Abstract
भ्रूण में पूर्ण लंबाई न्यूरोनल अनुमानों के दृश्य neuronal नेटवर्क का विकास कैसे स्तनधारी की समझ हासिल करने के लिए आवश्यक है। यहाँ हम बगल में कई आनुवंशिक रूप से चालाकी से माउस लाइनों का उपयोग कर अपने प्ररूपी विशेषताओं का आकलन करने के लिए पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (DRG) अक्षतंतु अनुमानों के एक सबसेट लेबल करने के लिए एक विधि का वर्णन। TrkA पॉजिटिव न्यूरॉन्स दर्द संकेतों के प्रसारण के लिए समर्पित nociceptor न्यूरॉन्स, कर रहे हैं। हम बरकरार माउस भ्रूण में सभी TrkA पॉजिटिव परिधीय axons की trajectories के लेबल करने के लिए एक TrkA taulacZ माउस लाइन का उपयोग। हम आगे के लिए स्वतंत्र रूप न्यूरोनल अस्तित्व पर आनुवंशिक जोड़तोड़ के संभावित प्रभावों के विकास से संबंधित सवालों का आकलन करने के क्रम में, अनिवार्य रूप से न्यूरोनल apoptosis को समाप्त करता है, जो एक Bax अशक्त पृष्ठभूमि, पर TrkA taulacZ लाइन नस्ल। बाद में, ब्याज की आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों TrkA taul के साथ पैदा कर रहे हैंacZ / Bax अशक्त लाइन और फिर इस के साथ साथ वर्णित तकनीकों का उपयोग करते हुए अध्ययन के लिए तैयार कर रहे हैं। इस प्रस्तुति पूरे माउंट तैयारी में पूर्ण लंबाई axonal trajectories के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए विच्छेदन, ऊतक तैयारी, धुंधला और समाशोधन के समय में विस्तृत माउस प्रजनन योजनाओं के बारे में जानकारी, जीनोटाइपिंग भी शामिल है।
Introduction
सटीक neuronal नेटवर्क की स्थापना के तंत्रिका तंत्र की कार्यक्षमता के लिए आवश्यक एक जटिल विकास की प्रक्रिया है। इस प्रक्रिया में अशांति मानव मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 1-3 में फंसा दिया गया है जो न्यूरोनल में शिथिलता की ओर जाता है। स्तनधारियों में अक्षतंतु विकास और लक्ष्य स्फूर्तिदान की अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए, हम दो आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों के संयोजन का उपयोग संवेदी न्यूरॉन्स TrkA व्यक्त की axonal trajectories कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है।
TrkA तंत्रिका वृद्धि कारक NGF के लिए एक रिसेप्टर है और nociceptive संवेदी न्यूरॉन्स 4 के एक कार्यात्मक मार्कर है। TrkA अत्यधिक जल्दी विकास के दौरान nociceptive न्यूरॉन्स में व्यक्त किया और NGF निर्भर न्यूरॉन अस्तित्व, अक्षतंतु विकास, द्रुमायण और लक्ष्य स्फूर्तिदान 5-9 मध्यस्थता कर रहा है। TrkA taulacZ चूहों में, जंगली प्रकार TrkA जीन एक taulacZ अभिव्यक्ति सी द्वारा बदल दिया हैख्यात TrkA पॉजिटिव न्यूरॉन्स की axonal आकृति विज्ञान 11 धुंधला β-लड़की (एक्स-लड़की) द्वारा देखे जा सकते हैं कि इस तरह के assette 10,। एक विषमयुग्मजी TrkA taulacZ / गुम्मट लाइन का उपयोग करना, हम विनियमित या विवो में संवेदी अभिवाही अनुमानों के विकास के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि कारकों की जांच कर सकते हैं।
इसके अलावा, TrkA अभिव्यक्ति इसलिए NGF / TrkA संकेतन के अभाव में तंत्र को बढ़ावा देने के अक्षतंतु विकास का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो समयुग्मक TrkA taulacZ / taulacZ चूहों में अनुपस्थित है। Nociceptive न्यूरॉन्स NGF / TrkA न केवल अक्षतंतु विकास के लिए संकेत पर निर्भर करती है के बाद से, लेकिन यह भी अस्तित्व के लिए, हम अन्यथा यह है कि कोशिका मृत्यु से उन्हें बचाव, भ्रूण DRG न्यूरॉन्स में apoptosis को बाधित करने के लिए, समर्थक apoptotic Bax जीन की कमी, एक और माउस लाइन को रोजगार TrkA संकेतन के अभाव में मनाया। Bax - / - पृष्ठभूमि 12 इस प्रकार molecu के लिए अनुमति देता हैविशेष रूप से अक्षतंतु विकास 7-9,13-15 को प्रभावित करने वाले रास्ते संकेतन के LAR विच्छेदन। TrkA में - / -: Bax - / - चूहों, DRG न्यूरॉन्स जीवित है, लेकिन त्वचा में संवेदी अभिवाही तंत्रिका वितरण पूरी तरह से 14,15 को समाप्त कर दिया गया है। हम चुनिंदा अक्षतंतु अनुमानों के विकास के लिए उनके संबंधित योगदान निर्धारित करने के लिए रास्ते संकेतन सक्रिय कर सकते हैं। इस पद्धति की उपयोगिता विभिन्न आनुवंशिक संशोधनों TrkA taulacZ / taulacZ पर पैदा कर रहे हैं जब यह axonal विकास phenotypes में परिवर्तन का आकलन है कि अनुमति देता है: Bax - / - या TrkA taulacZ / गुम्मट: Bax - / - पृष्ठभूमि।
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Protocol
नोट: सभी प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग और देखभाल के लिए एनआईएच गाइड के साथ पालन। पशु प्रोटोकॉल वेल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज में IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. ऊतक तैयारी
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था 15 से समय-गर्भावस्था महिलाओं euthanize। व्यक्तिगत रूप से ठंड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ भरा एक 6 अच्छी तरह से पकवान के कुओं में समय-गर्भावस्था महिलाओं और जगह भ्रूण से E18 भ्रूण - भ्रूण E16 काटना।
- ठंड पीबीएस में भ्रूण कुल्ला।
- बाद में जीनोटाइपिंग के लिए एक पूर्व तैयार proteinase कश्मीर के समाधान में भ्रूण और जगह की एमनियोटिक झिल्ली का एक छोटा सा भाग निकालें। एमनियोटिक झिल्ली को खो दिया है, तो वैकल्पिक रूप से, भ्रूण पूंछ की नोक के एक छोटे से हिस्से को हटा दें और proteinase कश्मीर के समाधान में जगह
- सभी कीट पिन (पक्ष के अनुसार कम से कम 100) का उपयोग भ्रूण के आसपास की त्वचा में छेद प्रहार।
- (पीएफए) ताजा 2% paraformaldehyde जोड़ने धीरे धीरे पीबीएस निकालें औरअच्छी तरह से करने के लिए 7.4 पीएच,।
- धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए हिला।
- पीबीएस में दो बार भ्रूण कुल्ला और धुंधला तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में दुकान।
2. जीनोटाइपिंग
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार proteinase कश्मीर के मिश्रण में एमनियोटिक झिल्ली या भ्रूण पूंछ विसर्जित कर दिया।
- 10 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए शुद्धि किट का उपयोग डीएनए निकालने।
- जीन विशिष्ट भावना और एंटी-सेन्स प्राइमरों (10 माइक्रोन) में से प्रत्येक के 0.5 μl, 2 μl dNTP मिक्स के साथ गठबंधन, जीनोमिक डीएनए समाधान शुद्ध कुल 200 μl के 0.5 μl लो (dATP के 2.5 मिमी, dCTP, dGTP और dTTP) 0.2 μl Taq पोलीमरेज़ (5 यू / μl) और 2 μl पीसीआर बफर (10x), 20 μl की कुल मात्रा के लिए एच 2 हे जोड़ें।
नोट: प्राइमर दृश्यों इस प्रकार हैं (तालिका 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC जीसीसी जीसीसी GCG ATG, TrkA_R: GAA ने जीसीसी जीसीसी टी जी सी GCG GCT CTG सीसीए GGG टीजी; पीसीआर fragजाहिर लंबाई: 400 basepairs (बीपी)।
Bax: In5R: GTT GAC कैग AGT GGC GTA सीजी, Ex5F: टीजीए टीसीए GAA ने सीसीए टीसीए टीजी, NeoR: CCG सीटीटी सीसीए टीटीजी सीटीसी एजीसी सीजी; पीसीआर टुकड़ा लंबाई: जंगली प्रकार, 304 बी पी; Bax अशक्त, 507 बीपी।
TauLacZ: lacZup: एसीए ACG टीसीजी टीजीए GTG GGA एएए, lacZdown: एटीसी एएसी एटीटी एएए टीजीटी भूमिकाः सीजीए जी; पीसीआर टुकड़ा लंबाई: 360 बीपी। - TrkA के लिए निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ एक पीसीआर चलाएँ: चरण 1: 1 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस, चरण 2 पर: 30 सेकंड में 72 डिग्री सेल्सियस: 68 डिग्री सेल्सियस, चरण 4 में 20 सेकंड: 95 डिग्री सेल्सियस, चरण 3 में 10 सेकंड। 40 चक्र के लिए 4 - दोहराएँ चरण 2।
- LacZ और Bax के लिए, निम्न कार्यक्रम के साथ एक पीसीआर चलाने: चरण 1: 1 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस पर, चरण 2: 10 सेकंड में 95 डिग्री सेल्सियस, कदम पर 3: 1 मिनट 54 डिग्री सेल्सियस, कदम पर 4: 72 पर 1 मिनट 35 चक्र के लिए 4 - डिग्री सेल्सियस, दोहराने 2 दोहराएँ।
- डीएनए सीढ़ी के एक लेन के साथ 20 मिनट के लिए 1x Tris- एसीटेट-EDTA के बफर में 100 वी पर एक 2% agarose जेल पर भागो पीसीआर नमूने टुकड़ा लंबाई का आकलन करने के लिए।
- जंगली प्रकार TrkA, टी की उपस्थिति के लिए भ्रूण का विश्लेषण करेंRKA-tauLacZ और Bax अशक्त alleles के। Bax - / -, प्रयोगात्मक सवालों पर निर्भर करता है: - - / और TrkA taulacZ / taulacZ Bax: प्रयोगात्मक भ्रूण के जीनोटाइप TrkA taulacZ / गुम्मट हैं। TauLacZ संवाददाता कमी भ्रूण axonal धुंधला के लिए नकारात्मक हो जाएगा और इसलिए धुंधला प्रक्रिया जांच करने के लिए के रूप में नकारात्मक नियंत्रण सेवा कर सकते हैं।
3. भ्रूण धुंधला
- 3.8 - वर्गों 3.2 में नीचे वर्णित के रूप में कुछ संशोधनों के साथ lacZ धुंधला के लिए एक वाणिज्यिक किट का प्रयोग करें। इधर, Millipore किट का उपयोग करें।
- कमरे के तापमान पर धीरे मिलाते हुए, कम से कम 1 घंटे के लिए बफर में भ्रूण विसर्जित कर दिया।
- सीधे कमरे के तापमान पर धीरे मिलाते हुए, कम से कम 15 मिनट के लिए बफर बी में भ्रूण विसर्जित कर दिया।
- भ्रूण बफर ए / बी, 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म ऊतक आधार समाधान में हैं। भ्रूण प्रति ऊतक आधार समाधान के 5 मिलीलीटर का प्रयोग करें।
- भ्रूण बफर ए / बी में हैं, ताजा 5-BR को तैयारomo- 100% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में 40 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में 3 indolyl α-डी-galactopyranoside (एक्स-लड़की) 4- chloro-।
- 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में पूर्व गर्म ऊतक आधार समाधान में एक्स-लड़की पतला और एक गिलास जगमगाहट शीशी के लिए एक्स-लड़की / ऊतक बेस मिश्रण के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
- एक्स-लड़की / ऊतक बेस मिश्रण युक्त एक गिलास जगमगाहट शीशी भ्रूण स्थानांतरण। Parafilm के साथ ढक्कन सील और नीले रंग के दाग की उपस्थिति के लिए जाँच, रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- ताजा 4% पीएफए, पीएच 7.4 के साथ पोस्टफिक्स भ्रूण। धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर चार घंटे के लिए हिला।
- ठंड पीबीएस में दो बार भ्रूण कुल्ला।
4. ऊतक निर्जलीकरण और क्लियरिंग
- कांच की शीशियों में मिलाते हुए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 50% मेथनॉल / 50% पीबीएस मिश्रण में रखें भ्रूण।
- कांच की शीशियों में मिलाते हुए, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 75% मेथनॉल / 25% पीबीएस में निर्जलीकरण के लिए आगे बढ़ें।
- 90% में निर्जलीकरण के लिए आगे बढ़ें मेथनॉल / 10% पीकांच की शीशियों में मिलाते हुए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए बी एस।
- कांच की शीशियों में मिलाते हुए, कमरे के तापमान पर 30 मिनट (2x) के लिए 100% मेथनॉल में निर्जलीकरण के लिए आगे बढ़ें।
- 1 (वी: V) benzoyl शराब और benzoyl बेंजोएट का मिश्रण भ्रूण dehydrating कर रहे हैं, एक एक तैयार करते हैं।
नोट: Benzoyl शराब और benzoyl बेंजोएट विषैला होता है। - 1: 1 में भ्रूण विसर्जित (V: वी) 100% मेथनॉल के मिश्रण: 15 मिनट के लिए 100% Babb। Babb प्लास्टिक भंग होगा क्योंकि केवल कांच का उपयोग करें।
- करने के लिए पूरी तरह से स्पष्ट ऊतक 100% Babb में भ्रूण को विसर्जित कर दिया और मंजूरी दे दी भ्रूण में एक्स-लड़की धुंधला कल्पना करने के लिए।
नोट: जितनी जल्दी हो सके एक्स-लड़की दाग समय के साथ खत्म हो जाएगा क्योंकि छवि।
5. पूरा पर्वत इमेजिंग
- फोटोग्राफी का उपयोग धातु संदंश के लिए उपयुक्त कोण पर, 100% Babb में डूबे भ्रूण को स्थिर। प्रकाश-अप और के तहत प्रकाश प्रकाश स्रोतों के संयोजन का उपयोग रोशन।
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ छवियों का मोलएक डिजिटल कैमरा के साथ outfitted। 0.5 मिमी के अलावा जेड अक्ष के साथ लगातार पांच फोकल विमानों में कई उज्ज्वल क्षेत्र जोखिम ले लो। जोखिम बार और च बंद हो जाता है रोशनी और कैमरे के चश्मे के अनुसार भिन्न है और प्रत्येक स्थापना के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है।
- ओवरले छवियों प्रक्रिया और photomontages उत्पन्न करने के लिए मानक छवि संसाधन सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
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Representative Results
TrkA गुम्मट / taulacZ के जीनोटाइप: Bax - / - और TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - भ्रूण असंदिग्ध रूप से मानक पीसीआर जीनोटाइपिंग द्वारा निर्धारित किया जा सकता है (चित्रा 1)। एक्स-लड़की धुंधला प्रदर्शित करता है पारंपरिक दाग भ्रूण (आंकड़े 2, 3 ए) में subcutaneously परिधीय axonal arbors विस्तृत है, और ऊतक समाशोधन के बाद भ्रूण भर (आंकड़े -3 बी, 4)।
/ - - लाइन न्यूरॉन विशिष्ट nestin प्रमोटर 17 के नियंत्रण के तहत अनिवार्यता से काइनेज सक्रिय बी आरएएफ (V600E) उत्परिवर्तन (LSL-kaBraf 16) के पेट में चूहों के साथ, प्राप्त करने के लिए LSL- Bax: हम TrkA गुम्मट / taulacZ नस्ल है kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - चूहों। पूरी तरह से TrkA सिगनल की कमी है, जो इन भ्रूणों में, nociceptor परिधीय अनुमानों के morphology फिर भी लगभग सामान्य रूप से (चित्रा 4) विकसित की है। इस प्रदर्शन/ - - आनुवंशिक पृष्ठभूमि संकेत TrkA निर्भर अस्तित्व के नुकसान के लिए प्रतिस्थापन बी आरएएफ भी परिधीय अक्षतंतु विकास में संकेत है, और के लिए एसए महत्वपूर्ण समारोह अस्तित्व और TrkA संकेतन के कार्यों को बढ़ावा देने के अक्षतंतु विकास Bax के साथ, अलग किया जा सकता है कि पता चलता है ।
चित्रा 1: ट्रांसजेनिक चूहों की जीनोटाइपिंग प्रतिनिधि agarose जेल छवियों।। नमूना 1: TrkA गुम्मट / taulacZ: Bax गुम्मट / -, नमूना 2: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, नमूना 3: TrkA गुम्मट / taulacZ: Bax - / -।
चित्रा 2: E18.5 TrkA गुम्मट / taulacZ माउस एक्स-लड़की के साथ दाग त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया से अक्षतंतु अनुमानों धड़ और गेंद से।डी एक मिलावटी भ्रूण में दिखाए जाते हैं। स्केल बार: 1 मिमी।
चित्रा 3:। E18.5 TrkA गुम्मट / taulacZ से पहले एक्स-लड़की (ए) के साथ दाग माउस और मध्य धड़ में DRGs से Babb अनुमानों के साथ समाशोधन के बाद (बी) दिखाए जाते हैं। स्केल बार: 2 मिमी।
चित्रा 4: एक E16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -:। एक्स-लड़की के साथ दाग और Babb kaBraf के साथ मंजूरी दे दी nestin-Cre माउस भ्रूण एक kinase सक्रिय बी आरएएफ काइनेज प्रोटीन encodes, बी-आरएएफ V600E। DRG न्यूरॉन्स में केब-आरएएफ की अभिव्यक्ति TrkA संकेतन के अभाव में सामान्य अक्षतंतु विस्तार के लिए करीब पूर्ण लंबाई, में हुई। स्केल बार: 1 मिमी। नियंत्रण सहित अधिक छवियों के लिए, रेफरी देखते हैं। 15, चित्रा2।
| पीसीआर जीनोटाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर | ||
| 1 | TrkA | डीएनए टुकड़ा आकार: 400 बी.पी. |
| TrkA_F | GCG GGC जीसीसी जीसीसी GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA ने जीसीसी जीसीसी टी जी सी GCG GCT CTG सीसीए GGG टीजी | |
| 2 | Bax | डीएनए टुकड़ा आकार: 304 बीपी (जंगली प्रकार), 507 बी पी (Bax नल) |
| In5R | GTT GAC कैग AGT GGC GTA सीजी | |
| Ex5F | टीजीए टीसीए GAA ने सीसीए टीसीए टीजी | |
| NeoR | CCG सीटीटी सीसीए टीटीजी सीटीसी एजीसी सीजी | |
| 3 | TauLacZ | डीएनए टुकड़ा आकार: 360 बी.पी. |
| lacZup | एसीए ACG टीसीजी टीजीए GTG GGA एएए | |
| lacZdown | एटीसी एएसी एटीटी एएए टीजीटी भूमिकाः सीजीए जी | |
तालिका 1: पीसीआर जीनोटाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों।
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Discussion
भ्रूण TrkA taulacZ चूहों के ऊपर वर्णित एक्स-लड़की धुंधला प्रक्रिया बरकरार तय भ्रूण में लंबी दूरी की अक्षतंतु अनुमानों के तेजी से और विस्तृत दृश्य के लिए अनुमति देता है। इन चूहों अक्षतंतु विकास और neuronal अस्तित्व दोनों के लिए योगदान कर सकते हैं कि तंत्र संकेत की जांच के लिए अनुमति देते हैं Bax अशक्त पृष्ठभूमि की वजह से। ब्याज की ट्रांसजेनिक या पीटा चूहों के साथ संभोग axonal phenotypes की व्यापक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है और एक अधिक विस्तृत फैशन में अक्षतंतु विकास संकेतन जांच करने के लिए भविष्य के प्रयोगों के लिए के रूप में उपयोगी गाइड की सेवा कर सकते हैं। इन विवो अक्षतंतु विकास अध्ययन के लिए एक बड़ी चुनौती ऊतक तैयार करने के लिए समय है वर्गों और किसी भी एक आनुवंशिक हेरफेर से कई मायनों में प्रभावित हो सकता है कि बढ़ रही axons की जटिल phenotypes के मूल्यांकन। TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - लाइन एक जीन का पूरा प्रभाव के मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता हैपरिधीय nociceptor अक्षतंतु विकास पर ब्याज की।
तकनीक को आम तौर पर जल्दी विकास के चरणों के दौरान TrkA व्यक्त करेंगे कि nociceptor axonal trajectories के दृश्य तक सीमित है। परिधीय nociceptors के अलावा, यह सहानुभूति और बेसल अग्रमस्तिष्क कोलीनर्जिक अनुमानों कल्पना करने के लिए संभव हो सकता है; हालांकि इस धुंधला तकनीक के विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता होगी
ऊतक समाशोधन यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम है। यह पूरे माउंट तैयारी में गहरी झूठ बोल अनुमानों और इस तरह अलग phenotypes की संभावित पहचान का विस्तृत आकलन के लिए सक्षम बनाता है। हमने पाया है क्योंकि इस तरह के tdTomato या GFP संवाददाताओं से 18,19, के रूप में फ्लोरोसेंट संवाददाताओं, कुछ शर्तों के तहत दृश्य स्पष्टता प्रदान कर सकता है, हालांकि यह एक्स-लड़की धुंधला करने के लिए इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट संकेतों के दौरान काफी फीका कि पूरे माउंट छवि प्राप्त करने के लिए मुश्किल है ऊतक समाशोधन प्रक्रिया। DiIधुंधला भी व्यापक रूप से अक्षतंतु लेबलिंग 20 के लिए प्रयोग किया जाता है; अपनी कमियों यह चुनिंदा ऐसे यहाँ nociceptor फाइबर के रूप में axons की एक विशिष्ट उपप्रकार लेबल नहीं कर सकते हैं, और यह पूरी तरह से परिधि में लंबे trajectories के लेबल करने के लिए मुश्किल है।
सारांश में, हम माउस भ्रूण में nociceptive axons की पूर्ण arbors की दिनचर्या दृश्य की अनुमति के लिए दो आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों का एक संयोजन का उपयोग करता है कि एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
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Acknowledgments
लेखकों व्यावहारिक चर्चा और सुझावों के लिए TrkA taulacZ चूहों और डॉ एनेट मार्कस के लिए डॉ लुई Reichardt को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम बर्क फाउंडेशन के रूप में अच्छी तरह से व्हाइटहॉल फाउंडेशन अनुसंधान अनुदान 2010-08-61, जीवन फाउंडेशन (WFL-अमेरिका-028/14) के लिए पंखों से एक शोध अनुदान से स्टार्टअप धन के द्वारा समर्थित किया गया था, से ZB1-1102-1 अनुदान क्रिस्टोफर और दाना रीव फाउंडेशन, और JZ को राष्ट्रीय नेत्र संस्थान से अनुदान 1R01EY022409 और 3R01EY022409-01S1,। KJO एक सुनार साथी है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
