업 멸균).
- 집게와 뇌 줄기, 소뇌 및 시상을 제거합니다. 신중하게 멸균 블로 팅 용지에 머리를 굴려 수막를 분리합니다. 결과 수막없는 forebrains를 수집합니다.
- DMEM의 13.5 ml로 채워진 50 ml의 팔콘 튜브에 머리를 전송합니다.
- 미디어 유백색이 될 때까지 10 ㎖를 피펫 후, 제 25 ㎖를 피펫으로, 조직을 말하다.
- 이어서 궤도에 37 ° C에서 1 시간 동안 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 0.6 ㎖의 콜라게나 CLS2 (10 ㎎ / DMEM에서 ml) 및 0.2 ml의 DNase를 (PBS에 1 ㎎ / ㎖)의 혼합물로 조직 다이제스트 악수180 rpm에서 R.
- DMEM의 추가 10ml를 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에서 조직 서스펜션과 원심 분리기에 셀을 추가했다.
- 폐기 상층 액 (경고 :! 펠릿 잃을 쉽게)
- 4 ℃에서 20 분 동안 1,000 XG에 (약. 25 배) (20 V / w %), 및 원심 분리기, 미엘린을 제거 BSA-DMEM 25 ml의 25 ml의 피펫 펠렛을 재현 탁한다.
- 큰 직경 깨진 유리 파스퇴르 피펫 상부 미엘린 층 (유백색)을 폐기하고 정상적인 파스퇴르 피펫 BSA 층을 버린다.
- 9 ml의 DMEM에 펠렛을 재현 탁하고 1 ml의 콜라겐 / 디스 파제를 0.1 ml의 DNase의 (최종 농도가 1 ㎎ / ㎖이다)를 추가합니다. 180 rpm에서 진탕 기에서 37 ° C에서 1 시간을위한 솔루션 다이제스트 (주의를 : 재현 탁 피펫을 사용하지 않는 - 세포가 손실 될 수 있습니다).
- 소화되는 동안, 가속도, 위스콘신과, 4 ° C에서 1 시간 동안 3000 XG에서 초 원심 분리기를 사용하여 밀도 구배를 설정하는 퍼콜 용액을 원심 분리하여thout 브레이크.
- 소화 세포 현탁액에 DMEM의 10 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에서 정지를 원심 분리기. 그런 다음 상층 액을 제거하고 DMEM 2 ㎖로 펠렛을 재현 탁.
- 가속 및 브레이크없이 4 ° C에서 10 분 동안 700 XG에서 퍼콜 그라데이션 원심 분리기 위에 조심스럽게 재현 탁 세포를 추가합니다. 참고 : 세포가 계면에 구름으로 볼 수 있습니다.
- 약 가져 가라. 긴 멸균 된 바늘로 세포와 상간의 12 ml의 DMEM 5 ml의 새로운 50 ml의 팔콘에 넣습니다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에서 다시 세포를 원심 분리기. 이후 내피 세포 배지 중 펠렛을 재현 탁 (약 사용한다. 0.2 ml의 배지를 1cm 세포 배양 판의 두 표면 당).
- 코팅 된 세포 배양 플레이트로부터 도포 액을 제거한다 (단계 3.2 참조), 두 개의 연속적인 세척 단계에서 멸균 PBS로 각 웰을 씻어.
- 내피 세포에서 세포 배양을 유지세포 37 ° C에서 중간 및 5 % 무균 인큐베이터에서 CO 2. 모든 2~3일 매체를 변경합니다. 90 %의 합류에 분할 세포.
Representative Results
즉시 차단 후, 뮤린 BMECs 및 오염 세포를 세포 배양 배지 (도 1A, 0 일)에 떠 대기업을 형성한다. 그들은 이러한 독소에 대한 상대 저항에 이르는 P는 당 단백질로 유출 수송의 높은 수준을 표현하기 때문에 pyrumycin과 치료는 쥐의 BMECs의 선택으로 이어집니다. 오염 세포 매개 세포 독성 (19) pyrumycin 훨씬 더 민감하다. MBMECs는 콜라겐 IV / 피브로넥틴 코팅 된 세포 배양 판 (그림 1A, 1 일 및 2 일)에 부착하기 시작하는 반면 pyrumicin 선택의 과정에서 오염 세포는 세포 사멸 또는 괴사 세포 사멸을 입력합니다. 5 일까지, MBMECs 약의 밀도로 증식. 80~90%. 이들은 전형적인 방추형 외관을 특징으로한다. 합류, 그들은 단단히 세로 방향으로 정렬, 포장 및 비 중복 접촉 억제 세포 (그림 1A, 5 일)의 단일 층을 형성한다. 로(; 그림 1B PECAM1) 내피 세포 마커 CD31에 의해 입증 된 바와 같이 pyrumicin 선택, 최대 99 % MBMEC의 높은 순도에 도달. MBMECs 단단히 꽉 접합 단백질에 의해 상호 연결 밀봉 된 단일 층을 형성한다. 7 후 - 문화의 8 일, 내피 세포 층은 전기 저항에 대한 안정적인 값을 구축 (20 사이의 전형적인 값에 도달 - Ω (30)를 X cm 2). 및 커패시턴스 (그림 1C)이 시간 시점에서 기능 분석 등의 세포 -로 에반스 청색 또는 덱스 트란과 함께 예 : 이주 실험 3, 20, 21 및 투과성 시험은 수행되어야한다.
그림 1. 형태 학적 및 설치류 BMECs의 기능적 특성. 투과광 마이크로 볼 배양 BMECs의 (A) 주제 경시이상 오일 SCOPY. 스케일 바는 모든 이미지에 적용됩니다. 내피 세포 마커 CD31에 대한 (B) 면역 형광 염색을 하루 5 CD31 (녹색) 및 DAPI (파란색)에서. (C) 세포 5 일 동안 예비 배양 한 후위한 자동화 된 시스템으로 전송되었다 생물 물리학 적 특성 (저항 및 정전 용량)의 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
혈액 - 뇌 장벽 기능 장애는 다발성 경화증의 BBB의 예를 들어 고장 광범위자가 반응 면역 세포에 의한 중추 신경계의 침략을 용이하게하고 희소 돌기 아교 세포의 만남과 파괴를 가능하게 다양한 해로운 CNS 질환의 특징이다. 허혈성 뇌졸중에서 BBB의 중단과 뇌 부종의 후속 형성 보조 경색의 성장과 환자 6의 생존율에 영향을 미치는 중요한 요소이다. 나아가, 원격지에서 BBB의 변화에 의해 국소 허혈성 뇌 병변의 광범위한 기능적 변화를 유도 할 수있다. 그러나, 기본 분자 메커니즘은 5 크게 알려져 있지 않다. 반면에, 기능 BMECs에서 높은 밀도와 유출 수송의 다양성은 감염성 질환에 대한 뇌의 악성 종양 또는 항생제 화학 요법으로 도움이 약물의 농도를 감소시킨다. 따라서, 뇌 혈관 바의 깊은 이해생리 학적 및 병태 생리 학적 조건 하에서는 캐리어 기능은 특히 선호 방향 (21)에 장벽 기능을 조절 할 수있는 약리학 적 제제를 개발하는 것이 요구된다. BBB의 체외 모델에서 신뢰성이 BBB에서 규제 메커니즘을 연구하기 위해 필수 불가결 한 도구입니다.
많은 불사 화 뇌 내피 세포주 확립 및 체외 BBB 모델 (22)로서 사용되어왔다. 그들은 빠르게 성장하고 여러 통로를 통해 특정 BBB 특성을 유지 이들 세포주는 차 BMECs을 통해 어떤 이점을 제공합니다. 그러나 내피 세포 라인은 완전히 생체 내 상황에 대한 실험 결과의 양도와 섞이는 등의 중요한 속성이 변경 일차 전지를 대체 할 수 없습니다. 예를 들어, 뮤린 뇌 내피 세포주 bEnd.5 높은 parac 선도 불연속 분산 꽉 접합 단백질 만 낮은 수준을 발현ellular 투과성 (23). BEnd.3 다른 자주 사용되는 뮤린 뇌 내피 세포주, 치밀하고 연속 분산 견고 연접, 높은 저항 transendothelial 여러 유출 수송차와 낮은 세포층 투과성을 보여준다. 일차 BMECs 특정 세포 횡단 및 세포층의 기판 (24)의 투과에 대하여 실제 차별 부족하지만 bEND.3 셀 층 비해.
차 세포 배양의 준비에서 오염 세포는 크게 실험 결과의 타당성을 방해 할 수 있습니다. 내피 세포는 높은 순도를 달성하기 위해 기술 된 프로토콜에 pyrumicin은 선택적 제로서 사용된다. 그럼에도 불구하고, 세포 배양의 일반적인 품질 관리 불가피 신뢰성 실험 보장하는데 필요하다. 내피 세포의 전형적인 형태 학적 특성 (도 1a 참조), transendothelia 게다가 품질 제어를위한 여러 가지 방법이있다L 저항을 측정 할 수있는 또는 같은 CD31와 같은 내피 세포 마커의 발현 (그림 1B 참조) 또는 폰 빌레 브란트 인자 (vWF의)가 평가 될 수 있습니다.
한 마우스 뇌로부터 단리 뇌 내피 세포의 수가 상대적으로 낮은 여러 실험에 적합한 세포 배양을 설정하는 등의 여러 쥐의 뇌를 풀링 할 수있다. 우리의 경험에서, 적어도 10 마우스는 각 동물 시설의 자원에 따라 제한적인 요소가 될 수있는 하나의 실험을 위해 사용되어야한다. 바이어스 또는 교란 요인을 피하기 위해, 동일한 유전 적 및 환경 적 배경 만 마우스 풀링한다. 반대로, 소 및 돼지의 뇌 내피 세포 제제는 하나의 뇌에서 사용할 뇌 내피 세포의 다수를 제공한다. 그러나, 복잡하지 않은 번식과 주택, 가능한 형질 전환 마우스의 광범위하고 계속 증가하는 레퍼토리 외에 주 쥐 BMECs 이상적인로 렌더링모델은 혈액 - 뇌 장벽의 기능을 연구합니다.
BBB 및 기본 분자 메커니즘의 기능에 관한 몇 가지 주요 연구 결과는 2 차원 조직 배양 시스템의 연구에서왔다. 최근, 3 차원 배양 시스템은 내피 세포 루멘 관 네트워크를 형성 할 수 있도록 콜라겐 매트릭스 내에 배치된다 (25)이 개발되어왔다. 이러한 새로운 세포 배양 시스템은 생체 내에서 혈관 손상 유기체 프로세스 더욱 정확한 재생산을 허용. 이러한 혈관 주위 세포와 성상 세포로 NVU 3 차원 세포 배양 시스템의 추가 세포의 참여는 혈액 - 뇌 장벽 기능의 공부 체외 혁명 있습니다; 제 모델은 최근 26 개발되었다.
문제 해결을위한 몇 가지 권장 사항이 있습니다. 모든 멸균 작업의 첫 번째는 내피 세포 배양의 품질에 필수적이다. 둘째, pyrumycin는 셀을 추가해야합니다배양의 처음 2 일 내에 사용되는 배지는, 응용 프로그램은 더 이상 증가 MBMEC 세포 사멸과 낮은 품질의 장벽 기능을 초래할 수있다. 셋째,이 프로토콜에 적용될 효소 제조업체의 지시에 따라 사용 및 저장되어야한다; 그렇지 않으면 자신의 적절한 기능이 손상 될 수 있습니다. 내피 세포 부착하지 않는 경우 또한, 세포 배양 판의 코팅은 개정 될 수 있습니다. 피브로넥틴 및 콜라겐의 농도가 변경되게 또는 다른 기질 단백질이 코팅 용액에 첨가 될 수있다. 마지막으로, 연령, 성별, 동물 시설 내의 연도와 환경 조건의 계절 MBMEC 분리 실험의 비교의 품질에 영향을 줄 수있는 중요한 인자이다. 이 조건이 독립적 인 실험과 비교할 수 있는지를 확인해야한다.
기술 된 프로토콜은 뮤린 BMECs을 분리하는 기본적인 neuroimmunological 방법으로 고려되어야한다. 분리 된 세포는 U이 될 수 있습니다이러한 마이그레이션 분석법, 유전자 및 단백질 발현 연구, 또는 전기 생리 학적 평가 투과성 실험 등 BBB 기능에 추가 통찰력을 얻기 위해 다양한 애플리케이션을위한 나오지. 전술 한 바와 같이, 3D BMECs의 세포 배양 시스템은 NVU의 맥락에서 BBB의 조절에 관여 복잡한 메커니즘을 연구하기위한 새로운 기회를 제공 할 수있다. 따라서, 차 내피 세포의 분리는 향후 BBB 연구 분야에서 매우 중요한 기술에 남아있을 것이다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 연구 협회 임상 연구 (IZKF) 뮌스터에 대한 학제 간 센터 (SEED 3월 12일, SB), (DFG)에 의해 지원되었다, 셀 - 인 - 모션 우수 클러스터 (EXC 1003 - CIM), 뮌스터 대학 (SB 및 SGM에)와 그렇지 크로네-는 Fresenius 재단 (SB 및 SGM에 2012_A88)에 의해. 우리는 우수한 삽화 헤이 케 블룸 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Bovine serum albumin |
| Collagenase CLS2 | Worthington | LS004176 | High relative level of protease activity |
| Collagenase-dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C0543 | From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane |
| DMEM | Sigma Aldrich | D5030 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DNAse | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| FCS | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum (also named fetal bovine serum) |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | Anticoagulant |
| PDS | First Link UK Ltd. | 60-00-850 | Plasma-derived serum |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1644 | Warm to room temperature before use |
| Pyrumycin | Sigma Aldrich | P8833 | Should only be used in first 2 days of culture |
References
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