Abstract
全长神经元的预测在胚胎的可视化是必须获得的神经网络如何发展哺乳动物的认识。在这里，我们描述的方法原位标记背根神经节（DRG）轴突预测的一个子集，使用多个基因操纵鼠标线，以评估他们的表型特征。所述的TrkA阳性神经元是伤害性感受器神经元，专门用于疼痛信号的传输。我们利用的TrkA taulacZ鼠标线标记所有的TrkA阳性轴突末梢的轨迹在完整的小鼠胚胎。我们进一步繁殖的TrkA taulacZ线到Bax缺无的背景，这基本上废除神经细胞凋亡，以评估的独立地对神经元存活的遗传操作的可能影响生长相关的问题。随后，感兴趣的转基因小鼠繁殖与TrkA的taulACZ / Bax的零线和然后准备用于使用本文所描述的技术的研究。此报告包括解剖，组织准备，染色和结算的时间对小鼠繁殖计划的详细信息，基因分型，以便在整个安装准备全长轴突轨迹可视化。
Introduction
建立精确的神经网络是一个复杂的发育过程中神经系统的功能是必不可少的。干扰在这个过程导致神经元功能障碍已与人类神经系统疾病1-3。研究轴突生长和靶神经支配的哺乳动物的分子机制，我们开发了一个协议，以可视化的TrkA表达感觉神经元使用两种转基因小鼠系的组合的轴突轨迹。
TrkA的是受体对神经生长因子NGF和是伤害性感觉神经元4的功能标记。早期发育过程中的TrkA高度表达在伤害感受神经元，并介导NGF依赖性神经元存活，轴突生长，树枝状和靶神经支配5-9。在的TrkA taulacZ小鼠中，野生型的TrkA基因置换为taulacZ表达式c磁带式10中 ，以使得推定的TrkA阳性神经元的轴突形态可通过β半乳糖苷酶（X-gal的）染色11可视化。使用杂的TrkA taulacZ / WT线，我们可以检查可调节或干扰体内感觉传入预测的发展的因素。
此外，TrkA的表达是不存在于纯合的TrkA taulacZ / taulacZ小鼠，这因此可以用来评估轴突生长促进机制在不存在NGF / TrkA的信令。由于疼痛神经元依赖于NGF / TrkA的信号不仅对轴突的生长，同时也为求生存，我们另外聘请鼠标线，缺乏促凋亡蛋白Bax基因，抑制细胞凋亡在胚胎DRG神经元细胞死亡是另有解救出来在不存在的TrkA信令的观察。的Bax蛋白- / -背景12从而允许molecu信号通路专门影响轴突生长7-9,13-15的LAR解剖。在的TrkA - / - ：Bax蛋白- / -小鼠，DRG神经元存活，但在皮肤感觉传入神经 支配被完全取消14,15。我们可以有选择地激活的信号通路，以确定它们各自的轴突预测的发展作出了贡献。该方法的效用是，它允许改变在轴突生长表型的评估当不同的遗传修饰的繁殖到的TrkA taulacZ / taulacZ：Bax蛋白- / -或TrkA的taulacZ / WT：Bax蛋白- / -背景。
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Protocol
注：所有程序符合美国国立卫生研究院指南实验动物的使用和护理。动物方案得到批准IACUC威尔康乃尔医学院。
1.组织准备
- 颈椎脱位安乐死15定时女性怀孕。解剖胚胎E16 - 从定时怀孕的女性和地点胚胎E18胚胎逐个在6孔培养皿的孔中，填充有冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 在冷PBS冲洗胚胎。
- 在随后的基因分型的预制备的蛋白酶K溶液中取出胚胎和地点的羊膜的一小部分。或者，如果羊膜丢失，除去的胚胎尾巴尖的一小部分，并将其放置在蛋白酶K溶液
- 戳孔进入皮肤四周用昆虫针（至少100每边）的胚胎。
- 删除PBS慢慢补充新鲜2％多聚甲醛（PFA），pH为7.4，向井。
- 轻轻摇动2小时，4℃。
- 在PBS中漂洗两次胚胎并在PBS中储存于4℃直至染色。
2.基因分型
- 根据制造商的说明浸入羊膜或胚胎尾巴在蛋白酶K混合物。
- 孵育在56℃下进行10分钟。
- 使用市售的DNA纯化试剂盒提取DNA。
- 取0.5微升的总200微升纯化的基因组DNA溶液，用0.5微升每个基因特异性义和反义引物（10μM）的，2微升dNTP混合物结合它（2.5毫的dATP，dCTP，dGTP和dTTP的） ，0.2微升Taq聚合酶（5U /微升）和2微升的PCR缓冲液（10倍），加入的H 2 O来的20微升的总体积。
注：引物序列如下（ 见表1）：
TrkA的：TrkA_F：GCG GGC GCC GCC GCG ATG，TrkA_R：GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR FRAG换货长度：400个碱基对（BP）。
Bax蛋白：IN5R：GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG，Ex5F：TGA TCA GAA CCA TCA TG，NeoR：CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR片段长度：野生型，304基点; Bax的空，507基点。
TauLacZ：lacZup：ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA，lacZdown：ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G组; PCR片段长度：360基点。 - 运行的PCR与TrkA的下列程序：步骤1：1分钟95℃，第2步：10秒，在95℃，第3步：20秒68℃，第4步：30秒72℃。 40次4 - 重复步骤2。
- 为的LacZ和Bax，运行的PCR使用以下程序：步骤1：在95℃下1分钟，步骤2：10秒，在95℃，第3步：1分钟在54℃，步骤4：1，在72分钟°C，重复步骤2 - 4 35个循环。
- 上，在100 V在1×Tris-醋酸盐-EDTA缓冲液的DNA梯的泳道2％琼脂糖凝胶进行20分钟运行的PCR样品，以评估片段长度。
- 对于野生型的TrkA，T的存在分析胚胎RKA-tauLacZ和Bax无效等位基因。实验胚胎的基因型是TrkA的taulacZ / WT：Bax蛋白- / -和TrkA的taulacZ / taulacZ：Bax蛋白- / - ，取决于实验的问题。胚胎缺乏tauLacZ记者将负轴突染色，因此可以作为阴性对照来校准染色过程。
3.胚胎染色
- 使用商业套件的lacZ染色在3.2节下面介绍一些修改- 3.8。在这里，用微孔套件。
- 沉浸在缓冲液A胚胎至少1小时，在室温下轻轻摇晃。
- 直接浸入在缓冲液B的胚胎为至少15分钟，在室温下轻轻摇动。
- 而胚胎是在缓冲液A / B中，在37℃下预暖组织中相应的解决方案。使用将5ml每胚胎组织中相应的解决方案。
- 当胚胎在缓冲液A / B，准备新鲜的5-BRomo- 4-氯-3-吲哚基α-D-吡喃半乳糖苷（X-gal的）以40毫克/毫升在100％二甲基亚砜（DMSO）的浓度。
- 稀X-gal的成以1mg / ml的浓度的预热组织基本溶液和再加5毫升X-gal的/组织中相应混合物到玻璃闪烁瓶中。
- 转移的胚胎含有X-gal的/组织中相应混合物的玻璃闪烁管中。密封的盖子封口膜，37℃过夜，检查蓝染色存在。
- Postfix的胚胎与新鲜的4％PFA，pH值7.4。轻轻摇动4小时，4℃。
- 在冷PBS漂洗胚胎两次。
4.组织脱水及结算所
- 为30分钟，在室温下，摇动在玻璃小瓶中发生的胚胎在50％甲醇/ 50％PBS中的混合物。
- 继续在75％甲醇/ 25％PBS中脱水30分钟，在室温下摇动在玻璃小瓶中。
- 继续在90％的脱水甲醇/ 10％的PBS 30分钟，在室温下摇动在玻璃小瓶中。
- 继续在100％甲醇进行脱水30分钟（2次），在室温下摇动在玻璃小瓶中。
- 而胚胎脱水，制备1：1（体积：体积）苯甲酰醇和苯甲酰苯甲酸的混合物。
注：苯甲酰醇和苯甲酰苯甲酸酯是有毒的。 - 沉浸胚胎，在1：1（体积：体积）100％甲醇的混合物：100％BABB 15分钟。只使用玻璃，因为BABB会溶解塑料。
- 胚胎沉浸在100％BABB彻底清除组织和可视化X-gal染色的清除胚胎。
注：尽快，因为X-gal的染色会褪色随着时间的推移图像。
5.全山成像
- 稳定的胚胎，沉浸在100％BABB，在适当的角度，使用摄影金属镊子。照亮使用的上行光并根据光的光源的组合。
- 用解剖显微镜获取图像配备的数码相机。取多个明场曝光于五个连续焦平面相距0.5毫米沿Z轴。曝光时间和光圈值可以根据照明和摄像机的规格变化，并且需要为每个设置进行优化。
- 使用标准的图像处理软件来处理的叠加图像，并生成合成照片。
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Representative Results
TrkA的WT / taulacZ的基因型：Bax蛋白- / -和TrkA的taulacZ / taulacZ：Bax蛋白- / -胚胎可以通过标准PCR基因分型来明确地确定（ 图1）。 X-gal染色显示在常规染色的胚胎（ 图2，图3a）详述周轴突乔木皮下，并在整个组织清除后的胚胎（ 图3b，4）。
我们已经孕育了TrkA的WT / taulacZ：Bax蛋白- / -与下神经元特异性巢子17控制携带组成激酶激活B-RAF（V600E）突变（LSL-kaBraf 16）自驾路线，获得LSL- kaBraf：TrkA的taulacZ / taulacZ：Bax蛋白- / -小鼠。在这些胚胎，这完全缺乏TrkA的信令，伤害感受器圆周突起的形态仍然开发了近正常（ 图4）。这证明对B-RAF的信令在外设轴突生长，并且还SA关键功能显示，存活和轴突生长促进的TrkA信令的功能可以被分离出来，与Bax蛋白- / -遗传背景代替的TrkA的依赖性存活信号的损失。
图1：转基因小鼠的基因分型代表琼脂糖凝胶图像。示例1：TrkA的WT / taulacZ：Bax的WT / - ，样品2：TrkA的taulacZ / taulacZ：Bax蛋白- / - ，样品3：TrkA的WT / taulacZ：Bax蛋白- / - 。
图2：E18.5的TrkA WT / taulacZ小鼠染色用X-gal从三叉神经节轴突突起在躯干和HEA。d的显示在一个未清除的胚胎。比例尺：1毫米。
图3：前E18.5 TrkA的WT / taulacZ鼠标染色用X-gal（A）及（B）与BABB从病种付费中旬躯干预测结算后显示。比例尺：2毫米。
图4：一个E16.5 LSL-kaBraf：TrkA的taulacZ / taulacZ：Bax蛋白- / - ：巢蛋白的Cre小鼠胚胎染色用X-gal和清除与BABB kaBraf编码激酶活化的B-Raf激酶蛋白B-RAF V600E。 KAB-RAF的DRG神经元中的表达导致了全长，接近正常的轴突延长在没有TrkA的信令。比例尺：1毫米。欲了解更多的图像，包括控制，见文献。 15， 图2。
| 用于PCR的基因分型的引物 | ||
| 1 | TrkA的 | DNA片段大小：400基点 |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Bax基因 | DNA片段大小：304 bp的（野生型），507基点（BAX空） |
| IN5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| NeoR | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | DNA片段大小：360基点 |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA摹 | |
表1：用于PCR的基因分型的引物。
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Discussion
胚胎的TrkA taulacZ小鼠的上述X-gal染色过程允许长距离轴突突起，在完好的固定胚胎的快速和详细可视化。因为Bax缺无背景这些小鼠允许信令可能有助于既轴突生长和神经元存活机制的探测。有兴趣的转基因或基因敲除小鼠交配允许轴突表型的综合评估，可以服务于未来的实验作为有用的指导，研究轴突生长的信号更详细的方式。在体内轴突生长研究的一个主要挑战是准备组织一次段和评估生长轴突可能受影响的多种方式通过任何一项遗传操作的复杂的表型。该TrkA的taulacZ / taulacZ：Bax蛋白- / -行使一个基因的全面影响评估对周围伤害感受器轴突发展的兴趣。
该技术是仅限于伤害感受器轴突轨迹，在早期发育阶段通常会表达TrkA的可视化。除了外周伤害感受器，它可能显现交感神经和基底前脑胆碱能预测;然而这将需要的染色技术特定优化
组织清算是这里所描述的协议的关键一步。它能够在全安装的准备更深躺在预测，因而不同的表型的潜在鉴定详细评估。荧光报告，如TdTomato或GFP的记者18,19，可以提供在特定条件下的视觉清晰度，然而，很难获得整个贴装图像，因为我们已经发现，在相对 于在X-gal染色，荧光信号期间淡出基本上组织清算程序。 DiI标记染色也被广泛用于轴突标记20;其缺点是，它不能选择性地标记轴突的特定亚型，如伤害感受器纤维这里，并且难以在周边以充分标记长轨迹。
总之，我们提供了一个使用两个转基因小鼠系的组合，以允许在小鼠胚胎痛觉神经轴突的充分乔木的常规可视化的协议。
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Acknowledgments
笔者想感谢路易斯·雷查德博士为TrkA的taulacZ小鼠和安妮特·马库斯博士有见地的讨论和建议。这项工作是从伯克基金会以及白厅基金研究资助2010-08-61，从翅膀生命基金会（WFL-US-028/14）研究经费支持的启动资金，从授予ZB1-1102-1克里斯托弗＆达娜里夫基金会和赠款1R01EY022409和3R01EY022409-01S1从国家眼科研究所，为JZ。 KJO是史密斯的家伙。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
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