İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

Introduction

Son derece uzmanlaşmış, kan-beyin-bariyerinin (KBB) ayrılmaz bir parçası olan beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC) form monotabaka. BMECs bir bazal membran bağlı birleşim proteinler tarafından birbirine bağlanır. Birlikte perisitlerin, düz kas hücreleri, astrositik son ayak ve dolaşımdaki kan hücreleri ile bu sözde nörovasküler ünitesi (Nvu) ¹ oluşturmak. Kan ve merkezi sinir sistemi (MSS) arasında su geçirmez bir bariyer önceki fikrine karşı, NVU serebral kan damarları ve merkezi sinir sistemi ² ile sıvı, moleküller ve hücrelerin geçişini kontrol eden bir dinamik, son derece spesifik ve düzenli bir arayüz . Nvu bir fonksiyon bozukluğu ya da düzensizliği, başlatma ve / veya mesela iskemik inme, HİV-ensefalopati, multipl skleroz, Alzheimer ya da Parkinson hastalığı ^3-6 gibi merkezi sinir sisteminin nörovasküler, enfeksiyöz enflamatuar veya dejeneratif hastalıkların, çeşitli katkıda bulunabilir.

_content "> BMEC tek tabaka sıkıca sıkı (TJ) oluştuğu bir kavşak kompleksi tarafından mühürlenir ve (AJ) ^7., yüksek elektrik direnci ve BBB düşük paraselüler geçirgenlik ağırlıklı TJ proteinler dayanmaktadır kavşakları ^8. TJs vardır adherens örneğin zonulaoccludens (zo) proteinleri olarak adaptör moleküller, endotel hücrelerinin hücre iskeleti ile bağlantılıdır Claudin ve occludin ailesinin zar proteinleri, oluşan kompleksler ZO1-3 ⁴ adherens birleşme esas olarak bütün zar proteini tarafından monte edilir. kateninlerin ⁸ yoluyla hücre iskeleti ile bağlantılı vasküler endotelyal (VE) -cadherin.

BBB sıkı sızdırmazlık kan ve BOS arasında yüzeylerde ve hücrelerin serbest değişimini engeller. Bu kuralın istisnaları lipid-aracılı difüzyon ⁹ tarafından BBB geçmeye edebiliyoruz bir molekül ağırlığı <400 Da ile lipofilik, küçük moleküllerdir. Geçişi, daha büyük ve / veyaörneğin glükoz, amino asitler, peptidler, proteinler ve bazı ilaçlar gibi hidrofil olan moleküller, beş ana sınıfa ayrılabilir yüksek oranda kontrol edilen hücre üzerinden taşıma sistemleri ^10, sınırlı: taşıyıcı aracılı taşıma, iyon taşıma, aktif akış ulaşım, reseptör aracılı ulaşım ve kaveolanın aracılı taşıma ^4. Bu taşıyıcı sistemleri, bir doğru sinyal üretimi, transdüksiyon ve entegrasyon için gerekli olan merkezi sinir sistemi, dengesini sağlamaya yardımcı olur. Ayrıca, BMECs aktif ectoenzymes çeşitli ifadesi ile ayrı moleküllerin geçişini kontrol etmek mümkün bulunmaktadır. Bu enzimler, engelleyici ya da BBB ¹¹ geçişini sağlayan belirli bir iç ve dış alt tabakalar, hücre yüzeyinde lokalize ve değiştirmesi.

CNS uzun bir süre için bir bağışıklık ayrıcalıklı bir organ olarak kabul edildi ise, son bulgular bağışıklık Surv bir oldukça dinamik ve sıkı düzenlenmiş sistemini önermekMSS'nin eillance. BMECs eleştirel bağışıklık hücre göçü düzenlenmesinde rol. Yüzey lenfositler üzerinde selektinler sentezlenmesi ile seçici olarak gevşek endotelyuma bağlamak için indüklenir. Lökositler üzerinde belirli reseptörler ile karşılaşma kemokinlerin salgılanması ekspresyonu ya da LFA-1 gibi lökosit bütünleyicilerinin konformasyonel değişikliklere neden olmaktadır (limfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen-1) ve VLA-4 (çok geç antijen-4). Integrinleri arasında ya BBB ^12-14 BMECs ile beyin parankiması içine transmigrasyonu sağlayan endotel counterreceptors, örneğin, VCAM-l (damar hücresi yapışma molekülü), ICAM-I, (hücreler arası adhezyon molekülü) bağlanma ile sıkı bir yapışmaya aracılık eder. Bunlar ve diğer bulgular, bağışıklık hücre göçünü düzenlenmesinde endotel kendisinin aktif rolünü göstermektedir.

Ayrıca, BMECs Nvu parçası serebral kan akımı li düzenlenmesinde rol gibidiryerel nöronal metabolik talepleri nked. Astrositik uyarımı üzerine, endotel hücreleri, vasküler düz kas hücreleri ¹⁵ gevşemesine neden olan nitrik oksit gibi vazoaktif maddeler üretmektedir.

Gelişmekte yanı sıra yetişkin beyin gösteri paralel desenleme ve geliştirme ve düzenleme ^{1, 4,} birçok özelliklerini paylaşmak Anjiyogenesis ve nöron. Endotel hücreleri kritik Bu işlemler ^{16, 17} yer alırlar.

Özetle, BMECs MSS uygun bir geliştirme ve işleyişini garanti için gerekli özellikleri sağlar. BBB fonksiyon bozukluğu pek çok ciddi nörolojik bozukluklara bağlıdır. Bununla birlikte, çok az hedef spesifik ve etkili tedavi ¹⁸ beyin-damar sistemi ara yüzeyinde tespit edilmiştir. In vitro modellerinin basitleştirilmiş bir lo için fonksiyonu ve karmaşık fizyolojik sistemlerin düzenlenmesinde rol mekanizmaları anlamak için kullanılmıştırng zamanı. Bu yazıda ve murin BMECs in vitro çalışmada tarif edilen özel fare nakavt-suşların çeşitli verilen izolasyon, yeni tedavi edici kapılar açmaktadır fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda KBB fonksiyonu ve düzenleme daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir.

Protocol

Hayvan koruma Alman yasalarına göre ve yapılan tüm hayvan deneyleri yerel yönetimler ("Recklinghausen, Almanya;; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW") tarafından kabul edildi.

Fare Deneyleri 1. Genel Yorumlar

1. İlgili Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallarına uygun olarak fareleri kullanarak tüm deneyler yapın.
2. Patojenden serbest durumlar altında farelerin tutmak ve yiyecek ve su ad libitum erişmesini sağlayacak.
3. Biyolojik özellikleri, yaş ve cinsiyete göre değişir, çünkü deney gruplarında yaş ve cinsiyet uyumlu fareler kullanın.
4. Mümkün azaltmak rafine veya hayvan deneyleri değiştirmeye çalışın.

Percoll 2. hazırlanması

1. 1 mi 10x PBS, 1 mi FCS ve 10 ml Percoll 1x PBS 19 ml karıştırın.
2. Ste gerçekleştirinbir cam tüp içinde filtrasyonu (: 0.2 um filtre gözenek çapı) çözündürülür. Daha sonra 4 ° C'de çözelti saklayın.

Endotel hücre ortamı ve hücre kültür plakalarının Kaplamanın 3. hazırlanması

1. Endotel hücre ortamı:
   1. 500 ml ortam hazırlanması: (. Yaklaşık% 20), 100 mi PDS ile 400 mi DMEM ortamı (. Yaklaşık% 80) karıştırın, 0.25 ml bFGF (. 20 ug / ml; yaklaşık% 0.05), 0.5 ml heparin (100 ul / mi;., yaklaşık% 0.1) ve 0.5 ml pyrumycin (4 mg / ml., yaklaşık% 0.1). Ancak kültür ilk 2 gün içinde kullanılan hücre kültür ortamı için pyrumycin ekleyin.
   2. Bir cam tüp içinde bir steril süzme (: 0.2 um filtre gözenek çapı) yapın. Daha sonra 4 ° C'de çözelti saklayın.
2. Hücre kültür plakalarının Kaplama:
   1. Kaplama çözeltisi, 1 ml için, 500 ul GKD _2, O, 400 ul kolajen IV (0.4 mg / ml) ve 100 ul fibronektin (0.1 mg / ml) ihtiva eden bir çözelti hazırlayın.
   2. EAC bütün yüzeyini kaplayacakkaplama solüsyonu ile hücre kültürü plakasının h yanı. Gece boyunca 4 ° C 'de plaka saklayın.

Fare Beyin mikrovasküler endotel hücreleri 4. izolasyonu (MBMEC)

1. Servikal dislokasyon - (12 haftalık, C57BL / 6 8) 10 yetişkin fareler kurban. Daha sonra PBS 5 ml fare beyinleri ve mağaza izole (ihtar:! Çalışma steril).
2. Bir forseps ile beyin sapları, serebellası ve Thalami çıkarın. Dikkatlice steril bir kurutma kağıdı üzerine beyinleri yuvarlayarak meninksleri ayırın. Elde edilen Beyin zarı içermeyen forebrains toplayın.
3. DMEM 13.5 ml ile doldurulmuş bir 50 ml Falcon tüpüne beyinleri aktarın.
4. Ortam sütlü hale gelene kadar, 10 ml'lik bir pipet ile ilk önce, sonra 25 ml'lik bir pipet ile, doku kıyma.
5. Daha sonra, bir yörünge üzerinde 37 ° C de 1 saat süre ile Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) 'de 0.6 ml kollajenaz CLS2 (10 mg / DMEM içerisinde mi) ve 0.2 ml DNAse (PBS içinde 1 mg / ml) içeren bir karışım ile doku özet sallamak180 rpm'de r.
6. DMEM ekleme 10 mi, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de doku süspansiyon ve santrifüj hücreleri ilave edildi.
7. Atma süpernatant (İhtar:! PELLET kaybetmek kolaydır)
8. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de (yakl. 25 defa) (20 a / h%), ve santrifüj, miyelin kaldırmak BSA-DMEM, 25 ml, 25 ml'lik bir pipet ile pelet tekrar süspansiyon.
9. Büyük çaplı bir kırık cam Pasteur pipeti ile üst miyelin tabakasının (süt) atın ve daha sonra normal bir Pasteur pipeti ile BSA katman atılır.
10. 9 ml DMEM içinde pelletini ve 1 ml kolajenaz / dispaz ve 0.1 ml DNAse (nihai konsantrasyon 1 mg / ml) ilave edilmektedir. 180 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de 1 saat boyunca çözeltinin Digest (uyarı: yeniden askıya almak için pipet - kullanmayın hücrelerin yok edilebilir).
11. Sindirim sırasında, ivme, wi ile, 4 ° C'de 1 saat süre ile 3000 x g hızında bir ultrasantrifüj kullanarak, yoğunluk gradyanı ayarlamak için Percoll çözeltisi santrifüjthout fren.
12. Sindirilmiş hücre süspansiyonuna DMEM, 10 ml ilave edilir. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de süspansiyon santrifüjleyin. Daha sonra süpernatan atılır ve DMEM 2 ml pelletini.
13. Hızlanma ve fren olmadan 4 ° C'de 10 dakika boyunca 700 x g'de Percoll gradient ve santrifüj üzerine dikkatli bir şekilde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler ekleyin. Not: Hücreler interfazda bir bulut gibi görünür.
14. Yaklaşık alın. Uzun bir steril bir iğne ile hücreleri ile ara faz 12 ml ve 5 ml DMEM ile yeni bir 50 ml'lik Falcon yerleştirin.
15. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1,000 x g hızında tekrar hücreleri santrifüjleyin. Daha sonra endotel hücre ortamı içinde tekrar süspansiyon pelet (yaklaşık kullanın. Ortamın 0.2 ml ve 1 cm hücre kültürü plakasının ² yüzeyi başına).
16. Kaplanmış hücre kültür levhalarından Kaplama çözeltisini çıkarın (adım 3.2) ve iki ardışık yıkama aşamaları steril PBS ile de her yıkayın.
17. Endotelyal hücre kültürleri korumakHücre, 37 ° C'de orta ve% 5 steril bir kuluçka makinesi içinde _CO2. Her 2-3 gün orta değiştirin. % 90 izdiham Split hücreleri.

Representative Results

Hemen olarak izolasyon işleminden sonra, kemirgen BMECs ve bulaşıcı hücreler, hücre kültür ortamı (Şekil 1 A, 0 gün) içinde yüzen konglomera oluşturur. Bu tür toksinler için göreli bir dirence yol açan, P-glikoprotein olarak akış taşıyıcıların yüksek seviyelerde ifade ettiklerinden pyrumycin ile muamele sıçangil BMECs bir seçimine neden olur. Kirlenmesine neden olan hücreleri aracılı sitotoksisite ¹⁹ pyrumycin çok daha hassastır. MBMECs kolajen IV / fibronektin kaplı hücre kültürü plakaları (Şekil 1A, Gün 1 ve Gün 2) takmak için başlar ise pyrumicin seçim sürecinde, bulaşıcı hücreler, apoptotik ya da nekrotik hücre ölümü girin. 5 gün kadar, MBMECs, yaklaşık bir yoğunluğa çoğalır. 80-90%. Bunlar tipik iğ şekilli bir görünüm ile karakterize edilir. Konflüansta, sıkıca uzunlamasına hizalanmış, paketlenmiş olan ve olmayan üst üste binen temas inhibe hücreleri (Şekil 1A, gün 5) bir tek tabaka oluşturur. Tarafından(Şekil 1B PECAM1) endotelyal hücre belirteci, CD31 ile gösterildiği gibi pyrumicin seçimi,% 99'a kadar MBMEC bir yüksek saflıkta ulaşılır. MBMECs sıkı sıkı birleşme proteinleri tarafından birbirine bağlanmış, kapalı tek katmanlarını oluştururlar. 7. Sonra - Kültür 8 gün, endotel hücre elektrik direnci için sabit değerler oluşturmak (20 arasındaki tipik değerlere ulaşır - Ω 30 x _^cm2). Ve kondansatör (Şekil 1C) bu zaman noktasında fonksiyonel deneyler, bu hücre-gibi Evans mavi ya da dekstran, örneğin geçiş Deneyler ^{3, 20,21} ve geçirgenlik testi, yapılmalıdır.

Şekil 1. Morfolojik ve faregiller BMECs fonksiyonel özellikleri. Transmisyon ışık mikro tarafından izlendi kültürlü BMECs (A) Temsilcisi zaman dersüzerinde 5 gün skopi. Skala çubuğu bütün resimler için de geçerlidir. Endotelyal hücre belirteci CD31 (B), immünofloresan boyama gün 5 CD31 (yeşil) ve DAPI (mavi) de. (C), hücreler, 5 gün süreyle önceden kültürlenmiş ve daha sonra otomatik bir sisteme aktarıldı biyofiziksel özellikleri (direnç ve kondansatör) analizi. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Kan beyin bariyeri disfonksiyon multipl skleroz BBB örneğin bir arıza yoğun Otoreaktif bağışıklık hücreleri tarafından MSS işgali kolaylaştırır ve oligodendrositlerin karşılaşma ve yıkımı sağlayan çeşitli zararlı MSS hastalıklarının bir işareti olur. Iskemik inme BBB bozulması ve beyin ödemi sonraki oluşumu ikincil enfarktüs büyüme ve hastaların ⁶ genel sağkalımı etkileyen önemli faktörlerdir. Ayrıca, uzak bölgelerde BBB değişimlerden fokal iskemik lezyonlar beyinde yaygın işlevsel değişikliklere neden edebiliyoruz. Ancak, altta yatan moleküler mekanizmaları ⁵ büyük ölçüde bilinmemektedir. Bunun aksine, fonksiyonel BMECs yüksek yoğunluğu ve akış taşıyıcıların çeşitlilik, enfeksiyöz hastalıklar için, beyin hastalıklar ya da antibiyotikler için kemoterapi maddeleri olarak yararlı ilaçların yoğunluğunu azaltır. Bu nedenle, kan-beyin-çubuğunun daha derin bir anlayışfizyolojik ve patofizyolojik koşullarda rier işlevi, özellikle tercih edilen bir yönünde ²¹ bariyer fonksiyonunu regüle edebilirler farmakolojik maddeler geliştirmek için gereklidir. BBB in vitro modellerinde Güvenilir BBB düzenleyici mekanizmaları incelemek için vazgeçilmez araçlardır.

Birçok ölümsüzleştirilmiş beyin endotelyal hücre soyları kurulmuştur ve in vitro olarak BBB model ²² olarak da kullanılmıştır. Daha hızlı büyür ve birkaç pasaj üzerinde bazı BBB özelliklerini tutmak gibi bu hücre hatları birincil BMECs üzerinde bazı avantajlar sunuyoruz. Bununla birlikte, endotel hücre hatları tamamen in vivo durumu deneysel bulguların devredilebilirliği ile karışmasına gibi önemli özellikleri değiştirildiğinde birincil hücreler yerini alamaz. Örneğin, kemirgen beyin endotelyal hücre hattı bEnd.5 yüksek Parac neden kesikli olarak dağıtılmış sıkı birleşme proteinlerinin ancak düşük düzeylerde ekspreseellular geçirgenliği ^23. BEnd.3, sıklıkla kullanılan bir diğer murin beyin endotelyal hücre hattı, yoğun ve sürekli dağıtılan sıkı kavşaklar, yüksek transendoteliyal direnci, çeşitli akış transporterlerini ve düşük paraselüler geçirgenlik gösterir. Birincil BMECs bazı hücre üzerinden ve paraselüler alt tabakaların ²⁴ permeabilitesi ile ilgili gerçek bir ayrımı eksikliği Ancak bEND.3 hücre tabakaları karşılaştırıldı.

Primer hücre kültürleri hazırlıklarında, bulaşıcı hücreler önemli ölçüde deneysel bulguların geçerliliği engelleyebilir. Endotel hücrelerinin yüksek saflık elde etmek için tarif edilen protokol, pyrumicin seçici bir madde olarak kullanılır. Bununla birlikte, hücre kültürünün, düzenli bir kalite kontrol kaçınılmaz olarak güvenilir deneyler için garanti etmek için gereklidir. Endotel hücrelerinin tipik morfolojik özellikleri (Şekil 1A bakınız), transendothelia yanı sıra kalite kontrolü için çeşitli yöntemler vardırl direncinin ölçülmesi olabilir ya da bu tür CD31 gibi endotel hücre markeri ekspresyonu (Şekil 1B'ye bakınız) ya da, von Willebrand faktörü (vWF) ile değerlendirilebilir.

Bir fare beyninden izole edilmiş beyin endotelyal hücrelerin sayısı göreceli olarak düşüktür ve çok sayıda deney için uygun bir hücre kültürünün ayarlamak için birkaç farelerin beyinleri toplanmış gerekir. Deneyimlerimize göre, en az 10 farenin ilgili hayvan tesisine kaynaklarına bağlı olarak sınırlayıcı bir faktör olabilir, bir deney için kullanılması gerekmektedir. Bias ve eşlik eden faktörler önlemek için, benzer bir genetik ve çevresel kökenli fareler sadece bir araya getirilmiş olması gerekir. Bunun tersine, sığır ve domuz beyin endotelyal hücre preparatları, bir beyin bölgesindeki uygun beyin endotelyal hücrelerin geniş bir dizi sağlar. Bununla birlikte, karmaşık olmayan bir üretim ve barındırma, mevcut transgenik farelerin, geniş ve artan repertuarına yanında birincil sıçangil BMECs ideal olarak işlemekmodeli, kan-beyin bariyeri işlevini incelemek için.

BBB ve altta yatan moleküler mekanizmaların işlevleri hakkında birkaç önemli bulgular 2D doku kültürü sistemlerinde çalışmalardan gelir. Son zamanlarda, 3D kültür sistemleri endotel hücreleri lümeni ve boru şekilli ağlar oluşturmak üzere sağlayarak bir kollajen matrisi içine yerleştirilen ^25, geliştirilmiştir. Bu yeni hücre kültür sistemleri, in vivo olarak da faal organizma üzerindeki vasküler süreçlerin daha da hassas üretimi için izin verir. Böyle perisitlere ve astrositleri NVU 3D hücre kültürü sistemlerinin daha hücrelerin katılımı kan-beyin-bariyer fonksiyonunun okuyan in vitro devrim olabilir; İlk modelleri son ²⁶ geliştirilmiştir.

Sorun giderme için bazı öneriler vardır. Tüm steril çalışma önce endotel hücre kültürünün kalitesi için gereklidir. İkinci olarak, pyrumycin sadece hücre eklenmelidirKültürün ilk 2 gün içinde kullanılan kültür ortamı, uzun uygulama artan MBMEC hücre ölümü ve düşük kaliteli bir bariyer fonksiyonunun neden olabilir. Üçüncü olarak, bu protokolde uygulanan enzimler üretici firmanın talimatlarına uygun olarak kullanılmış ve muhafaza edilmelidir; aksi takdirde düzgün işlevi bozulabilir. Endotel hücreleri EKLEMEYİNİZ Dahası, hücre kültür plakalarının kaplama değişiklik olabilir. Fibronektin ve kollajen konsantrasyonları değiştirilebilir olabilir veya başka bir matris proteinleri, kaplama çözeltisine eklenebilir. Son olarak, yaş, cinsiyet, hayvan tesis içinde yıl ve çevre koşullarının sezon MBMEC izolasyonu ve deneyler karşılaştırılabilirlik kalitesini etkileyebilecek önemli faktörlerdir. Bu koşullar, bağımsız deneyler arasında karşılaştırılabilir olması sağlanmalıdır.

Açıklanan protokol, sıçangil BMECs izole etmek için temel bir nöroimmünolojik yöntem olarak kabul edilmelidir. Izole edilmiş hücreler olabilir, uBu tür göç deneyleri, gen ve protein ifade çalışmaları, elektrofizyolojik değerlendirmeler veya geçirgenlik deneyleri gibi BBB fonksiyonu içine daha fazla fikir, kazanmak için geniş bir uygulama yelpazesi için sed. Yukarıda zikredildiği gibi, BMECs 3D hücre kültür sistemleri Nvu bağlamında bbb düzenlenmesinde rol oynayan karmaşık mekanizmalarını incelemek için yeni fırsatlar sağlayabilir. Bu nedenle, primer endotel hücrelerinin izolasyonu gelecek BBB araştırma alanında çok değerli bir teknik kalacaktır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A9418	Bovine serum albumin
Collagenase CLS2	Worthington	LS004176	High relative level of protease activity
Collagenase-dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV	Sigma Aldrich	C0543	From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM	Sigma Aldrich	D5030	Warm in 37 °C water bath before use
DNAse	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin	Sigma Aldrich	H3393	Anticoagulant
PDS	First Link UK Ltd.	60-00-850	Plasma-derived serum
Percoll	Sigma Aldrich	P1644	Warm to room temperature before use
Pyrumycin	Sigma Aldrich	P8833	Should only be used in first 2 days of culture