Abstract
胚における完全長の神経突起を可視化は、神経回路網の開発方法哺乳類の理解を得ることが不可欠である。ここでは、 その場でいくつかの遺伝子操作されたマウス系統を使用してそれらの表現型特性を評価するために、後根神経節（DRG）軸索突起のサブセットを標識するための方法を記載する。 TrkAの陽性ニューロンは、疼痛信号の送信専用の侵害受容ニューロンである。私たちは、そのままマウス胚内のすべてのTrkAの陽性末梢軸索の軌跡にラベルを付けるのTrkA taulacZマウスラインを利用しています。私たちは、さらに独立してニューロンの生存上の遺伝子操作の可能性のある影響の成長関連の質問を評価するために、本 質的に神経細胞アポトーシスを廃止Baxのヌルバックグラウンド上にあるTrkA taulacZラインを繁殖。その後、関心の遺伝子改変マウスをTrkAのtaulと交配させるACZ / Baxの空行、その後、本明細書に記載の技術を用いた研究の準備ができている。このプレゼンテーションでは、マウスの繁殖計画の詳細については、解剖時のジェノタイピング、組織調製、染色および全体のマウント準備の完全長軸索軌道の可視化を可能にするためにクリアが含まれています。
Introduction
正確な神経回路網の確立は、神経系の機能性に不可欠な複雑な発達過程である。このプロセスの乱れは、ヒトの神経系疾患1-3に関与している神経細胞の機能障害を引き起こす。哺乳動物における軸索成長および標的神経支配の下にある分子メカニズムを研究するために、我々は2つの遺伝的に改変されたマウス系統の組み合わせを使用して感覚ニューロンのTrkA発現の軸索の軌道を視覚化するためのプロトコルを開発した。
のTrkAは、神経成長因子NGFに対する受容体であり、侵害受容感覚ニューロン4の機能的マーカーである。 TrkAのは非常に初期の開発中に侵害受容ニューロンに発現し、NGF依存ニューロンの生存、軸索成長、樹枝状分岐とターゲット神経支配5-9を媒介する。 TrkAのtaulacZマウスでは、野生型のTrkA遺伝子taulacZ式 cで置換されている推定上のTrkA陽性ニューロンの軸索の形態11染色のβ-gal（X-galで）によって可視化することができるようassette 10、。ヘテロ接合のTrkA taulacZ / WTラインを使用して、我々は調節またはin vivoでの感覚求心性突出部の発展を妨害する可能性のある要因を調べることができます。
また、TrkAの発現は、したがって、NGF / TrkAのシグナル伝達の非存在下でのメカニズムを促進する軸索成長を評価するために使用することができるホモ接合性のTrkA taulacZ / taulacZのマウスには存在しない。侵害受容ニューロンは、NGF / TrkAのだけでなく、軸索成長のためのシグナリングに依存するためではなく、生存のために、我々は、それ以外の細胞死からそれらを救出、胚DRGニューロンにおけるアポトーシスを阻害するために、プロアポトーシスBax遺伝子を欠いている、別のマウス系統を使用するTrkAレセプターシグナル伝達の非存在下で観察。 バックス- / -バックグラウンド12は、このように molecuが可能に特に軸索成長7-9,13-15に影響を与えるシグナル伝達経路のLAR解剖。 TrkAのでは- / - ：バックス- / -マウスは、DRGニューロンは生き残るが、皮膚の感覚求心性神経支配は完全14,15を廃止している。私たちは、選択的に軸索投射の発展にそれぞれの貢献を決定するシグナル伝達経路を活性化することができる。 バックス- / -背景： - - /またはTrkA taulacZ / WTバックス：この方法の有用性は、異なる遺伝的改変はTrkAのtaulacZ / taulacZに飼育されているときに、軸索成長表現型の変化の評価を可能にすることである。
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Protocol
注：すべての手順は、実験動物の使用とケアのためのNIHガイドに準拠しています。動物プロトコルは、ワイルコーネル医科大学のIACUCによって承認された。
1.組織調製
- 頸椎脱臼15によって時限妊娠女性を安楽死させる。冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を充填した6ウェルディッシュのウェルで個々に時限妊娠雌場所胚からE18胚 - 胚E16を解剖。
- 冷PBSで胚を洗浄します。
- その後の遺伝子型判定のための事前準備されたプロテイナーゼK溶液中で胚と場所の羊膜のわずかな部分を削除します。羊膜が失われた場合あるいは、胚の尾の先端の一部を除去し、プロテイナーゼK溶液に入れ
- 虫ピン（側面当たり少なくとも100）を使用して、すべての胚の周りの皮膚に穴を突く。
- PBSを除去し、ゆっくりと新鮮な2％パラホルムアルデヒド（PFA）を追加し、ウェルにpHが7.4、。
- ゆっくりと4℃で2時間振る。
- PBSで2回胚をすすぎ、染色まで4℃でPBS中に保管してください。
2.ジェノタイピング
- 製造業者の説明書に従って、プロテイナーゼK混合物中の羊膜または胚の尾部を浸す。
- 10分間56℃でインキュベートする。
- 市販のDNA精製キットを用いてDNAを抽出する。
- 遺伝子特異的なセンスおよびアンチセンスプライマー（10μM）の各0.5μlの、2μLのdNTPミックスとそれを組み合わせる、ゲノムDNA溶液に精製合計200μLの0.5μLを取る（のdATP 2.5mMの、dCTP、dGTPおよびdTTP） 、0.2μlのTaqポリメラーゼ（5U /μL）と2μlのPCR緩衝液（10倍）は、20μlの総体積にH 2 Oを追加します。
注：プライマー配列は以下のとおりである（ 表1）：
のTrkA：TrkA_F：GCG GGC GCC GCC、GCG ATG、TrkA_R：GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG。 PCRのFRAGメントの長さ：400塩基対（bp）の。
バックス：In5R：GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG、Ex5F：TGA TCA GAA CCA TCA TG、のNeoR：CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG。 PCR断片の長さ：野生型、304塩基対;のBaxヌル、507 bpの。
TauLacZ：lacZup：ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA、lacZdown：ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G。 PCR断片の長さ：360塩基対。 - TrkAのための以下のプログラムでPCRを実行します。72℃で30秒：68℃、ステップ4で20秒：ステップ3 95℃、10秒：ステップ1：ステップ2 95℃、1分。 40サイクル4 - を繰り返して、2を繰り返します。
- LacZおよびBaxのために、以下のプログラムを用いてPCRを実行します。手順1：1分95℃で、ステップ2：10秒95℃、ステップ3：1分54℃、ステップ4：72で1分35サイクル4 - °Cを繰り返し、2を繰り返します。
- DNAラダーのレーンで20分間、1×トリス - 酢酸-EDTA緩衝液中、100Vで2％アガロースゲル上で実行PCRサンプルフラグメントの長さを評価する。
- 野生型のTrkA、Tの存在のための胚を分析RKA-tauLacZおよびBaxヌル対立遺伝子。実験的な胚の遺伝子型は、TrkAのtaulacZ / WTです：バックス- / -およびTrkAのtaulacZ / taulacZ：バックス- / - 、実験的な質問に応じて。 tauLacZレポーターを欠いている胚は軸索染色について陰性であることになるので、染色プロセスを較正するために陰性対照として役立つことができる。
3.胚染色
- 3.8 -セクション3.2で下記のようにいくつかの変更を加えてLacZ染色のための市販のキットを使用してください。ここでは、ミリポアキットを使用。
- 室温で穏やかに揺れ、少なくとも1時間緩衝液A中の胚を浸し。
- 直接室温で静かに揺れ、少なくとも15分間、緩衝液Bで胚を浸す。
- 37℃での胚がバッファーA / Bであるが、前加温組織ベースのソリューション。胚あたりの組織塩基溶液の5ミリリットルを使用してください。
- 胚は緩衝液A / Bにある間、新鮮な5-BRを準備100％のジメチルスルホキシド（DMSO）中に40mg / mlの濃度でomo-が4-クロロ-3-インドリルα-D-ガラクトピラノシド（X-galで）。
- 1 mg / mlの濃度で予め温め組織ベース溶液中にX-galで希釈し、ガラスシンチレーションバイアルにX-galを/組織ベース混合物を5ml加える。
- X-galを/組織ベースの混合物を含むガラスシンチレーションバイアルに胚を移す。パラフィルムで蓋を密封し、37℃で一晩インキュベート、ブルーステインの存在をチェックする。
- 新鮮な4％PFA、pHが7.4とPostfixの胚。静かに、4℃で4時間振る。
- 冷たいPBSで2回の胚をすすぐ。
4.組織脱水とクリア
- ガラスバイアル中で振盪し、室温で30分間、50％メタノール/ 50％PBS混合物中の場所胚。
- ガラスバイアル中で振盪し、室温で30分間、75％メタノール/ 25％PBSで脱水し続ける。
- P 10パーセント/ 90％メタノール中で脱水し続けるガラスバイアル中で振盪し、室温で30分間、BS、。
- ガラスバイアル中で振盪し、室温で30分間（2×）、100％メタノール中で脱水し続ける。
- 1（V：V）ベンゾイルアルコール及びベンゾイル安息香酸の混合胚は、脱水されていますが、1を準備します。
注：ベンゾイルアルコール、ベンゾイル安息香酸は有毒である。 - 1：1で胚を浸す（v：v）によって精製した100％メタノールの混合物：15分間、100％BABB。 BABBはプラスチックを溶解するので、唯一のガラスを使用しています。
- 完全に組織をクリアするとクリア胚におけるX-gal染色を視覚化するために100パーセントBABBで胚を浸し。
注：できるだけ早く画像のX-gal染色は、時間をかけてフェードインしますので。
5.ホールマウントイメージング
- 金属ピンセットを用いて写真撮影のために適切な角度で、100パーセントBABBに浸漬胚を、安定化させる。ライトアップアンダー光光源の組み合わせを用いて照明する。
- 解剖顕微鏡で画像を取得するデジタルカメラを装備。 0.5ミリメートル離れてZ軸に沿って連続する5つの焦点面に複数の明視野エクスポージャーを取る。露光時間とFストップは、照明とカメラのスペックに応じて変化し、それぞれのセットアップのために最適化する必要があるかもしれません。
- オーバーレイ画像を処理し、フォトモンタージュを生成するために、標準的な画像処理ソフトウェアを使用してください。
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Representative Results
TrkAのWT / taulacZの遺伝子型：たBax - / -およびTrkAのtaulacZ / taulacZ：たBax - / -胚は、明確に、標準的なPCR遺伝子型同定（ 図1）によって決定することができる。 X-gal染色ディスプレイは、従来、染色された胚（ 図2、図3a）に皮下末梢軸索アーバーを詳述し、そして組織のクリア後の胚全体（ 図3b、4）。
私たちは、TrkAのWT / taulacZを交配させています：バックス- / -ニューロン特異的ネスチンプロモーター17の制御下構成的キナーゼ活性化B-RAF（V600E）突然変異（LSL-kaBraf 16）を有するマウスを持つ行が、取得しLSL- kaBraf：TrkAのtaulacZ / taulacZ：バックス- / -マウス。完全にTrkAのシグナリングを欠いているこれらの胚では、侵害受容器周辺凸部の形態は、それにもかかわらず、ほぼ正常にします（ 図4）を開発しました。この実証saのB-RAFのための重要な機能は、周辺軸索成長シグナリング、またTrkAのシグナル伝達の機能を促進する生存および軸索成長のBaxと、分離することができることを示している- / -遺伝的背景シグナリングTrkAの依存性の生存の喪失を置換する。
図1：トランスジェニックマウスのジェノタイピング代表アガロースゲル画像。サンプル1：TrkAのWT / taulacZ：BaxのWT / - 、サンプル2：TrkAのtaulacZ / taulacZ：バックス- / - 、サンプル3：TrkAのWT / taulacZ：バックス- / - 。
図2：E18.5のTrkA WT / taulacZマウスは、X-galで染色三叉神経節からの軸索投射を胴体とHEAに。Dはクリアされていない胚に示されている。スケールバー：1ミリメートル。
図3：E18.5のTrkA WT / taulacZの前のX-gal（A）で染色したマウスと半ば胴体内のDRGからBABB突起をクリアした後（B）が示されている。スケールバー：2ミリメートル。
図4：E16.5 LSL-kaBraf：TrkAのtaulacZ / taulacZ：バックス- / - ：X-galで染色し、BABB kaBraf でクリアネスチンのCreマウス胚は、キナーゼ活性化B-RAFキナーゼタンパク質をコードして、B-RAF V600E。 DRGニューロンにおけるKAB-RAFの発現は、TrkAのシグナリングがない場合の通常の軸索伸長に近い、完全長になった。スケールバー：1ミリメートル。コントロールを含む複数の画像については、リファレンスを参照してください。 15、 図2。
| PCR遺伝子型同定のために使用したプライマー | ||
| 1 | のTrkA | DNA断片サイズ：400bpの |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC、GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC TGCのGCG GCT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | バックス | DNA断片のサイズ：304 bpの（野生型）、507 BP（のBaxヌル） |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| のNeoR | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | DNA断片のサイズ：360 bpの |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
表1：PCR遺伝子型同定のために使用したプライマー。
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Discussion
胚のTrkA taulacZマウスの上述のX-gal染色手順はそのまま固定胚における長距離軸索突起の迅速で詳細な視覚化を可能にする。 Baxのヌルバックグラウンドのため、これらのマウスは軸索成長とニューロンの生存の両方に寄与し得るシグナル伝達機構のプロービングが可能になります。興味のあるトランスジェニックまたはノックアウトマウスと交配すると、軸索の表現型の総合的な評価を可能にすると、より詳細な方法で軸索成長のシグナル伝達を調べるために将来の実験のためとして有用な指針を提供することができます。in vivoでの軸索成長の研究のための主要な課題は、組織を準備する時間であるセクションとは、いずれかの遺伝子操作によって複数の方法で影響を受ける可能性が増大する軸索の複雑な表現型を評価する。 TrkAのtaulacZ / taulacZ：バックス- / -ラインは、遺伝子の完全な効果を評価することができる末梢侵害受容器軸索の開発に興味のある。
技術は、通常、初期の発達段階の間にあるTrkAを発現し侵害受容器の軸索軌道の可視化に限定されている。末梢侵害受容器に加えて、それは、交感神経および基底前脳コリン作動性突起を可視化することが可能である。しかし、これは染色技術の特定の最適化を必要とする
組織クリアがここに記載されたプロトコルの重要なステップである。それは全体のマウントの準備でより深く横たわっている凸部の詳細な評価、したがって、明確な表現型の潜在的な同定を可能にする。我々は、X-gal染色は対照的に、蛍光シグナルが中に実質的にフェードインすることを見出したので、そのようなTdTomatoまたはGFPレポーターの蛍光レポーター、18,19、特定の条件下で視覚的明瞭さを提供することができるが、しかし、それはホールマウントの画像を取得することは困難である組織清算手続き。のDiI染色も広く軸索の標識20のために使用される。その欠点は、選択的に、ここで侵害受容繊維として軸索の特定のサブタイプにラベルを付けることができないことであり、それは完全に周囲に長い軌道を標識することは困難である。
要約すると、我々は、マウス胚における侵害受容軸索の完全アーバーのルーチン視覚化できるように2遺伝子的に修飾されたマウス系統の組み合わせを使用するプロトコルを提供する。
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Acknowledgments
著者は、洞察力に富んだ議論や提案のためのTrkA taulacZマウスと博士アネットマルクス博士ルイライハルトに感謝したいと思います。この作品はバーク財団だけでなく、ホワイトホール財団研究助成金2010-08-61、ライフ財団（WFL-US-028/14）のための翼から研究助成金からスタートアップ資金によってサポートされていましたから、ZB1-1102-1を付与クリストファー＆ダナ·リーブ財団、国立眼研究所から、JZへの助成金1R01EY022409と3R01EY022409-01S1。 KJOはゴールドスミスの仲間です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
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