Abstract
배아 전장 신경 돌기의 시각화는 신경 네트워크가 개발 포유류 방법을 이해하는 것이 필수적이다. 여기에서 우리는 현장에서 여러 유전자 조작 마우스 라인을 사용하여 자신의 표현형 특성을 평가하기 후근 신경절 (DRG) 축삭 돌기의 부분 집합에 레이블을하는 방법을 설명합니다. 양성 뉴런의 TrkA 통증 신호의 송신에 전용 침해 수용체 뉴런이다. 우리는 그대로 마우스 배아의 모든의 TrkA 양성 주변 축삭의 궤도에 라벨의 TrkA taulacZ 마우스 라인을 사용한다. 우리는 더 독립적으로 신경 세포의 생존에 유전자 조작의 가능한 효과의 성장과 관련된 질문을 평가하기 위해, 기본적으로 신경 세포의 사멸을 폐지 백스 널 배경 위에의 TrkA taulacZ 라인을 번식. 이어서, 관심의 유전자 변형 마우스의 TrkA taul와 교배ACZ / Bax의 널 라인은 본 발명에 개시된 기술을 사용하여 연구를위한 준비가되었다. 이 프레젠테이션은 전체 마운트 준비에 전체 길이 축삭 궤적의 시각화 수 있도록 해부, 조직 준비, 염색 및 청소시 상세한 마우스 사육 계획에 대한 자세한 내용은 유전자형이 포함되어 있습니다.
Introduction
정확한 신경 네트워크의 설립은 신경계의 기능에 필수적인 복잡한 발달 과정이다. 이 과정에서 장애는 인간의 신경 질환 1-3에 연루 된 신경 세포의 기능 장애로 이어집니다. 포유 동물에서 축삭 성장과 타겟 신경 분포의 기본 분자 메커니즘을 연구하기 위해, 우리는 두 가지 유전자 변형 마우스 라인의 조합을 사용하여 감각 뉴런의 TrkA는 발현의 축삭 궤적을 시각화하는 프로토콜을 개발했다.
의 TrkA는 신경 성장 인자 수용체 NGF 용이며 통각 감각 뉴런 (4)의 기능적인 마커이다. 의 TrkA 매우 초기 개발 과정에서 통각 신경 세포에서 발현 및 NGF에 의존하는 신경 세포의 생존, 축삭 성장, arborization 및 대상 신경 분포 5-9을 매개한다. 생쥐의 TrkA taulacZ에서는 야생형의 TrkA 유전자 taulacZ 식 C로 대체추정의 TrkA - 신경 세포의 축삭 형태 (11) 염색 β-여자 (X-GAL)에 의해 가시화 될 수 있도록 assette 10. 이형의 TrkA taulacZ / WT 라인을 사용하여, 우리는 규제 또는 생체 내에서 감각 구 심성 돌기의 발달을 방해 할 수있는 요소를 검사 할 수 있습니다.
더욱이 식의 TrkA 따라서 NGF / 시그널링의 TrkA 부재 메커니즘을 촉진 축삭 성장을 평가하기 위해 사용될 수 동형의 TrkA taulacZ / taulacZ 마우스에 존재하지 않는다. 통각 신경 NGF /의 TrkA뿐만 아니라 축삭 성장에 대한 시그널링에 의존하기 때문에, 또한 생존을 위해, 우리는, 그렇지 세포 죽음에서 그들을 구출 배아 DRG 신경 세포 사멸을 억제하는 것으로, 친 아폽토시스는 Bax 유전자가없는, 다른 마우스 선을 채용 시그널링의 TrkA의 부재하에 관찰 하였다. 백스 - / - (12)는 이와 같이 배경 molecu 허용특히 축삭의 성장 7-9,13-15에 영향을 미치는 신호 전달 경로의 LAR 해부. 의 TrkA에서 - / - : 백스 - / - 마우스는 DRG 뉴런은 생존하지만, 피부에 감각 구 심성 신경 분포가 완전히 (14, 15)를 폐지한다. 우리는 선택적으로 축삭 돌기의 발달에 각각의 기여를 결정하는 신호 전달 경로 활성화 할 수 있습니다. 이 방법의 유틸리티는 다른 유전 수정이의 TrkA taulacZ / taulacZ에 사육하는 경우가 축삭 성장 표현형의 변화에 대한 평가를 할 수 있다는 것입니다 백스 - / - 또는의 TrkA taulacZ / WT : 백스 - / - 배경.
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Protocol
참고 : 모든 절차는 실험 동물의 사용 및 관리에 대한 NIH 가이드 준수합니다. 동물 프로토콜은 웨일 코넬 의과 대학에서 IACUC 승인을 받았다.
1. 조직 준비
- 자궁 경부 전위 15 시간 초과 - 임신 여성을 안락사. 개별적으로 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS)로 채워진 6 잘 접시의 우물에서 시간 초과 - 임신 여성과 장소 배아에서 E18 배아 - 배아 E16를 해부하다.
- 차가운 PBS에서 배아를 씻어.
- 후속 유전자형을위한 사전 준비의 proteinase K 용액 배아과 장소 양막의 작은 부분을 제거한다. 양막이 끊어지면 대안, 배아의 꼬리 끝의 일부를 제거하고 K 테 용액에 넣
- 모든 곤충 핀 (측면 당 적어도 100)를 이용하여 배아 주위 피부에 구멍을 찔러.
- (PFA)을 신선한 2 % 파라 포름 알데히드를 추가 천천히 PBS를 제거하고우물에 pH가 7.4.
- 조심스럽게 4 ° C에서 2 시간 동안 흔들어.
- PBS에 두 번 배아를 씻어 염색까지 4 ° C에서 PBS에 저장합니다.
2. 유전자형
- 제조업체의 지침에 따라 단백질 분해 효소 K 혼합물에 양막 또는 배아 꼬리를 담근다.
- 10 분 동안 56 ° C에서 품어.
- 시중에서 판매하는 DNA 정제 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다.
- 유전자 특이 센스 및 안티센스 프라이머 (10 μM)의 각각 0.5 μL, 2 μL의 dNTP 믹스와 결합, 게놈 DNA 용액 정제 총 200 μL의 0.5 μl를 타고 (dATP 존재의 2.5 mM의,의 dCTP, dGTP의 및 dTTP) 0.2 μL의 Taq 중합 효소 (5 U / μL) 및 2 ㎕의 PCR 완충액 (10 배)은 20 ㎕의 총 부피로 H 2 O를 추가한다.
참고 : 프라이머 서열은 다음과 같습니다 (표 1)
의 TrkA : TrkA_F : GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R : GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR의 파편, 표준 길이 : 400 염기쌍 (BP).
백스 : In5R : GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F : TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR : CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR 단편 길이 : 야생형, BP (304); Bax의 널 (null), 507 bp의.
TauLacZ : lacZup : ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown : ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR 단편 길이 : 360 bp의. - 의 TrkA에 대해 다음 프로그램으로 PCR을 실행 1 단계 : 1 분 95 ° C, 2 단계에서 30 초 72 ° C : 68 ° C, 4 단계에서 20 초 : 95 ° C, 3 단계에서 10 초. 40주기 4 - 반복 2 단계를 반복합니다.
- LacZ를하고 백스를 들어, 다음 프로그램으로 PCR을 실행 1 단계 : 1 분 95 ° C에서, 2 단계 : 10 초 95 ° C, 단계에서 3 : 1 분 54 ° C, 단계 4 : 72에서 1 분 35 사이클 - 4 ° C를 반복 2 단계를 반복합니다.
- DNA 래더의 차선을 20 분 동안 1X 트리스 - 아세테이트 - EDTA 완충액에서 100 V에서 2 % 아가 로스 겔에서 실행 PCR 샘플 길이 단편을 평가.
- 야생형의 TrkA, T의 존재에 대해 분석 배아RKA - tauLacZ 및 Bax의 널 (null) 대립 유전자. 백스 - / -, 실험 질문에 따라 : - - /와의 TrkA taulacZ / taulacZ 백스 : 실험 배아의 유전형의 TrkA taulacZ / WT 있습니다. tauLacZ 기자가없는 배아 축삭 염색 부정적으로 사용되므로 염색 과정을 교정하는 부정적인 컨트롤을 제공 할 수 있습니다.
3. 배아 염색
- 3.8 - 섹션 3.2에서 아래와 같이 일부 수정과의 lacZ 염색 상용 키트를 사용합니다. 여기에, 밀리 포아 키트를 사용합니다.
- 실온에서 부드럽게 흔들어, 적어도 1 시간 동안 버퍼의 배아를 담근다.
- 직접 실온에서 부드럽게 흔들어, 적어도 15 분 동안 버퍼 B의 배아를 체험.
- 배아는 버퍼 A / B, 37 ° C에서 미리 따뜻한 조직 염기 용액에있는 동안. 배아 당 조직 염기 용액 5 mL를 사용합니다.
- 배아 버퍼 A / B에있는 동안, 신선한 5-BR 준비omo- 100 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 40 ㎎ / ㎖의 농도로 -3- 인돌 α-D-갈 락토 (X-GAL) -4- 클로로.
- 1 mg / ml의 농도로 예열 된 티슈베이스 용액에 X-gal을 희석시키고 유리 섬광 바이알로 X-GAL / 티슈베이스 혼합물을 5 mL를 추가한다.
- X-GAL / 티슈베이스를 함유하는 혼합물을 유리 섬광 바이알로 배아를 전송합니다. 파라 필름으로 뚜껑을 밀봉 파란색 얼룩의 존재를 확인, 37 ℃에서 하룻밤 배양한다.
- 신선한 4 % PFA, pH가 7.4 후위 배아. 조심스럽게 4 ° C에서 4 시간 동안 흔들.
- 차가운 PBS에 두 번 배아를 씻어.
4. 조직 탈수 및 지우기
- 유리 바이알에서 흔들면서 실온에서 30 분 동안 50 % 메탄올 / 50 % PBS 액에 넣어 배아.
- 유리 바이알에서 흔들면서 실온에서 30 분 동안 75 % 메탄올 / 25 % PBS 탈수 계속.
- 90 % 탈수 계속 메탄올 / 10 % P유리 바이알에서 흔들면서 실온에서 30 분 동안 BS.
- 유리 바이알에서 흔들면서 실온에서 30 분 (2 배), 100 % 메탄올 탈수 계속.
- 1 (V : V) 벤조일 알코올 벤조일 벤조 에이트의 혼합물 배아 탈수하는 동안, 1을 제조.
참고 : 벤조일 알코올과 벤조일 벤조 에이트는 독성이다. - 1 : 1 배아를 담가 (V : V) 100 % 메탄올의 혼합물 : 15 분 동안 100 % BABB. BABB 플라스틱을 용해하기 때문에 만 유리를 사용합니다.
- 완전히 투명 조직 100 % BABB에서 배아를 담그고 삭제 배아에서 X-여자 염색을 시각화 할 수 있습니다.
참고 : 가능한 한 빨리 X-여자의 얼룩은 시간이 지남에 따라 퇴색하기 때문에 이미지.
5. 전체 마운트 이미지
- 사진 사용하여 금속 집게에 대한 적절한 각도로, 100 % BABB에 몰입 배아를 안정화. 점등 미만 광용 광원의 조합을 사용 밝히는.
- 해부 현미경으로 이미지를 수집디지털 카메라로 복. 0.5 mm 떨어져 Z 축을 따라 다섯 연속 초점면에 여러 시야 노출을 가져 가라. 노출 시간과 F-정거장 조명 및 카메라 사양에 따라 다를 수 있으며 각 설정에 최적화 될 필요가있다.
- 오버레이 된 영상을 가공 및 포토 몽타주를 생성하는 기준 화상 처리 소프트웨어를 사용한다.
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Representative Results
의 TrkA WT / taulacZ의 유전자형 : 백스 - / -과의 TrkA taulacZ / taulacZ : 백스 - / - 배아가 명확하게 표준 PCR 유전형에 의해 결정될 수있다 (그림 1). X-여자 염색 디스플레이는 통상적으로 염색 배아 (그림 2, 3A)에 피하 주변 축삭 아버을 자세히 설명하고, 조직 제거한 후 배아에 걸쳐 (그림 3B, 4).
- / - 라인 신경 세포 고유의 네 스틴 프로모터 (17)의 제어하에 구조적으로 키나제 활성화 된 B-RAF (V600E) 돌연변이 (LSL-kaBraf 16)를 운반하는 쥐, 구하는 LSL- 백스 : 우리의 TrkA WT / taulacZ을 사육했다 kaBraf :의 TrkA taulacZ / taulacZ : 백스 - / - 마우스. 완전히의 TrkA 신호 부족이 배아에서, 침해 수용체 주변 돌기의 형태는 그럼에도 불구하고 거의 일반적으로 (그림 4)를 개발했다. 이 보여- / - 유전 적 배경 신호의 TrkA 의존 생존 손실 치환 B-RAF도 주연 축삭 성장 시그널링 등에 대한 SA 중요한 기능은 생존과의 TrkA 시그널링의 기능을 촉진 축삭 성장은 Bax와 함께, 분리 될 수 있다는 것을 보여준다 .
그림 1 : 형질 전환 마우스의 유전자형 대표 아가 로스 젤 이미지.. 샘플 1 :의 TrkA WT / taulacZ : 백스 WT / -, 샘플 2 :의 TrkA taulacZ / taulacZ : 백스 - / -, 샘플 3 :의 TrkA WT / taulacZ : 백스 - / -.
그림 2 : E18.5의 TrkA WT / taulacZ 마우스 X-여자 염색 삼차 신경의 축삭 돌기를 몸통과 HEA에.D는 해제되지 않은 배아에 표시됩니다. 스케일 바 : 1mm.
그림 3 :. E18.5의 TrkA WT / taulacZ의 전에 X-여자 (A)로 염색 마우스와 중간 몸통에 DRGs에서 BABB 계획으로 삭제 후 (B)가 표시됩니다. 스케일 바 : 2mm.
그림 4 : E16.5 LSL - kaBraf :의 TrkA taulacZ / taulacZ : 백스 - / - :. X-여자 염색과 BABB kaBraf으로 삭제 스틴-Cre 호텔 마우스 배아 키나제 활성화 B-RAF 키나제 단백질을 암호화, B-RAF V600E. DRG 뉴런에서 KAB-RAF의 발현의 TrkA 신호가없는 상태에서 정상 축삭 확장에 가까운 전체 길이, 결과. 스케일 바 : 1mm. 컨트롤을 포함하여 더 많은 이미지를 들어, 심판을 참조하십시오. 15, 그림2.
| PCR에 사용 된 프라이머 유전자형 | ||
| (1) | 의 TrkA | DNA 단편의 크기 : 400 bp의 |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC TGC GCG의 GCT CTG CCA GGG TG | |
| 이 | 백스 | DNA 단편의 크기 : 304 BP (야생형), (507) BP (Bax의 널 (null)) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA의 TCA의 GAA CCA TCA TG | |
| NeoR | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | DNA 단편의 크기 : 360 bp의 |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC의 AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
표 1 : 유전자형 PCR에 사용하는 프라이머.
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Discussion
배아의 TrkA taulacZ 마우스의 상술 한 X-GAL 염색 과정은 그대로 고정 배아에서 장거리 축삭 돌기 신속하고 상세한 시각화한다. 이 마우스가 축삭의 성장과 생존의 연결 모두에 기여할 수있는 메커니즘을 신호의 프로빙을 허용 백스 널 배경 때문에. 관심의 유전자 변형 또는 녹아웃 쥐와 교미하는 축삭 표현형의 종합적인 평가를 할 수 있으며 더 자세한 방식으로 축삭의 성장 신호를 검사 할 미래의 실험에 유용한 가이드를 제공 할 수 있습니다. 생체 축삭의 성장 연구를위한 주요 과제는 조직을 준비하는 시간이다 섹션과 어느 한 유전자 조작에 의해 다양한 방식으로 영향을받을 수 성장 축삭의 복잡한 표현형을 평가. 의 TrkA taulacZ은 / taulacZ : 백스 - /이 - 라인은 유전자의 전체 효과의 평가를 할 수 있습니다주변 침해 수용체 축삭 개발에 관심.
기법은 일반적으로 초기 발달 단계 동안의 TrkA를 발현 할 침해 수용체 축삭 궤적 시각화에 한정된다. 주연 침해 수용체에 더하여, 이것은 교감 기저 전뇌 콜린성 돌기를 시각화하는 것이 가능할 수있다; 그러나 이는 염색 기법 별 최적화를 필요
조직 청소는 여기에 설명 된 프로토콜의 핵심 단계이다. 그것은 전체 마운트 준비에 깊은 거짓말을 돌기 때문에 별개의 표현형의 잠재적 식별의 세부 평가를 할 수 있습니다. 우리가 발견했기 때문에 이러한 TdTomato 또는 GFP 기자 18, 19, 형광 기자, 특정 조건에서 시각적 선명도를 제공 할 수 있습니다, 그러나 그것은 X-여자 염색과 달리, 형광 신호가 동안 실질적으로 퇴색하는 것이 전체 마운트 이미지를 획득하기가 어렵습니다 조직의 청산 절차. DII염색도 널리 축삭 라벨 (20)에 사용됩니다; 단점은 선택적으로 예컨대 여기 섬유 통각 수용기로서 축삭 특정 아형 레이블 수 없다고하고, 그 주위에 충분히 긴 궤적 라벨을하는 것이 곤란하다.
요약하면, 우리는 마우스 배아에서 통각 축삭 전체 정자 루틴 시각화를 허용하도록 두 유전자 변형 마우스 라인의 조합을 사용하는 프로토콜을 제공한다.
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Acknowledgments
저자는 통찰력 토론과 제안의 TrkA taulacZ 마우스 박사 아네트 마르쿠스 박사 루이스 레이 차트에 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 버크 재단뿐만 아니라 화이트 홀 재단 연구비 2010-08-61, 생명 재단 (WFL-US-028 / 14) 날개에서 연구 지원 사업 시작 기금에 의해 지원되었다,에서 ZB1-1102-1을 부여 크리스토퍼 & 데이나 리브 재단과 JZ에 국립 안과 연구소의 보조금 1R01EY022409과 3R01EY022409-01S1. KJO는 골드 스미스의 동료입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
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