Abstract
De visualisatie van volledige lengte neuronale uitsteeksels in embryo is essentieel voor een begrip van hoe zoogdieren neuronale netwerken ontwikkelen krijgen. Hier beschrijven we een methode om te labelen in situ een subset van de dorsale wortel ganglion (DRG) axon projecties om hun fenotypische kenmerken te beoordelen met behulp van verschillende genetisch gemanipuleerde muis lijnen. De TrkA-positieve neuronen zijn nociceptorneuronen, gewijd aan de overdracht van pijnsignalen. We maken gebruik van een TrkA- taulacZ muis lijn naar de trajecten van alle TrkA-positieve perifere axonen de etikettering in de intacte muis embryo. We de TrkA taulacZ lijn op een Bax null achtergrond, die hoofdzakelijk opheft neuronale apoptose verder kweken, om groei vragen onafhankelijk van mogelijke effecten van genetische manipulaties op neuronale overleving te bepalen. Vervolgens genetisch gemodificeerde muizen die van belang zijn gefokt met de TrkA TaulACZ / Bax nul lijn en zijn dan klaar voor studie met behulp van de hierin beschreven technieken. Deze presentatie bevat gedetailleerde informatie over muis kweekplannen, genotypering ten tijde van dissectie, weefselbereiding, kleuring en opheldering mogelijk te maken visualisatie van volledige lengte axonale trajecten geheel-mount preparaat.
Introduction
Vaststelling van nauwkeurige neuronale netwerken is een complex ontwikkelingsproces essentieel voor de werking van het zenuwstelsel. Verstoring van dit proces leidt tot neuronale disfunctie die is betrokken bij humane neurologische aandoeningen 1-3. Om de onderliggende moleculaire mechanismen van axon groei en target innervatie bij zoogdieren bestuderen, hebben we een protocol om de axonale trajecten van TrkA tot expressie sensorische neuronen met een combinatie van twee genetisch gemodificeerde muizenlijnen visualiseren ontwikkeld.
TrkA is een receptor voor zenuwgroeifactor NGF en een functionele merker van nociceptieve sensorische neuronen 4. TrkA is sterk uitgedrukt in nociceptieve neuronen tijdens de vroege ontwikkeling en bemiddelt NGF-afhankelijke neuron overleving, axon groei, arborization en target innervatie 5-9. In TrkA taulacZ muizen, wordt het wild-type TrkA-gen vervangen door een taulacZ uitdrukking cassette 10, zodanig dat de axonale morfologie vermeende TrkA-positieve neuronen kunnen worden gevisualiseerd door β-gal (X-gal) kleuring 11. Met een heterozygote TrkA taulacZ / WT lijn, kunnen we factoren die kunnen reguleren of interfereren met de ontwikkeling van sensorische afferente projecties in vivo onderzocht.
Bovendien TrkA expressie afwezig is in homozygote TrkA taulacZ / taulacZ muizen, die dus kunnen worden gebruikt om de axon groei bevorderende mechanismen in de afwezigheid van NGF / TrkA signalering beoordelen. Aangezien nociceptieve neuronen afhankelijk NGF / TrkA signalering niet alleen axon groei, maar ook om te overleven, gebruiken we een muis lijn, zonder de pro-apoptotische Bax gen apoptose remmen embryonale DRG neuronen te redden van celdood die anders is waargenomen in de afwezigheid van TrkA signalering. De Bax - / - achtergrond 12 zorgt daarmee voor de molecuLAR dissectie van signaalwegen die specifiek van invloed zijn axongroei 7-9,13-15. In TrkA- - / -: Bax - / - muizen, DRG neuronen overleven, maar sensorische afferente innervatie in de huid wordt volledig afgeschaft 14,15. We kunnen selectief activeren signaalwegen hun respectieve bijdragen aan de ontwikkeling van axon projecties te bepalen. De bruikbaarheid van deze methode is dat het de beoordeling van veranderingen in axonale groei fenotypes wanneer verschillende genetische modificaties worden gekweekt op de TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - of TrkA taulacZ / WT: Bax - / - achtergronden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle procedures voldoen aan de NIH Gids voor het gebruik en onderhoud van proefdieren. Het dier protocol werd goedgekeurd door de IACUC in het Weill Cornell Medical College.
1. Tissue Voorbereiding
- Euthanaseren getimede-zwangerschap vrouwtjes door cervicale dislocatie 15. Ontleden embryonale E16 - E18 embryo's van getimede zwangerschap vrouwen en plaats embryo afzonderlijk in de putjes van een 6-wells schaal, gevuld met koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Spoel embryo's in koude PBS.
- Verwijderen van een klein deel van het amniotische membraan van het embryo en in een voorbereide proteinase K oplossing voor daaropvolgende genotypering. Indien daarentegen het amniotische membraan verloren gaat, verwijdert een klein deel van het uiteinde van de embryo staart en plaats deze in proteinase K oplossing
- Por gaten in de huid rondom het embryo met insect pennen (tenminste 100 per zijde).
- Verwijder PBS en voeg langzaam verse 2% paraformaldehyde (PFA),pH 7,4, om de put.
- Schud gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Spoel embryo tweemaal in PBS en opgeslagen in PBS bij 4 ° C tot kleuring.
2. Genotyping
- Dompel vliezen of embryo staarten in proteinase K mengsel volgens de instructies van de fabrikant.
- Incubeer bij 56 ° C gedurende 10 min.
- Extract DNA met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA-zuivering kit.
- Neem 0.5 ul van de totale 200 ul gezuiverd genomisch DNA-oplossing, combineren met 0,5 pi van elk van de gen-specifieke sense en antisense primers (10 uM), 2 pl dNTP mix (2,5 mM van dATP, dCTP, dGTP en dTTP) 0,2 pl Taq polymerase (5 U / pl) en 2 pi PCR buffer (10x), voeg H2O tot een totaal volume van 20 pl.
OPMERKING: Primer sequenties zijn als volgt (tabel 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR fragment lengte: 400 basenparen (bp).
Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR-fragment lengtes: wild-type, 304 bp; Bax null, 507 bp.
TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR-fragment lengte: 360 bp. - Voer een PCR met het volgende programma TrkA: stap 1: 1 min bij 95 ° C, stap 2: 10 s bij 95 ° C, stap 3: 20 s bij 68 ° C, stap 4: 30 s bij 72 ° C. Herhaal de stappen 2-4 voor 40 cycli.
- Voor LacZ en Bax, uitvoeren van een PCR met het volgende programma: stap 1: 1 min bij 95 ° C, stap 2: 10 s bij 95 ° C, stap 3: 1 min bij 54 ° C, stap 4: 1 min bij 72 ° C, herhaalt u de stappen 2-4 voor 35 cycli.
- Run PCR monsters op een 2% agarosegel bij 100 V in 1x Tris-acetaat-EDTA-buffer gedurende 20 min met een rijstrook DNA ladder fragmentlengten beoordelen.
- Analyseer embryo's op de aanwezigheid van wildtype TrkA, TRKA-tauLacZ en Bax null allelen. De genotypen van experimentele embryo's TrkA taulacZ / WT: Bax - / - en TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - afhankelijk van de experimentele vragen. Embryo's die niet over de tauLacZ reporter zal negatief voor axonale vlekken en kan daarom dienen als negatieve controles aan de kleuring proces te kalibreren.
3. Embryo kleuring
- Gebruik een commerciële kit voor lacZ kleuring met enige modificaties zoals hieronder beschreven in secties 3,2-3,8. Hier, gebruik maken van de Millipore kit.
- Dompel embryo in buffer A gedurende ten minste 1 uur zachtjes schudden bij kamertemperatuur.
- Dompel embryo in buffer B gedurende 15 min, zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Terwijl embryo's in buffer A / B, voorverwarmen Tissue Base oplossing bij 37 ° C. Gebruik 5 ml Tissue Base oplossing per embryo.
- Terwijl embryo's zijn in buffer A / B, voor te bereiden verse 5-bromo- 4- chloor-3- indolyl α-D-galactopyranoside (X-gal) in een concentratie van 40 mg / ml in 100% dimethylsulfoxide (DMSO).
- Verdun X-gal in de voorverwarmde Tissue Base oplossing bij een concentratie van 1 mg / ml en voeg 5 ml X-gal / Tissue basismengsel een glazen scintillatieflesje.
- Transfer embryo een glazen scintillatieflesje met X-gal / Tissue basismengsel. Verbinding deksel met Parafilm en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende de nacht, het controleren op aanwezigheid van blauwe vlekken.
- Postfix embryo's met verse 4% PFA, pH 7,4. Schud gedurende 4 uur bij 4 ° C.
- Spoel embryo tweemaal met koud PBS.
4. Tissue Uitdroging en Clearing
- Plaats embryo in 50% methanol / 50% PBS mengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur schudden in de glazen flesjes.
- Blijf drogen in 75% methanol / 25% PBS gedurende 30 min bij kamertemperatuur schudden in glazen flesjes.
- Blijven uitdrogen in 90% methanol / 10% PBS gedurende 30 min bij kamertemperatuur schudden in glazen flesjes.
- Verder uitdrogen in 100% methanol gedurende 30 min (2x) bij kamertemperatuur schudden in glazen flesjes.
- Terwijl embryo's dehydrateren, stelt een 1: 1 (v: v) mengsel van benzoyl alcohol en benzoylbenzoaat.
OPMERKING: Benzoyl alcohol en benzoylbenzoaat giftig. - Dompel embryo in het 1: 1 (v: v) mengsel van 100% methanol: 100% BABB gedurende 15 min. Gebruik glas alleen omdat de BABB plastic zal oplossen.
- Dompel embryo's in 100% BABB om helemaal duidelijk het weefsel en X-gal kleuring te visualiseren in de ontruimde embryo.
OPMERKING: Beeld spoedig mogelijk omdat de X-gal kleuring vervagen in de tijd.
5. Hele Mount Imaging
- Stabiliseren van het embryo, ondergedompeld in 100% BABB, op de juiste hoeken voor fotografie met behulp van metalen tang. Verlichten met behulp van een combinatie van up-light en onder-licht lichtbronnen.
- Verwerven van beelden met een dissectiemicroscoopuitgerust met een digitale camera. Neem meerdere helder veld blootstellingen op vijf opeenvolgende brandpuntsvlakken 0,5 mm van elkaar langs de Z-as. De belichtingstijden en f-stops kunnen variëren afhankelijk van verlichting en camera specs en moeten worden geoptimaliseerd voor elke setup.
- Gebruik standaard beeldverwerking software om overlay-afbeeldingen te verwerken en het genereren van fotomontages.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De genotypen van TrkA WT / taulacZ: Bax - / - en TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - embryo's kan worden vastgesteld door standaard PCR genotypering (figuur 1). X-gal kleuring toont gedetailleerde perifere axonale assen subcutaan conventioneel gekleurde embryo's (figuren 2, 3a) en in de gehele embryo na weefsel clearing (figuren 3b, 4).
We hebben gefokt de TrkA WT / taulacZ: Bax - / - overeenkomstig muizen die de constitutief-kinase geactiveerde B-RAF (V600E) mutatie (LSL-kaBraf 16) onder besturing van de neuron-specifieke promoter nestine 17 verkrijgen LSL- kaBraf: TrkA- taulacZ / taulacZ: Bax - / - muizen. In deze embryo, die volledig ontbreekt TrkA signalering, de morfologie van perifere nociceptoren uitsteeksels echter ontwikkeld bijna normaal (Figuur 4). Deze tonensa cruciale functie voor B-RAF signalering in perifere axon groei, en toont ook dat de overleving en axonen groeibevorderende functies van TrkA signalering kan worden gescheiden, met het Bax - / - genetische achtergrond vervanging van het verlies van TrkA-afhankelijke overleving signalering .
Figuur 1: Genotypering van de transgene muizen vertegenwoordiger agarosegel afbeeldingen.. Voorbeeld 1: TrkA- WT / taulacZ: Bax WT / -, monster 2: TrkA- taulacZ / taulacZ: Bax - / -, monster 3: TrkA- WT / taulacZ: Bax - / -.
Figuur 2: E18.5 TrkA- WT / taulacZ muis gekleurd met X-gal Axon projecties van trigeminus ganglia in de romp en hea.d worden getoond in een niet-afgehandelde embryo. Schaal bar: 1 mm.
Figuur 3:. E18.5 TrkA- WT / taulacZ muis gekleurd met X-gal (A) voor en (B) na het wissen met BABB Projecties van DRG's in het midden van de romp zijn getoond. Schaalbalk: 2 mm.
Figuur 4: Een E16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -:. Nestin-Cre muis embryo gekleurd met X-gal en schraapte met BABB kaBraf codeert voor een kinase geactiveerde B-RAF-kinase-eiwit, B-RAF V600E. Expressie van Kab-RAF in DRG neuronen resulteerde in lengte, dicht bij de normale axon verlenging afwezigheid van TrkA signalering. Schaal bar: 1 mm. Voor meer foto's met inbegrip van controles, zie ref. 15 Figuur2.
| Primers gebruikt voor PCR genotypering | ||
| 1 | TrkA | DNA-fragment grootte: 400 bp |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Bax | DNA-fragment grootte: 304 bp (wild type), 507 bp (Bax null) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| NeoR | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | DNA-fragment grootte: 360 bp |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
Tabel 1: Primers gebruikt voor PCR genotypering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierboven beschreven X-gal kleuring van embryonale TrkA taulacZ muizen zorgt voor een snelle en nauwkeurige visualisaties van interlokale axon projecties in het intacte embryo vastgesteld. Door de Bax nul achtergrond deze muizen oog op het aftasten van signalering mechanismen die kunnen bijdragen aan zowel axon groei en neuronale overleving. Paring met transgene of knockout muizen interessant maakt voor een uitgebreide evaluatie van de axonale fenotypes en kan als nuttige leidraad voor toekomstige experimenten dienen om axongroei signalering onderzoeken in een meer gedetailleerde manier. Een grote uitdaging voor in vivo axongroei studies is de tijd om weefsel te bereiden secties en evalueren van de complexe fenotypen van groeiende axonen die kan worden beïnvloed op verschillende manieren één genetische manipulatie. De TrkA- taulacZ / taulacZ: Bax - / - Online maakt evaluatie van de volledige effecten van een genvan de rente op perifere nociceptor axon ontwikkeling.
De techniek is beperkt tot visualisatie van nociceptoren axonale trajecten die normaal tot expressie TrkA tijdens de vroege ontwikkelingsstadia. Naast de perifere nociceptoren, kan het mogelijk zijn om sympathische en basale voorhersenen cholinerge projecties visualiseren; maar zou een specifieke optimalisatie van kleuring technieken vereisen
Tissue clearing is een belangrijke stap van de hier beschreven protocol. Het maakt gedetailleerde beoordeling van dieper liggende projecties geheel-mount voorbereidingen en daarmee de potentiële identificatie van verschillende fenotypes. Fluorescerende reporters, zoals TdTomato of GFP reporters 18,19 kunnen visuele helderheid onder bepaalde omstandigheden bieden, maar is het moeilijk om het gehele onderstel verkrijgen omdat we hebben gevonden dat in tegenstelling tot de X-gal kleuring, fluorescentiesignalen vervagen hoofdzaak in het weefsel clearing procedure. Diikleuring wordt ook veel gebruikt axon etiketteren 20; de tekortkomingen ervan dat het een specifiek subtype van axonen niet selectief labelen zoals de nociceptoren vezels hier, en het is moeilijk om lange trajecten volledig etikettering in de periferie.
Samengevat, hebben we een protocol dat een combinatie van twee genetisch gemodificeerde muis lijnen gebruikt om routinematige visualisatie van de volledige cilinders van nociceptieve neuronen in het muizenembryo mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr Louis Reichardt bedanken voor de TrkA taulacZ muizen en Dr. Annette Markus voor inzichtelijke discussie en suggesties. Dit werk werd ondersteund door het opstarten van fondsen van de Burke Stichting en Whitehall Foundation onderzoeksbeurs 2010-08-61, een onderzoeksbeurs van Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), verlenen ZB1-1102-1 uit de Christopher & Dana Reeve Foundation, en subsidies 1R01EY022409 en 3R01EY022409-01S1 van het National Eye Institute, om JZ. KJO is een Goldsmith collega.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
