Abstract
Visualiseringen af fuld længde neuronale projektioner i embryoner er vigtigt at få en forståelse af, hvordan pattedyr neuronale netværk udvikle sig. Her beskriver vi en metode til at mærke på stedet en delmængde af dorsale ganglion (DRG) Axon fremskrivninger at vurdere deres fænotypiske karakteristika ved hjælp af flere genetisk manipulerede mus linjer. TrkA-positive neuroner er nociceptor neuroner, dedikeret til transmission af smerte signaler. Vi benytter en TrkA taulacZ mus linje til at mærke baner for alle TrkA-positive perifere axoner i ubeskadiget museembryo. Vi yderligere avle TrkA taulacZ linje på en Bax null baggrund, som i det væsentlige afskaffer nerveapoptose, for at vurdere vækst-relaterede spørgsmål uafhængigt af mulige effekter af genetiske manipulationer på neuronal overlevelse. Efterfølgende genmodificerede mus af interesse avlet med TrkA TaulACZ / Bax null linje og er herefter klar til undersøgelse under anvendelse af de heri beskrevne teknikker. Denne præsentation indeholder detaljerede oplysninger om mus avlsplaner, genotypebestemmelse ved dissektion, forberedelse væv, farvning og clearing at give mulighed for visualisering af fuld længde axonale baner i hel-mount forberedelse.
Introduction
Etablering af præcise neuronale netværk er en kompleks udviklingsproces afgørende for funktionaliteten af nervesystemet. Forstyrrelser i denne proces fører til neuronal dysfunktion, som er blevet impliceret i humane neurologiske sygdomme 1-3. For at undersøge de underliggende molekylære mekanismer i axon vækst og mål innervation hos pattedyr, har vi udviklet en protokol til at visualisere axonale baner TrkA-udtrykkende sensoriske neuroner ved hjælp af en kombination af to genetisk modificerede mus linjer.
TrkA er en receptor for nervevækstfaktor NGF og er en funktionel markør for nociceptive sensoriske neuroner 4. TrkA er højt udtrykt i nociceptive neuroner i den tidlige udvikling og medierer NGF-afhængig neuron overlevelse, Axon vækst, arborization og mål innervation 5-9. I TrkA taulacZ mus, er vildtype TrkA gen erstattet af en taulacZ udtryk cassette 10, således at axonal morfologi af formodede TrkA-positive neuroner kan visualiseres ved β-gal (X-gal) farvning 11. Ved hjælp af en heterozygot TrkA taulacZ / WT linje, kan vi undersøge faktorer, der kan regulere eller forstyrre udviklingen af sensoriske afferente fremskrivninger in vivo.
Desuden TrkA-ekspression er fraværende i homozygote TrkA taulacZ / taulacZ mus, som derfor kan anvendes til at vurdere axon vækstfremmende mekanismer i fravær af NGF / TrkA signalering. Da nociceptive neuroner afhænger NGF / TrkA signalering ikke kun for axon vækst, men også for at overleve, vi anvender en anden mus linje, der mangler pro-apoptotiske Bax-genet, til at inhibere apoptose i embryoniske DRG-neuroner, redning dem fra celledød, der ellers observeret i fravær af TrkA signalering. Bax - / - baggrund 12 giver således mulighed for molecular dissektion af signalveje, der specifikt berører Axon vækst 7-9,13-15. I TrkA - / -: Bax - / - mus, DRG-neuroner overlever, men sensorisk afferent innervation i huden er helt afskaffet 14,15. Vi kan selektivt aktivere signalveje for at bestemme deres respektive bidrag til udviklingen af Axon fremskrivninger. Anvendeligheden af denne metode er, at det giver mulighed for vurdering af ændringer i axonale vækst fænotyper, når forskellige genetiske modifikationer er avlet på TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - eller TrkA taulacZ / WT: Bax - / - baggrunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle procedurer er i overensstemmelse med NIH Guide til brug og pleje af forsøgsdyr. Dyret Protokollen blev godkendt af IACUC på Weill Cornell Medical College.
1. Vævspræparat
- Aflive tidsindstillet graviditet hunner ved cervikal dislokation 15. Dissekere embryonale E16 - E18 embryoner fra tidsindstillet graviditet hunner og sted embryoner individuelt i brønde i en 6-brønds skål, fyldt med koldt phosphatbufret saltvand (PBS).
- Skyl embryoner i kold PBS.
- Fjern en lille del af fosterhinde af embryo og sted i en pre-forberedt proteinase K løsning til efterfølgende genotypebestemmelse. Alternativt, hvis fosterhinde er tabt, fjerne en lille del af spidsen af embryo hale og placere den i proteinase K-opløsning
- Poke huller i huden hele vejen rundt om embryo hjælp insekt stifter (mindst 100 pr side).
- Fjern PBS og tilsæt langsomt frisk 2% paraformaldehyd (PFA),pH 7,4, til brønden.
- Ryst forsigtigt i 2 timer ved 4 ° C.
- Skyl embryoner to gange i PBS og opbevares i PBS ved 4 ° C indtil farvning.
2. Genotypebestemmelse
- Nedsænk fostervand membraner eller embryocelle haler i proteinase K blanding ifølge producentens anvisninger.
- Inkuber ved 56 ° C i 10 min.
- Uddrag DNA under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt DNA oprensningskit.
- Tag 0,5 pi af den samlede 200 pi oprensede genomiske DNA-opløsning, kombinere det med 0,5 pi af hver af de genspecifikke sense- og antisense-primere (10 uM), 2 pi dNTP Mix (2.5 mM af dATP, dCTP, dGTP og dTTP) , 0,2 pi Taq-polymerase (5 U / pl) og 2 pi PCR-buffer (10x), der tilsættes H2O til et samlet volumen på 20 pi.
BEMÆRK: Primersekvenser er som følger (tabel 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR fragling længde: 400 basepar (bp).
Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR-fragment længder: vildtype, 304 bp; Bax null, 507 bp.
TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR-fragment længde: 360 bp. - Kør en PCR med følgende program for TrkA: Trin 1: 1 min ved 95 ° C, trin 2: 10 sekunder ved 95 ° C, trin 3: 20 sek ved 68 ° C, trin 4: 30 sek ved 72 ° C. Gentag trin 2 - 4 for 40 cykler.
- For LacZ og Bax, køre en PCR med følgende program: trin 1: 1 min ved 95 ° C, trin 2: 10 sekunder ved 95 ° C, trin 3: 1 min ved 54 ° C, trin 4: 1 min ved 72 ° C, skal du gentage trin 2 - 4 for 35 cykler.
- Run PCR prøver på en 2% agarosegel ved 100 V i 1 x Tris-acetat-EDTA-buffer i 20 minutter med en bane af DNA stigen at vurdere fragment længder.
- Analyser embryoner for tilstedeværelsen af vildtype TrkA, TRKA-tauLacZ og Bax null alleler. De genotyper af eksperimentelle embryoner TrkA taulacZ / WT: Bax - / - og TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - afhængigt af de eksperimentelle spørgsmål. Embryoner der mangler tauLacZ reporter vil være negativ for axonal farvning og kan derfor tjene som negative kontroller at kalibrere farvning proces.
3. Embryo Farvning
- Brug et kommercielt kit til lacZ farvning med nogle ændringer som beskrevet nedenfor i afsnit 3,2-3,8. Her bruger Millipore kit.
- Nedsænk embryoner i puffer A i mindst 1 time ved omrystning ved stuetemperatur.
- Direkte fordybe embryoner i puffer B i mindst 15 minutter ved omrystning ved stuetemperatur.
- Mens embryoner i Buffer A / B, præ-varm Tissue Base opløsning ved 37 ° C. Brug 5 ml Tissue Base opløsning pr embryo.
- Mens embryoner i Buffer A / B, en frisk 5-bromo- 4- chlor- 3- indolyl α-D-galactopyranosid (X-gal) i en koncentration på 40 mg / ml i 100% dimethylsulfoxid (DMSO).
- Fortynd X-gal i forvarmet Tissue baseopløsning med en koncentration på 1 mg / ml, og der tilsættes 5 ml X-gal / Tissue Base blandingen til en glasscintillationshætteglas.
- Overfør embryoner til et glasscintillationshætteglas indeholdende X-gal / Tissue Base blanding. Forsegl låget med parafilm og inkuberes ved 37 ° C natten over, kontrol for tilstedeværelsen af blåsplint.
- Postfix embryoner med frisk 4% PFA, pH 7,4. Ryst forsigtigt i 4 timer ved 4 ° C.
- Skyl embryoner to gange i kold PBS.
4. Tissue Dehydrering og Clearing
- Place embryoner i 50% methanol / 50% PBS blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur, ryster i hætteglas.
- Fortsæt med at dehydrere i 75% methanol / 25% PBS i 30 minutter ved stuetemperatur, ryster i hætteglas.
- Fortsæt med at dehydrere i 90% methanol / 10% PBS i 30 minutter ved stuetemperatur, idet i hætteglas.
- Fortsæt med at dehydrere i 100% methanol i 30 minutter (2x) ved stuetemperatur, ryster i hætteglas.
- Mens embryoner dehydrering, fremstille en 1: 1 (v: v) blanding af benzoyl alkohol og benzoylbenzoat.
BEMÆRK: Benzoyl alkohol og benzoylbenzoat er giftig. - Nedsænk embryoner i 1: 1 (v: v) blanding af 100% methanol: 100% Babb i 15 min. Brug kun glas, fordi Babb vil opløse plastik.
- Fordyb embryoner i 100% Babb til helt klart vævet og at visualisere X-gal farvning i ryddet embryo.
BEMÆRK: Billede så hurtigt som muligt, fordi X-gal plet vil blegne med tiden.
5. Hele Mount Imaging
- Stabiliser embryonet, nedsænket i 100% Babb på passende vinkler for fotografering ved hjælp af metal pincet. Belyse ved hjælp af en kombination af op-lys og under-lys lyskilder.
- Anskaf billeder med et dissektionsmikroskopudstyret med et digitalt kamera. Tag flere lyse felt engagementer på fem på hinanden fokusplaner 0,5 mm fra hinanden langs Z-aksen. Eksponering tider og f-stop kan variere alt efter belysning og kamera specs og skal optimeres til hver opsætning.
- Brug standard billedbehandling software til at behandle overlay billeder og generere fotomontager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De genotyper TrkA WT / taulacZ: Bax - / - og TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - embryoer utvetydigt kan bestemmes ved standard-PCR genotyping (figur 1). X-gal-farvning viser detaljeret perifere axonale dorne subkutant i konventionelt farvede embryoner (figur 2, 3a), og i hele embryoet efter væv clearing (figur 3b, 4).
Vi har avlet TrkA WT / taulacZ: Bax - / - overensstemmelse med mus, der bærer den konstitutivt kinase-aktiverede B-RAF (V600E) mutation (LSL-kaBraf 16) under kontrol af neuron-specifikke nestin promoter 17 til opnåelse LSL- kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - mus. I disse embryoer, der fuldstændig mangler TrkA signalering, morfologien af nociceptor perifere fremspring ikke desto mindre udviklet næsten normalt (figur 4). Denne demonstreresa afgørende funktion for B-RAF signalering i perifert axon vækst og også viser, at overlevelse og axon-vækstfremmende funktioner TrkA signalering kan adskilles, med Bax - / - genetiske baggrund erstatte tabet af TrkA-afhængig overlevelse signalering .
Figur 1: Genotypebestemmelse af de transgene mus Repræsentative agarose gel billeder.. Prøve 1: TrkA WT / taulacZ: Bax WT / -, prøve 2: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, prøve 3: TrkA WT / taulacZ: Bax - / -.
Figur 2: E18.5 TrkA WT / taulacZ mus farvet med X-gal Axon fremskrivninger fra trigeminusganglier i torso og hea.d er vist i en ikke afstemte embryo. Scale bar: 1 mm.
Figur 3:. E18.5 TrkA WT / taulacZ mus farvet med X-gal (A) før og (B) efter clearing med Babb Fremskrivninger fra DRG i midten af torso er vist. Scale bar: 2 mm.
Figur 4: En E16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -:. Nestin-Cre mus embryo farvet med X-gal og ryddet med Babb kaBraf koder for en kinase aktiveret B-RAF kinase protein, B-RAF V600E. Ekspression af KAB-RAF i DRG-neuroner resulterede i fuld længde tæt på normal axon forlængelse i fravær af TrkA signalering. Scale bar: 1 mm. For flere billeder, herunder kontrol, se ref. 15, fig2.
| Primere anvendt til PCR genotyping | ||
| 1 | TrkA | DNA fragment størrelse: 400 bp |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Bax | DNA-fragment størrelse: 304 bp (vildtype), 507 bp (Bax null) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| NeoR | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | DNA-fragment størrelse: 360 bp |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
Tabel 1: Primere anvendt til PCR-genotypebestemmelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovenfor beskrevne X-gal farvningsprocedure af embryonale TrkA taulacZ mus giver mulighed for en hurtig og detaljeret visualisering af langdistance Axon fremskrivninger i ubeskadiget faste foster. På grund af Bax null baggrund disse mus muliggøre sondering af signalering mekanismer, der kan bidrage til både axon vækst og neuronal overlevelse. Parring med transgene eller knockout-mus af interesse muliggør omfattende vurdering af axonale fænotyper og kan tjene som nyttig vejledning for fremtidige eksperimenter for at undersøge Axon vækst signalering på en mere detaljeret måde. En stor udfordring for in vivo Axon undersøgelser vækst er tid til at forberede væv sektioner og vurdere de komplekse fænotyper af voksende axoner der kan blive påvirket på flere måder af et genetisk manipulation. Den TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - line muliggør evaluering af den fulde virkning af et genaf renter på perifer nociceptor Axon udvikling.
Teknikken er begrænset til visualisering af nociceptor axonale baner, der normalt ville udtrykker TrkA i de tidlige udviklingsstadier. Ud over de perifere nociceptorer, kan det være muligt at visualisere sympatiske og basale forhjerne-cholinerge projektioner; men dette ville kræve specifikke optimering af farvningsteknikker
Tissue clearing er et vigtigt skridt i protokollen beskrevet her. Den gør det muligt detaljeret vurdering af dybere liggende fremskrivninger i hel-mount præparater og dermed den potentielle identifikation af forskellige fænotyper. Fluorescerende reportere, såsom TdTomato eller GFP reportere 18,19, kan tilbyde visuel klarhed under visse betingelser, men det er vanskeligt at opnå hel-mount billede, fordi vi har fundet, at i modsætning til X-gal-farvning, fluorescerende signaler fade væsentligt i vævet clearing procedure. Dilfarvning også meget brugt til Axon mærkning 20; dens mangler er, at det ikke selektivt kan mærke en specifik undertype af axoner såsom nociceptor fibre her, og det er vanskeligt fuldt ud at mærke lange baner i periferien.
Sammenfattende kan vi tilbyde en protokol, der bruger en kombination af to genetisk modificerede mus linjer for at tillade rutine visualisering af den fulde dorne af nociceptive axoner i mus embryo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Louis Reichardt for TrkA taulacZ mus og Dr. Annette Markus for indsigtsfuld diskussion og forslag. Dette arbejde blev støttet af startup midler fra Burke Foundation samt Whitehall Foundation forskningsbevilling 2010-08-61, en forskningsbevilling fra Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), giver ZB1-1102-1 fra Christopher & Dana Reeve Foundation, og tilskud 1R01EY022409 og 3R01EY022409-01S1 fra National Eye Institute, til JZ. KJO er en Goldsmith fyr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
