Abstract
A visualização das projeções neuronais de corpo inteiro em embriões é essencial para ganhar uma compreensão de como mamíferos redes neuronais desenvolver. Aqui nós descrevemos um método para rotular in situ um subconjunto do gânglio da raiz dorsal (DRG) projeções axônio para avaliar suas características fenotípicas usando várias linhas de rato geneticamente manipulados. Os neurônios TrkA-positivos são neurônios nociceptores, dedicados à transmissão de sinais de dor. Nós utilizamos uma linha rato TrkA taulacZ para rotular as trajetórias de todos os axônios periféricos TrkA-positivos no embrião intacto mouse. Nós produzir ainda mais a linha TrkA taulacZ sobre um fundo nulo Bax, que essencialmente suprime a apoptose neuronal, a fim de avaliar as questões relacionadas com o crescimento, independentemente de possíveis efeitos das manipulações genéticas na sobrevivência neuronal. Posteriormente, os ratos geneticamente modificados, de interesse são criados com o TrkA TAULACZ / Bax linha nula e está então pronto para o estudo utilizando as técnicas aqui descritas. Esta apresentação inclui informações detalhadas sobre os planos de melhoramento do rato, genotipagem no momento da dissecção, a preparação do tecido, a coloração e de compensação para permitir a visualização de todo o comprimento trajetórias axonal em preparação todo o monte.
Introduction
Estabelecimento de redes neuronais precisas é um processo de desenvolvimento complexo essencial para a funcionalidade do sistema nervoso. Distúrbio neste processo leva à disfunção neuronal que tem sido implicado em doenças neurológicas humanas 1-3. Para estudar os mecanismos moleculares subjacentes de crescimento do axônio e inervação alvo em mamíferos, nós desenvolvemos um protocolo para visualizar as trajetórias axonal de TrkA-expressando neurônios sensoriais usando uma combinação de duas linhas de rato geneticamente modificados.
TrkA é um receptor para o factor de crescimento dos nervos NGF e é um marcador funcional de neurónios sensoriais nociceptivos 4. TrkA é altamente expressa em neurónios nociceptivos durante o desenvolvimento precoce e medeia a sobrevivência de neurónios dependente de NGF, o crescimento axonal, arborização e alvo de inervação 5-9. Em ratinhos TrkA taulacZ, o gene de TrkA tipo selvagem é substituído por uma expressão de c taulacZassette 10, de tal modo que a morfologia axonal de neurónios TrkA-positivos putativos pode ser visualizado por β-gal (X-gal) 11 coloração. Usando uma linha de TrkA taulacZ / WT heterozigótico, pode-se examinar os factores que podem regular ou interferir com o desenvolvimento de projecções aferentes sensoriais in vivo.
Além disso, a expressão de TrkA está ausente em ratinhos homozigóticos TrkA taulacZ / taulacZ, que pode, portanto, ser utilizados para avaliar a promoção do crescimento axonal na ausência de mecanismos de sinalização NGF / TrkA. Uma vez que os neurónios nociceptivos dependem sinalização NGF / TrkA não só para o crescimento axonal, mas também para a sobrevivência, que empregam uma outra linha de ratinhos, a que falta o gene de pró-apoptótica Bax, para inibir a apoptose em neurónios DRG embrionárias, salvando-los de morte celular que é de outra maneira observada na ausência de sinalização TrkA. O Bax - / - fundo 12 permite, assim, para o molecudissecção lar de vias de sinalização que afectam especificamente 7-9,13-15 crescimento axonal. Em TrkA - / -: Bax - / - ratos, neurónios DRG sobreviver, mas inervação aferente sensorial na pele é completamente abolida 14,15. Podemos ativar seletivamente as vias de sinalização para determinar suas respectivas contribuições para o desenvolvimento de projeções axônio. A utilidade deste método é que ele permite a avaliação de mudanças na fenótipos crescimento axonal quando diferentes modificações genéticas são criados para a TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - ou TrkA taulacZ / WT: Bax - / - fundos.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos em conformidade com o Manual do NIH para o uso e cuidados de animais de laboratório. O protocolo animal foi aprovada pelo IACUC no Weill Cornell Medical College.
1. Preparação do Tecido
- Eutanásia fêmeas cronometrado com a gravidez por deslocamento cervical 15. Dissecar embrionárias E16 - E18 embriões de fêmeas cronometrado com a gravidez e embriões lugar individualmente em poços de uma de 6 poços prato, preenchidas com solução salina fosfato tamponada (PBS).
- Enxágüe embriões em PBS frio.
- Retirar uma pequena porção da membrana amniótica do embrião e no lugar de uma solução de proteinase K pré-preparadas para a genotipagem subsequente. Alternativamente, se a membrana amniótica é perdida, remover uma pequena porção da ponta da cauda do embrião e colocá-lo em solução de proteinase K
- Picar furos na pele ao redor do embrião usando pinos de insetos (pelo menos 100 de cada lado).
- Remover PBS e lentamente adicionar fresco 2% paraformaldeído (PFA),pH 7,4, para o bem.
- Agite suavemente durante 2 horas a 4 ° C.
- Lavar embriões duas vezes em PBS e armazenar em PBS a 4 ° C até a coloração.
2. A genotipagem
- Mergulhe membranas amnióticas ou rabos de embriões em proteinase mistura K de acordo com as instruções do fabricante.
- Incubar a 56 ° C durante 10 min.
- Extrai-se o ADN utilizando um kit de purificação de ADN comercialmente disponível.
- Utilizar 0,5 mL do total de 200 uL de solução de ADN genómico purificado, combiná-la com 0,5 ul de cada um dos iniciadores com sentido e anti-sentido específico para o gene (10 uM), 2 ul de dNTP Mix (2,5 mM de dATP, dCTP, dGTP e dTTP) , 0,2 jil de polimerase Taq (5 U / uL) e 2 ul de tampão de PCR (10x), adicionar H 2 O para um volume total de 20 ul.
NOTA: As sequências dos iniciadores são como se segue (Tabela 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR fragmento comprimento: 400 pares de bases (pb).
Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; Comprimentos fragmento de PCR: tipo selvagem, 304 pb; Bax null, 507 pb.
TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR de comprimento de fragmentos: 360 pb. - Executar uma PCR com o seguinte programa para TrkA: passo 1: 1 min a 95 ° C, passo 2: 10 seg a 95 ° C, passo 3: 20 seg a 68 ° C, passo 4: 30 segundos a 72 ° C. Repita os passos 2-4 para 40 ciclos.
- Para LacZ e Bax, executar um PCR com o seguinte programa: passo 1: 1 min a 95 ° C, passo 2: 10 seg a 95 ° C, passo 3: 1 min a 54 ° C, passo 4: 1 min a 72 ° C, repita os passos 2-4 para 35 ciclos.
- Executar amostras de PCR num gel de agarose a 2% a 100 V, em tampão 1 x Tris-acetato-EDTA durante 20 min, com uma pista de escada de ADN para avaliar comprimentos de fragmentos.
- Analise embriões para a presença do tipo selvagem de TrkA, TRKA-tauLacZ e Bax alelos nulos. Os genótipos de embriões experimentais são TrkA taulacZ / WT: Bax - / - e TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, dependendo das perguntas experimentais. Os embriões sem o repórter tauLacZ será negativo para a coloração axonal e pode, por conseguinte, servem como controlos negativos para calibrar o processo de coloração.
3. Embryo Coloração
- Usar um kit comercial para a coloração lacZ com algumas modificações como descrito em baixo nas secções 3,2-3,8. Aqui, use o kit Millipore.
- Imergir embriões em Tampão A durante pelo menos 1 hora, sacudindo suavemente, à temperatura ambiente.
- Imergir directamente embriões em tampão B durante pelo menos 15 min, agitando suavemente à temperatura ambiente.
- Enquanto os embriões são em tampão A / B, pré-solução quente base de tecido a 37 ° C. Utilize 5 ml de solução de base Tissue por embrião.
- Enquanto os embriões são em Tampão A / B, preparar fresco 5-brOmo 4- cloro-3- indolilo α-D-galactopiranósido (X-gal) a uma concentração de 40 mg / ml em 100% de dimetil sulfóxido (DMSO).
- Dilui-se com X-gal para a solução de base de tecido pré-aquecido a uma concentração de 1 mg / ml e adicionam-se 5 ml de X-gal / mistura base de tecido para um frasco de cintilação de vidro.
- Transferir os embriões para um frasco de cintilação de vidro contendo mistura de base de X-gal / Tissue. Selar tampa com Parafilm e incubar a 37 ° C durante a noite, verificando-se a presença de corante azul.
- Postfix com embriões frescos PFA 4%, pH 7.4. Agitar suavemente durante 4 horas a 4 ° C.
- Enxágüe embriões duas vezes em PBS frio.
4. Tissue Desidratação e Clearing
- Colocar em embriões de 50% de metanol / 50% de mistura de PBS durante 30 min à temperatura ambiente, agitando em frascos de vidro.
- Continuar a desidratar em 75% de metanol / 25% de PBS durante 30 min à temperatura ambiente, agitando em frascos de vidro.
- Continuar a desidratar em 90% de metanol / 10% PBS durante 30 min à temperatura ambiente, agitando em frascos de vidro.
- Continuar a desidratar em metanol a 100% durante 30 min (2x), à temperatura ambiente, agitando em frascos de vidro.
- Enquanto os embriões são desidratação, preparar uma mistura 1: 1 (v: v) de uma mistura de álcool de benzoílo e benzoílo benzoato.
NOTA: álcool benzoílo e benzoílo benzoato é tóxico. - Imergir embriões no 1: 1 (v: v) de uma mistura de metanol a 100%: 100% BABB durante 15 min. Usar apenas porque o vidro BABB irá dissolver plástico.
- Mergulhe embriões em 100% BABB para limpar completamente o tecido e visualizar coloração X-gal no embrião desmarcada.
NOTA: A imagem o mais rapidamente possível, porque a mancha X-gal vai desaparecer ao longo do tempo.
5. Monte todo Imagem
- Estabilizar o embrião, imerso em 100% BABB, nos ângulos adequados para fotografia usando uma pinça de metal. Iluminar usando uma combinação de up-luz e sob luz luz fontes.
- Adquirir imagens com um microscópio de dissecaçãoequipado com uma câmera digital. Tire várias exposições a campos brilhantes em cinco planos focais sucessivas 0,5 milímetros de distância ao longo do eixo Z. Os tempos de exposição e f-stops podem variar de acordo com a iluminação e câmera especificações e precisam ser otimizados para cada configuração.
- Use um software de processamento de imagem padrão para processar imagens de sobreposição e gerar fotomontagens.
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Representative Results
Os genótipos de TrkA WT / taulacZ: Bax - / - e TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - embriões pode ser determinada sem ambiguidades por genotipagem de PCR padrão (Figura 1). X-gal de coloração exibe detalhado mandris axonal periféricos por via subcutânea em embriões coradas convencionalmente (Figuras 2, 3A), e em todo o embrião após clearing tecido (Figuras 3b, 4).
Temos produzido a TrkA WT / taulacZ: Bax - / - linha com ratinhos que transportam a B-RAF (V600E) mutação-quinase constitutivamente activada (LSL-kaBraf 16) sob o controlo do promotor de nestina específico para neurónios de 17, para obter LSL- kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - ratos. Nestes embriões, que carecem completamente de sinalização TrkA, a morfologia das projecções periféricas de nociceptores no entanto desenvolveram quase normalmente (Figura 4). Este demonstrarsa função essencial para a sinalização de B-RAF em crescimento axonal periférica, e também mostra que a sobrevivência e crescimento de axónios promover outras funções de sinalização TrkA pode ser separada, com o Bax - / - base genética para substituir a perda de sobrevivência TrkA-dependente de sinalização .
Figura 1: A genotipagem dos ratinhos transgénicos representativos imagens de gel de agarose.. Amostra 1: TrkA WT / taulacZ: Bax WT / -, amostra 2: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, a amostra 3: TrkA WT / taulacZ: Bax - / -.
Figura 2: E18.5 TrkA WT / taulacZ rato coradas com X-gal projeções Axon de gânglios trigeminal no torso e hea.d são mostrados num embrião não clarificado. Barra de escala: de 1 mm.
Figura 3:. E18.5 TrkA WT / taulacZ rato coradas com X-gal (A) antes e (B) depois de limpar com Babb Projeções de DRGs em mid-tronco são mostrados. Barra de escala: 2 mm.
Figura 4: Um E16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -:. Nestin-Cre embrião de rato coradas com X-gal e limpou com BABB kaBraf codifica uma quinase ativada B-RAF proteína quinase, B-RAF V600E. Expressão da KAB-RAF em neurônios do GRD resultou em full-length, perto de extensão axônio normal na ausência de sinalização TrkA. Barra de escala: de 1 mm. Para mais imagens, incluindo controles, ver ref. 15, figura2.
| Os iniciadores de PCR utilizados para a genotipagem | ||
| 1 | TrkA | O tamanho do fragmento de ADN: 400 pb |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Bax | O tamanho do fragmento de DNA: 304 bp (tipo selvagem), 507 bp (Bax null) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| NeoR | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | O tamanho do fragmento de DNA: 360 pb |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
Tabela 1: Os iniciadores utilizados para PCR genotipagem.
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Discussion
O processo de coloração X-gal acima descrito de ratos embrionárias TrkA taulacZ permite a visualização rápida e detalhada de projeções axônio de longa distância no embrião fixa intacta. Por causa do fundo nulo Bax estes ratos permitir a sondagem de mecanismos de sinalização que podem contribuir para o crescimento do axônio e sobrevivência neuronal. O cruzamento com camundongos transgênicos ou knockout de interesse permite uma avaliação abrangente de fenótipos axonal e pode servir como guia útil para futuros experimentos para analisar a sinalização crescimento do axônio de uma forma mais detalhada. Um grande desafio para estudos in vivo de axônios de crescimento é o tempo para preparar o tecido seções e avaliar os fenótipos complexos de axônios em crescimento que podem ser afetados de várias maneiras por qualquer manipulação genética. O TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - linha permite a avaliação de todos os efeitos de um genede juros sobre o desenvolvimento nociceptor axônio periférico.
A técnica é limitada para a visualização de trajectórias axonais nociceptores que normalmente expressam TrkA durante as primeiras fases de desenvolvimento. Além dos nociceptores periféricos, pode ser possível visualizar projecções colinérgicas do prosencéfalo basal simpáticos e; no entanto, isto iria requerer optimização específica de técnicas de coloração
Clearing Tissue é um passo fundamental do protocolo descrito aqui. Ele permite avaliação detalhada das mais profundas projeções encontram-se em preparações todo o monte e, assim, a identificação potencial de fenótipos distintos. Repórteres fluorescentes, tais como TdTomato ou repórteres GFP 18,19, pode oferecer clareza visual, sob certas condições, contudo, é difícil de adquirir imagem de montagem inteira porque verificou-se que em contraste com a coloração com X-gal, os sinais fluorescentes desaparecer substancialmente durante o procedimento de limpeza de tecidos. DiIcoloração também é amplamente utilizada para axónio rotulagem 20; as suas deficiências são que ele não pode etiquetar selectivamente um subtipo específico de axónios, tais como as fibras de nociceptores aqui, e isso é difícil rotular longas trajectórias totalmente na periferia.
Em resumo, que oferecem um protocolo que utiliza uma combinação de duas linhas de ratinhos geneticamente modificados para permitir a visualização de rotina dos mandris completos de axónios nociceptivos no embrião de rato.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Louis Reichardt para os ratos TrkA taulacZ e Dr. Annette Markus para discussão perspicaz e sugestões. Este trabalho foi apoiado por fundos de inicialização da Fundação Burke, bem como Fundação Whitehall bolsa de investigação 2010-08-61, uma bolsa de investigação Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), conceder ZB1-1102-1 do Christopher e Dana Reeve Foundation, e concede 1R01EY022409 e 3R01EY022409-01S1 do National Eye Institute, a JZ. KJo é um companheiro Goldsmith.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
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