Isolering av Primär Murina Brain mikrovaskulära endotelceller

Introduction

Brain mikrovaskulära endotelceller (BMEC) bildar monoskikt som är en integrerad del av den högspecialiserade blod-hjärnbarriären (BBB). BMECs är inbördes förbundna genom junctionala proteiner bundna till en basalmembranet. Tillsammans med pericyter, glatta muskelceller, astrocytiska end fötter och cirkulerande blodceller de bygga upp den så kallade neurovaskulära enhet (NVU) ^1. Mot den tidigare föreställningen om en ogenomtränglig barriär mellan blodet och centrala-nervsystemet-system (CNS), är NVU en dynamisk, mycket specifika och reglerade gränssnitt som styr övergången av vätskor, molekyler och celler mellan hjärnans blodkärl och CNS ² . En dysfunktion eller dysreglering av NVU kan initiera och / eller bidra till en mängd olika neurovaskulära, infektiösa, inflammatoriska eller degenerativa sjukdomar i CNS, såsom ischemisk stroke, HIV-encefalopati, multipel skleros, Alzheimers eller Parkinsons sjukdom ^3-6.

_content "> The BMEC monoskiktet är tätt försluten med en skarv komplex bestående av tät (TJ) och adherens korsningar (AJ) ^7. Den höga elektriska resistansen och den låga paracellulär permeabilitet BBB huvudsakligen baserade på TJ-proteiner ^8. De TJs är komplex som bildas av de transmembranproteiner av claudin och occludin familj, som är kopplade till cytoskelettet av endotelcellerna genom adaptermolekyler, såsom de zonulaoccludens (ZO) proteiner ZO1-3 ^4. Adherens korsningar är huvudsakligen sammansatt av den integralt membranprotein vascular endothelial (VE) -cadherin, som är kopplat till cytoskelettet via catenins ^8.

Den förslutning av BBB hindrar det fria utbytet av substrat och celler mellan blod och CSF. Undantag från denna regel är lipofila, små molekyler med en molekylvikt <400 Da, som kan passera BBB från lipid-medierad diffusion ^9. Passagen av större och / ellerhydrofila molekyler, såsom glukos, aminosyror, peptider, proteiner och många läkemedel är begränsad till mycket styrda transcellulära transportsystem ^10, som kan delas in i fem huvudkategorier: carrier-medierad transport, jon transport, aktiv utflödes transport, receptormedierad transport, och caveolae-medierad transport ^4. Dessa transportörsystem hjälper upprätthålla homeostas i CNS, vilket krävs för en korrekt signalgenerering, transduktion och integration. Dessutom BMECs möjlighet att aktivt styra övergången av distinkta molekyler av uttrycket av en mängd olika ectoenzymes. Dessa enzymer är lokaliserade på cellytan och ändra specifika endogena och exogena substrat hindrar eller möjliggör övergången av BBB ^11.

Medan CNS ansågs som en immun privilegierade organ under en lång tid, nya rön tyder på en ganska dynamisk och hårt reglerat system för immun Öveeillance av CNS. De BMECs är kritiskt involverade i regleringen av immunceller transmigration. Genom uttryck av selektiner på sin yta lymfocyterna selektivt induceras att löst fästa till endotelet. Utsöndringen av kemokiner som stöter med specifika receptorer på leukocyter leder till expressionen eller konformationsförändringar av leukocyt-integriner, såsom LFA-1 (lymfocyt-funktionsassocierat antigen-1) och VLA-4 (mycket sen antigen-4). Integrinerna medierar en fast vidhäftning genom att binda deras endoteliala counterreceptors, t.ex. VCAM-I (vaskulär celladhesionsmolekyl), ICAM-I (intercellulär adhesionsmolekyl) som möjliggör transmigration in i hjärnparenkymet mellan eller genom BMECs av BBB ^12-14. Dessa och andra fynd betonar aktiv roll i endotelet sig i att reglera immuncellmigration.

Dessutom BMECs som en del av NVU är involverade i regleringen av det cerebrala blodflödet linked till lokala neuronala metaboliska krav. Vid astrocytisk stimulering endotelceller producerar vasoaktiva substanser såsom kväveoxid leder till avslappning av vaskulära glatta muskelceller ^15.

Angiogenes och neurogenes i utvecklings liksom i den vuxna hjärnan visar parallell mönstring och utveckling och delar många egenskaper i regel ^{1, 4.} Endotelceller är kritiskt involverade i dessa processer ^{16, 17.}

Sammanfattningsvis BMECs ger viktiga funktioner för att motivera en ordentlig utveckling och funktion av CNS. BBB dysfunktion är kopplad till många allvarliga neurologiska sjukdomar. Dock har bara mycket få mål identifierats på hjärnan-kärl gränssnitt för en specifik och effektiv behandling ^18. Förenklat in vitro-modeller har använts för att förstå de mekanismer som är involverade i funktion och reglering av komplexa fysiologiska system för en long tid. Isoleringen som beskrivs av detta manuskript och studiet av murina BMECs in vitro, med tanke på de många olika specifika mus knockout-stammar, kan ge en ytterligare förståelse av BBB-funktion och reglering under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden öppnar upp nya terapeutiska möjligheter.

Protocol

Alla djurförsök har godkänts av de lokala myndigheterna ("LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW, Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz, Recklinghausen, Tyskland") och genomfördes enligt den tyska lagen om djurskydd.

1. Allmänna kommentarer för mus Experiment

1. Utför alla experiment med möss i enlighet med riktlinjerna i respektive Institutional Animal Care och användning kommittén.
2. Hålla möss under patogenfria betingelser och ge dem möjlighet att ha tillgång till föda och vatten ad libitum.
3. Använd ålders- och könsmatchade möss i experimentella grupper eftersom biologiska egenskaper kan variera med ålder och kön.
4. När det är möjligt försöka minska, förfina eller ersätta djurförsök.

2. Framställning av Percoll-gradienten

1. Blanda 19 ml 1 x PBS med 1 ml 10x PBS, 1 ml FCS och 10 ml Percoll.
2. Utför sterile filtrering i ett glasrör (diameter på filterporer: 0,2 ^ m). Efteråt förvaras lösningen vid 4 ° C.

3. Beredning av endotelet Cell Medium och Beläggning av cellodlingsplattor

1. Endotelcell medium:
   1. Beredning av 500 ml medium: (ung. 20%) Blanda 400 ml DMEM medium (. Ca 80%) med 100 ml PDS, 0,25 ml bFGF (. 20 mikrogram / ml, ca 0,05%), 0,5 ml heparin (100 pl / ml;. ca 0,1%) och 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml;. ca 0,1%). Lägg pyrumycin endast för cellodlingsmedium som används i de första två dagarna av kultur.
   2. Utför sterilfiltrering i ett glasrör (diameter på filterporer: 0,2 ^ m). Efteråt förvaras lösningen vid 4 ° C.
2. Beläggning av cellodlingsplattor:
   1. För 1 ml beläggningslösning bereds en lösning av 500 l DDH ₂ O, 400 pl kollagen IV (0,4 mg / ml) och 100 ^ fibronektin (0,1 mg / ml).
   2. Täck hela ytan av each brunn i cellodlingsplattan med beläggningslösningen. Förvara plattan vid 4 ° C över natten.

4. Isolering av murina Brain mikrovaskulära endotelceller (MBMEC)

1. Offra 10 vuxna möss (8-12 veckor gamla, C57BL / 6) genom cervikal dislokation. Efteråt isolera mus-hjärnor och förvara i 5 ml PBS (Varning: Arbete steril).
2. Ta hjärna stjälkar, cerebella och Thalami med en pincett. Lossa hjärnhinnorna genom att försiktigt rulla hjärnorna på en steril läskpapper. Samla de resultemening-free hjärnorna.
3. Överför hjärnorna till en 50 ml Falcon-rör fylls med 13,5 ml av DMEM.
4. Mala vävnaden, först med en 25 ml pipett och därefter med en 10 ml pipett tills mediet blir mjölkig.
5. Smälta sedan vävnaden med en blandning av 0,6 ml kollagenas CLS2 (10 mg / ml i DMEM) och 0,2 ml DNAse (1 mg / ml i PBS) i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) för 1 h vid 37 ° C på en orbital skakar vid 180 rpm.
6. Tillsätt 10 ml DMEM sattes till vävnadssuspension och centrifugera cellerna vid 1000 xg under 10 min vid 4 ° C.
7. Släng supernatanten (Varning: PELLETS är lätt att förlora)
8. För att ta bort myelin, resuspendera pelleten, med en 25 ml pipett i 25 ml av BSA-DMEM (20% vikt / volym) (ung. 25 gånger), och centrifugera vid 1000 xg under 20 min vid 4 ° C.
9. Kasta den övre myelinskiktet (mjölkig) med ett krossat glas pasteurpipett med större diameter, och sedan kassera BSA lager med en vanlig pasteurpipett.
10. Återsuspendera pelleten i 9 ml DMEM och tillsätt 1 ml kollagenas / dispas (slutlig koncentration är 1 mg / ml) och 0,1 ml DNAs. Smälta lösningen under 1 timme vid 37 ° C på en orbitalskakare vid 180 rpm (varning: använd inte pipetten för att blanda - celler kan förloras).
11. Under matsmältning, centrifugera Percoll-lösning för att ställa in densitetsgradient med användning av en ultracentrifug vid 3000 xg under 1 h vid 4 ° C med acceleration, without broms.
12. Tillsätt 10 ml DMEM till den uppslutna cellsuspension. Centrifugera suspensionen vid 1000 xg under 10 min vid 4 ° C. Sedan kassera supernatanten och suspendera pelleten i 2 ml DMEM.
13. Lägg till de resuspenderade cellerna försiktigt på toppen av Percoll-gradienten och centrifugera vid 700 xg under 10 minuter vid 4 ° C utan acceleration och broms. Anmärkning: De celler är synliga som ett moln i interfas.
14. Ta ca.. 12 ml av inter med celler med en lång steril nål och placera den i en ny 50 ml Falcon med 5 ml DMEM.
15. Centrifugera cellerna igen vid 1000 xg under 10 min vid 4 ° C. Efteråt återsuspendera pelleten i endotelial cellmedium (använd ca. 0,2 ml medium per 1 cm ² yta av cellodlingsplatta).
16. Ta beläggningslösning från belagda cellodlingsplattor (se steg 3.2) och skölj varje brunn med steril PBS i två tvättsteg i följd.
17. Behåll cellkulturer i endothelialcell-medium vid 37 ° C och 5% _CO2 i en steril inkubator. Byt medium var två till tre dagar. Split celler vid 90% sammanflödet.

Representative Results

Omedelbart efter isolering, murina BMECs och kontaminerande celler bildar konglomerat flyter i cellodlingsmediet (Figur 1A, dag 0). Behandlingen med pyrumycin leder till ett urval av murina BMECs eftersom de uttrycker höga nivåer av utflödestransportörer såsom p-glykoprotein vilket leder till en relativ resistens mot toxiner. Kontaminerande celler är mycket mer mottagliga för pyrumycin medierad cytotoxicitet ^19. Under processen med pyrumicin val, kontaminerande celler anger apoptotiska eller nekrotisk celldöd, medan MBMECs börjar fästa till kollagen IV / fibronektin belagd cellodlingsplattor (Figur 1A, dag 1 och dag 2). Fram till dag 5, de MBMECs prolifererar till en densitet av ca. 80-90%. De kännetecknas av den typiska spolformad utseende. Vid konfluens, de bildar ett monoskikt av tätt packade, i längdriktningen i linje med och icke-överlappande kontakt-inhiberade celler (figur 1A, dag 5). Avpyrumicin urval, en hög renhet av upp till 99% MBMEC uppnås, vilket framgår av den endoteliala cellmarkören CD31 (PECAM1; Figur 1B). De MBMECs bildar tätt förslutna monolager sammankopplade med snäva junction proteiner. Efter 7-8 dagars odling, de endoteliala cellskikten bygga upp stabila värden för elektrisk resistans (gående typiska värden mellan 20-30 Ω x cm _^2). Och kapacitans (Figur 1C) Vid denna tid-punkt-funktionella analyser såsom cell- migrations experiment ^{3, 20,21} och permeabilitet test, t.ex. med Evans blå eller dextran, bör utföras.

Figur 1. morfologiska och funktionella egenskaper hos Murine BMECs. (A) representant tidsförloppet för odlade BMECs tittade genom överföring ljus microscopy över 5 dagar. Skala bar gäller för alla bilder. (B) immunofluorescensfärgning för endotelceller markören CD31 på dag 5. CD31 (grön) och DAPI (blå). (C) Cellerna förodlas i 5 dagar och sedan överföras till ett automatiserat system för analys av biofysiska egenskaper (resistans och kapacitans). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Blod-hjärn-barriären dysfunktion är ett kännetecken för olika skadliga CNS-sjukdomar, till exempel en uppdelning av BBB, multipel skleros utsträckning underlättar CNS invasion av autoreaktiva immunceller och möjliggör mötet och förstörelse av oligodendrocyter. I ischemisk stroke störningar i BBB och den efterföljande bildningen av hjärnödem är kritiska faktorer som påverkar sekundär infarkt tillväxt och den totala överlevnaden hos patienter ^6. Genom förändringar av BBB i avlägsna områden fokala ischemiska lesioner kan inducera omfattande funktionella förändringar i hjärnan. Men de bakomliggande molekylära mekanismerna är till stor del okända ^5. Däremot hög täthet och mångfald uttransportörer funktionella BMECs minskar koncentrationen av välgörande läkemedel såsom kemoterapeutika för hjärntumörer eller antibiotika för infektionssjukdomar. Därför kan en djupare förståelse av blod-hjärn-barRier funktion under fysiologiska och patofysiologiska tillstånd krävs för att utveckla farmakologiska medel som har förmåga att specifikt reglera barriärfunktionen i den gynnade riktningen ^21. Pålitlig in vitro modeller av BBB är oumbärliga verktyg för att studera de regleringsmekanismer på BBB.

Många odödliggjorda hjärnan endothelial cellinjer har etablerats och används som in vitro BBB: modeller ^22. Dessa cellinjer ger vissa fördelar jämfört med primära BMECs när de växer snabbare och hålla vissa BBB: egenskaper under flera passager. Däremot kan endotelceller cellinjer inte helt ersätta primära celler som viktiga egenskaper byts som blandas med överförbarhet av experimentella resultat till in vivo-situationen. Till exempel, den murina hjärn endotelcellinje bEnd.5 uttrycker endast låga halter av diskontinuerligt fördelade tight junction proteiner som leder till hög paracellular permeabilitet ^23. BEnd.3, en annan ofta använd murina hjärn endotelcellinje visar täta och kontinuerliga distribuerade tight junctions, hög transendoteliala motstånd, flera uttransportörer och låg paracellulär permeabilitet. Men bEND.3 cellager jämfört med primära BMECs saknar en verklig diskriminering med avseende på genomträngning av vissa transcellulär och paracellulära substrat ^24.

I beredningar av primära cellkulturer, kan kontaminerande celler signifikant interferera med giltigheten av experimentella upptäckter. I den beskrivna protokollet, pyrumicin användas som ett selektivt medel för endotelceller för att uppnå hög renhet. Icke desto mindre är oundvikligen behövs en regelbunden kvalitetskontroll av cellkulturen för att garantera tillförlitliga experiment. Det finns flera metoder för kvalitetskontroll, förutom typiska morfologiska egenskaper hos endotelceller (se Figur 1A), den transendothelial motstånd kan mätas eller expressionen av endotelial cellmarkör, såsom CD31 (se figur 1B) eller von Willebrand-faktor (vWF) kan utvärderas.

Antalet hjärn endotelceller isolerade från en mus hjärna är relativt låg och att inrätta en lämplig cellkultur för flera experiment, hjärnan hos flera möss måste slås samman. Enligt vår erfarenhet, minst 10 möss måste användas för ett experiment som kan vara en begränsande faktor som beror på de resurser som respektive djuranläggning. För att undvika systematiska fel och störfaktorer bör endast möss med en identisk genetiska och miljömässiga bakgrunden slås samman. Däremot nötkreatur och svin preparat hjärna endotelial cell ge ett stort antal av hjärn endotelceller som finns i en hjärna. Men förutom den okomplicerade avel och bostäder, det breda och ständigt växande repertoar av tillgängliga transgena möss gör primära murina BMECs som ett idealmodell för att studera blod-hjärn-barriärfunktion.

Flera viktiga rön om funktionerna i BBB och de underliggande molekylära mekanismer har kommit från studier i 2D vävnadskultursystem. Nyligen har 3D odlingssystem utvecklats ^25, där endotelceller är placerade i en kollagenmatris så att de kan bilda lumen och rörformade nätverk. Dessa nya cellodlingssystem möjliggör en ännu mer exakt återgivning av vaskulära processer i den intakta organismen in vivo. Medverkan av ytterligare celler av NVU i 3D cellodlingssystem, såsom pericyter och astrocyter kan revolutionera in vitro studier av blod-hjärn-barriären funktion; första modellerna har nyligen utvecklats ^26.

Det finns några rekommendationer för felsökning. Först av allt steril arbetsmiljö är mycket viktigt för kvaliteten på den endoteliala cellkultur. För det andra bör pyrumycin endast till för cellodlingsmedium som användes i de första två dagarna av kultur, kanske längre tillämpning leda till ökad MBMEC celldöd och låg kvalitet barriärfunktion. För det tredje bör de enzymer som används i detta protokoll användas och förvaras enligt tillverkarens anvisningar; annars deras rätta funktion kan äventyras. Dessutom kan beläggningen av cellodlingsplattor ändras om endotelceller inte fäster. Koncentrationer av fibronektin och kollagen kan ändras eller andra matrixproteiner kan tillsättas till beläggningslösningen. Slutligen, ålder, kön, årstid och miljöförhållanden inom djurhuset är viktiga faktorer som kan påverka kvaliteten på MBMEC isolering och jämförbarhet av experiment. Man bör se till att förhållandena är jämförbara mellan oberoende experiment.

Den beskrivna protokollet bör betraktas som en grundläggande neuroimmunological metod för att isolera murina BMECs. De isolerade cellerna kan vara used för en mängd olika tillämpningar för att få ytterligare inblick i BBB funktion, såsom migrationsanalyser, gen och proteinexpressionsstudier, elektrofysiologiska utvärderingar eller permeabilitet experiment. Som nämnts ovan, kan 3D cellodlingssystem BMECs ge nya möjligheter att studera de komplexa mekanismer som är involverade i regleringen av BBB i samband med NVU. Därför kommer isolering av primära endotelceller förbli en ovärderlig teknik inom området för BBB-forskning i framtiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A9418	Bovine serum albumin
Collagenase CLS2	Worthington	LS004176	High relative level of protease activity
Collagenase-dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV	Sigma Aldrich	C0543	From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM	Sigma Aldrich	D5030	Warm in 37 °C water bath before use
DNAse	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin	Sigma Aldrich	H3393	Anticoagulant
PDS	First Link UK Ltd.	60-00-850	Plasma-derived serum
Percoll	Sigma Aldrich	P1644	Warm to room temperature before use
Pyrumycin	Sigma Aldrich	P8833	Should only be used in first 2 days of culture