Abstract
La visualizzazione del full-length proiezioni neuronali in embrioni è essenziale per acquisire una comprensione di come mammiferi reti neuronali si sviluppano. Qui si descrive un metodo per etichettare in situ un sottoinsieme di gangli delle radici dorsali (DRG) proiezioni assoni di valutare le loro caratteristiche fenotipiche con diverse linee di topi geneticamente manipolati. I neuroni TrkA-positivi sono neuroni nocicettori, dedicati alla trasmissione di segnali di dolore. Utilizziamo una linea di topi TrkA taulacZ etichettare le traiettorie di tutti assoni periferici TrkA-positivo nel topo embrione intatto. Abbiamo inoltre alleviamo la linea TrkA taulacZ su uno sfondo nullo Bax, che abolisce in sostanza l'apoptosi neuronale, al fine di valutare le domande di crescita relative indipendentemente possibili effetti delle manipolazioni genetiche sulla sopravvivenza neuronale. Successivamente, i topi geneticamente modificati di interesse sono allevati con il TrkA TaulLinea nullo ACZ / Bax e sono quindi pronti per lo studio utilizzando le tecniche qui descritte. Questa presentazione include informazioni dettagliate sui piani di allevamento del mouse, la genotipizzazione al momento della dissezione, preparazione del tessuto, colorazione e di compensazione per consentire la visualizzazione del full-length traiettorie assonali in tutto il montaggio di preparazione.
Introduction
Creazione di precise reti neuronali è un complesso processo evolutivo essenziale per la funzionalità del sistema nervoso. Disturbi in questo processo porta a una disfunzione neuronale che è stato coinvolto in malattie neurologiche umane 1-3. Per studiare i meccanismi molecolari alla base della crescita degli assoni e di destinazione innervazione nei mammiferi, abbiamo sviluppato un protocollo per visualizzare le traiettorie assonali di TrkA-esprimere i neuroni sensoriali utilizzando una combinazione di due linee di topi geneticamente modificati.
TrkA è un recettore per il fattore di crescita nervoso NGF ed è un marcatore funzionale dei neuroni sensoriali nocicettivi 4. TrkA è altamente espresso nei neuroni nocicettivi durante lo sviluppo precoce e media di sopravvivenza dei neuroni NGF-dipendente, la crescita degli assoni, arborization e destinazione innervazione 5-9. Nei topi TrkA taulacZ, il tipo selvatico gene TrkA è sostituito da un'espressione taulacZ cassette 10, tale che la morfologia assonale dei neuroni TrkA-positive putativi può essere visualizzata dal β-gal (X-gal) colorazione 11. Usando una linea TrkA taulacZ / WT eterozigote, possiamo esaminare i fattori che possono regolare o interferire con lo sviluppo di sensoriali proiezioni afferenti in vivo.
Inoltre, l'espressione TrkA è assente in omozigoti topi TrkA taulacZ / taulacZ, che possono quindi essere utilizzati per valutare la crescita degli assoni promuovere meccanismi in assenza di segnalazione NGF / TrkA. Poiché i neuroni nocicettivi dipendono NGF / TrkA segnalazione non solo per la crescita degli assoni, ma anche per la sopravvivenza, ci avvaliamo di un'altra linea di topi, manca la pro-apoptotico gene Bax, di inibire l'apoptosi nei neuroni DRG embrionali, sottraendoli morte cellulare che è altrimenti osservata in assenza di segnalazione TrkA. La Bax - / - sfondo 12 consente quindi per la molecudissezione lar di vie di segnalazione che riguardano specificamente assone 7-9,13-15 crescita. In TrkA - / -: Bax - / - mice, neuroni DRG sopravvivono, ma sensoriale innervazione afferente nella pelle è completamente aboliti 14,15. Siamo in grado di attivare selettivamente vie di segnalazione per determinare i rispettivi contributi allo sviluppo delle proiezioni assoni. L'utilità di questo metodo è che permette la valutazione delle variazioni di fenotipi di crescita assonale quando diverse modificazioni genetiche sono allevati sul TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - o TrkA taulacZ / WT: Bax - / - sfondi.
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Protocol
NOTA: Tutte le procedure sono conformi alla Guida NIH per l'uso e la cura di animali da laboratorio. Il protocollo animale è stato approvato dal IACUC al Weill Cornell Medical College.
1. Preparazione del tessuto
- Euthanize femmine scaduta a gravidanza per dislocazione cervicale 15. Sezionare embrionali E16 - E18 embrioni da femmine scaduta a gravidanza e posto embrioni singolarmente nei pozzetti di un piatto 6-bene, pieni di fosfato salino freddo tamponata (PBS).
- Sciacquare embrioni in PBS freddo.
- Rimuovere una piccola porzione della membrana amniotica dell'embrione e posto in una soluzione di proteinasi K pre-preparato per la successiva genotipizzazione. In alternativa, se la membrana amniotica è perso, rimuovere una piccola porzione della punta della coda dell'embrione e metterlo in soluzione proteinasi K
- Poke i fori nella pelle in tutto l'embrione utilizzando perni di insetti (almeno 100 per lato).
- Rimuovere PBS e aggiungere lentamente fresco 2% paraformaldeide (PFA),pH 7.4, al pozzo.
- Agitare delicatamente per 2 ore a 4 ° C.
- Risciacquare embrioni due volte in PBS e conservare in PBS a 4 ° C fino colorazione.
2. Genotipizzazione
- Immergere membrane amniotiche o croce embrione in proteinasi K miscela secondo le istruzioni del produttore.
- Incubare a 56 ° C per 10 min.
- Estrarre DNA utilizzando un kit di purificazione di DNA disponibile in commercio.
- Prendere 0,5 l di totali 200 microlitri purificati soluzione di DNA genomico, combinarlo con 0,5 ml di ciascuna delle senso e antisenso primer specifici geni (10 micron), 2 microlitri dNTP Mix (2,5 mm di dATP, dCTP, dGTP e dTTP) , 0,2 microlitri polimerasi Taq (5 U / ml) e 2 microlitri tampone PCR (10x), aggiungere H 2 O per un volume totale di 20 microlitri.
NOTA: sequenze primer sono le seguenti (Tabella 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR fragLunghezza mento: 400 paia di basi (bp).
Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, neor: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR lunghezze frammento: wild type, 304 bp; Bax null, 507 bp.
TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR frammento lunghezza: 360 bp. - Eseguire un PCR con il seguente programma per TrkA: passo 1: 1 min a 95 ° C, punto 2: 10 sec a 95 ° C, punto 3: 20 sec a 68 ° C, il punto 4: 30 sec a 72 ° C. Ripetere i punti 2 - 4 per 40 cicli.
- Per LacZ e Bax, eseguire una PCR con il seguente programma: punto 1: 1 min a 95 ° C, punto 2: 10 sec a 95 ° C, punto 3: 1 min a 54 ° C, il punto 4: 1 min a 72 ° C, ripetere i punti 2 - 4 per 35 cicli.
- Campioni Run PCR su un gel di agarosio 2% a 100 V in 1x tampone Tris-acetato-EDTA per 20 minuti con una corsia di scala DNA per valutare lunghezze frammento.
- Analizzare gli embrioni per la presenza di tipo selvaggio TrkA, TRKA-tauLacZ e Bax alleli nulli. I genotipi di embrioni sperimentali sono TrkA taulacZ / WT: Bax - / - e TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, a seconda delle questioni sperimentali. Gli embrioni privi del giornalista tauLacZ saranno negativi per assonale colorazione e può quindi servire come controlli negativi per calibrare il processo di colorazione.
3. Embryo Colorazione
- Utilizzare un kit commerciale per lacZ colorazione con alcune modifiche come descritto di seguito nelle sezioni 3,2-3,8. Qui, utilizzare il kit Millipore.
- Immergere embrioni in tampone A per almeno 1 ora, scuotendo leggermente a temperatura ambiente.
- Direttamente immergere embrioni in tampone B per almeno 15 minuti, agitando dolcemente alla temperatura ambiente.
- Mentre gli embrioni sono in Buffer A / B, soluzione Tissue Base pre-caldo a 37 ° C. Utilizzare 5 ml di soluzione di tessuto di base per embrione.
- Mentre gli embrioni sono in Buffer A / B, preparare fresco 5-bromo- 4- cloro- 3- indolil α-D-galattopiranoside (X-gal) ad una concentrazione di 40 mg / ml in 100% dimetilsolfossido (DMSO).
- Diluire X-gal nella soluzione Tissue Base pre-riscaldato ad una concentrazione di 1 mg / ml e si aggiungono 5 ml di X-gal / miscela Base Tissue in una fiala di scintillazione in vetro.
- Trasferire gli embrioni in una fiala di scintillazione di vetro contenente miscela Base X-gal / tessuto. Sigillare coperchio con Parafilm e incubare a 37 ° C durante la notte, controllando la presenza di blu macchia.
- Embrioni Postfix con freschi 4% PFA, pH 7.4. Agitare delicatamente per 4 ore a 4 ° C.
- Sciacquare embrioni due volte in PBS freddo.
4. Tissue Disidratazione e Clearing
- Luogo embrioni in metanolo al 50% al 50% della miscela / PBS per 30 minuti a temperatura ambiente, agitando in fiale di vetro.
- Continuare a disidratare in 75% metanolo / 25% PBS per 30 minuti a temperatura ambiente agitando in flaconcini di vetro.
- Continuare a disidratare in metanolo al 90% / 10% PBS per 30 min a temperatura ambiente agitando in flaconcini di vetro.
- Continuare a disidratare in metanolo 100% per 30 min (2x) a temperatura ambiente agitando in flaconcini di vetro.
- Mentre embrioni sono disidratazione, preparare un 1: 1 (v: v) miscela di alcool benzoile e benzoil benzoato.
NOTA: alcol benzoile e benzoil benzoato è tossico. - Immergere embrioni in 1: 1 (v: v) miscela di metanolo 100%: 100% BABB per 15 min. Utilizzare il vetro solo perché il BABB si dissolverà in plastica.
- Immergere embrioni in 100% BABB completamente chiaro il tessuto e visualizzare X-gal colorazione nell'embrione eliminato.
NOTA: L'immagine appena possibile perché la macchia X-gal sbiadiscono nel tempo.
5. intero monte Imaging
- Stabilizzare l'embrione, immerso in 100% BABB, agli angoli appropriati per fotografia con pinze di metallo. Illuminare utilizzando una combinazione di up-light e sotto-light fonti.
- Acquisire le immagini con un microscopio dissezionedotato di una fotocamera digitale. Prendere esposizioni multiple in campo chiaro a cinque piani focali successivi 0,5 millimetri di distanza lungo l'asse Z. I tempi di esposizione e f-stop possono variare a seconda di illuminazione e telecamere specifiche e devono essere ottimizzati per ogni installazione.
- Utilizzare software standard di elaborazione delle immagini per elaborare immagini sovrapposte e generare fotomontaggi.
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Representative Results
I genotipi di TrkA WT / taulacZ: Bax - / - e TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - gli embrioni possono essere inequivocabilmente determinati dal genotipo normale PCR (Figura 1). Display colorazione X-gal dettagliate pergole assonale periferici per via sottocutanea in embrioni convenzionalmente macchiati (figure 2, 3 bis), e in tutto l'embrione dopo schiarimento del tessuto (figure 3b, 4).
Abbiamo allevato il TrkA WT / taulacZ: Bax - / - linea con i topi portatori del costitutivamente chinasi attivata B-RAF (V600E) mutazione (LSL-kaBraf 16) sotto il controllo del promotore nestina specifico dei neuroni 17, per ottenere LSL- kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - mice. In questi embrioni, che mancano completamente di segnalazione TrkA, la morfologia di nocicettori sporgenze periferiche tuttavia sviluppato quasi normalmente (Figura 4). Questo dimostraresa funzione cruciale per B-RAF segnalazione nella crescita assonale periferico, e mostra anche che la sopravvivenza e la crescita assone-promozione funzioni di segnalazione TrkA possono essere separati, con la Bax - / - background genetico sostituendo la perdita della sopravvivenza TrkA-dipendente segnalazione .
Figura 1: genotipizzazione dei topi transgenici Rappresentante immagini gel agarosio.. Esempio 1: TrkA WT / taulacZ: Bax WT / -, campione 2: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, campione 3: TrkA WT / taulacZ: Bax - / -.
Figura 2: E18.5 TrkA WT / taulacZ del mouse colorati con X-gal Axon proiezioni gangli trigeminali in tronco e HEA.d sono mostrati in un embrione non liquidati. Scala bar: 1 mm.
Figura 3:. Mouse E18.5 TrkA WT / taulacZ colorati con X-gal (A) prima e (B) dopo aver eliminato con Babb proiezioni di DRG a metà del tronco sono mostrati. Scala bar: 2 mm.
Figura 4: Un E16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -:. Nestin-Cre embrione di topo colorati con X-gal e liquidati con BABB kaBraf codifica per una chinasi attivata B-RAF proteina chinasi, B-RAF V600E. Espressione di Kab-RAF in neuroni DRG provocato full-length, vicino alla normalità estensione dell'assone in assenza di segnalazione TrkA. Scala bar: 1 mm. Per altre immagini, tra cui controlli, vedi rif. 15, Figura2.
| Primer utilizzati per PCR genotipizzazione | ||
| 1 | TrkA | Dimensione del frammento di DNA: 400 bp |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Bax | Dimensione del frammento di DNA: 304 bp (wild type), 507 bp (Bax null) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| Neor | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | Dimensione del frammento di DNA: 360 bp |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
Tabella 1: Primer utilizzati per PCR genotipizzazione.
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Discussion
La procedura di colorazione X-gal sopra descritto di topi embrionali TrkA taulacZ permette la visualizzazione rapida e dettagliata delle proiezioni assoni lunga distanza nell'embrione fisso intatto. A causa del fondo nulla Bax questi topi permettono di sondare di meccanismi di segnalazione che possono contribuire sia alla crescita degli assoni e la sopravvivenza neuronale. Accoppiamento con transgenici o knockout mice di interesse consente per la valutazione complessiva di fenotipi assonale e può servire come guida utile per i futuri esperimenti per esaminare la segnalazione crescita assonale in maniera più dettagliata. Una sfida importante per gli studi in vivo assoni crescita in è il momento di preparare il tessuto sezioni e valutare le complesse fenotipi di assoni in crescita che possono essere interessati in più modi di qualsiasi manipolazione genetica. Il TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - line consente di valutare tutti gli effetti di un genedi interesse per lo sviluppo nocicettori assoni periferici.
La tecnica è limitata alla visualizzazione di traiettorie nocicettori assoni che normalmente esprimono TrkA durante i primi stadi di sviluppo. Oltre ai nocicettori periferici, può essere possibile visualizzare proiezioni proencefalo colinergici simpatico e basali; tuttavia questo richiederebbe specifica ottimizzazione delle tecniche di colorazione
Tissue clearing è un passaggio chiave del protocollo qui descritto. Esso consente una valutazione dettagliata delle proiezioni che si trovano più profonde in tutto il montaggio preparati e quindi il potenziale di identificazione di fenotipi distinti. Giornalisti fluorescenti, come TdTomato o reporter GFP 18,19, possono offrire chiarezza visiva in determinate condizioni, tuttavia è difficile acquisire l'immagine intera-mount, perché abbiamo scoperto che in contrasto con la colorazione X-gal, i segnali fluorescenti dissolvenza sostanzialmente durante la procedura di compensazione dei tessuti. DIIcolorazione è anche ampiamente utilizzato per l'etichettatura assone 20; suoi difetti sono che non può selettivamente etichettare uno specifico sottotipo di assoni quali le fibre nocicettori qui, ed è difficile etichettare pienamente lunghe traiettorie in periferia.
In sintesi, offriamo un protocollo che utilizza una combinazione di due linee di topi geneticamente modificati per permettere la visualizzazione di routine del pieno pergole di assoni nocicettivi in embrione di topo.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Louis Reichardt per i topi TrkA taulacZ e Dr. Annette Markus per la discussione penetranti e suggerimenti. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di avvio dalla Fondazione Burke e assegno di ricerca della Fondazione Whitehall 2010-08-61, un assegno di ricerca da Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), concedere ZB1-1102-1 dal Christopher e Dana Reeve Foundation, e le sovvenzioni 1R01EY022409 e 3R01EY022409-01S1 dal National Eye Institute, a JZ. KJO è un collega Goldsmith.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
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