Abstract
Visualiseringen av fullängds neuronala prognoser i embryon är viktigt att få en förståelse för hur däggdjur neuronala nätverk utvecklas. Här beskriver vi en metod för att märka på plats en delmängd av dorsala ganglion (DRG) axon prognoser för att bedöma sina fenotypiska egenskaper med hjälp av flera genmanipulerade mus linjer. TrkA-positiva neuroner är Nociceptor neuroner, tillägnad överföringen av smärtsignaler. Vi använder ett TrkA taulacZ mus linje att märka banor alla TrkA- positiva perifera axoner i intakta musen embryot. Vi föder ytterligare TrkA taulacZ linjen på en Bax null bakgrund, som i huvudsak upphäver neuronal apoptos, i syfte att bedöma tillväxtrelaterade frågor oberoende av eventuella effekter av genetiska manipulationer på neuronal överlevnad. Därefter är genetiskt modifierade möss av intresse uppvuxna med TrkA TaulACZ / Bax null linje och är sedan redo för studie med de tekniker som beskrivs häri. Presentationen innehåller detaljerad information om mus avelsplaner, genotypning vid tidpunkten för dissektion, förberedelse vävnad, färgning och clearing för att möjliggöra visualisering av full längd axonal banor i hela montering förberedelser.
Introduction
Etablering av exakta neuronala nät är en komplex utvecklingsprocess väsentligt för funktionaliteten av nervsystemet. Störningar i denna process leder till neuronal dysfunktion som har varit inblandad i humana neurologiska sjukdomar 1-3. För att studera de bakomliggande molekylära mekanismer axontillväxt och mål innervation hos däggdjur, har vi utvecklat ett protokoll för att visualisera axonal banor TrkA-uttryck sensoriska neuroner med en kombination av två genetiskt modifierade mus linjer.
TrkA är en receptor för nervtillväxtfaktorn NGF och är en funktionell markör för nociceptiva sensoriska neuroner 4. TrkA starkt uttryck i nociceptiva neuroner under tidig utveckling och förmedlar NGF-beroende neuron överlevnad, axontillväxt, arborization och mål innervation 5-9. I TrkA taulacZ möss, är den vilda typen TrkA-genen ersatt av en taulacZ uttrycks cassette 10, så att den axonal morfologi av förmodade TrkA-positiva neuroner kan visualiseras genom β-gal (X-gal) färgning 11. Med hjälp av en heterozygot TrkA taulacZ / WT linje, kan vi undersöka faktorer som kan reglera eller störa utvecklingen av sensoriska afferenta prognoser in vivo.
Dessutom är TrkA uttryck frånvarande i homozygota TrkA taulacZ / taulacZ möss, som därför kan användas för att bedöma axontillväxt främja mekanismer i frånvaro av NGF / TrkA signalering. Eftersom nociceptiva neuroner beroende NGF / TrkA signalering inte bara för Axon tillväxt, men också för att överleva, vi sysselsätter annan mus linje, saknar den pro-apoptotiska Bax genen, att hämma apoptos i embryonala DRG nervceller, rädda dem från celldöd som annars observerats i frånvaro av TrkA signalering. Den Bax - / - bakgrunds 12 möjliggör därmed för molecular dissekering av signalvägar som specifikt drabbar axontillväxt 7-9,13-15. I TrkA - / -: Bax - / - möss, DRG nervceller överlever, men sensoriska afferenta innervation i huden är helt avskaffade 14,15. Vi kan selektivt aktivera signalvägar för att fastställa sina respektive bidrag till utvecklingen av Axon prognoser. Nyttan av denna metod är att den tillåter en bedömning av förändringar i axonal tillväxt fenotyper när olika genetiska modifieringar föds på TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - eller TrkA taulacZ / WT: Bax - / - bakgrunder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla procedurer uppfyller NIH Guide för användning och skötsel av försöksdjur. Djuret Protokollet godkändes av IACUC vid Weill Cornell Medical College.
1. Vävnadsberedning
- Euthanize timed-graviditets honor genom cervikal dislokation 15. Dissekera embryonala E16 - E18 embryon från timed-graviditets honor och placera embryon individuellt i brunnarna i en 6-brunnsskål, fylld med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Skölj embryon i kall PBS.
- Ta bort en liten del av den fosterhinnan av embryot och plats i en pre-förberedd proteinas K-lösning för efterföljande genotypning. Alternativt, om amnionmembran förloras, ta bort en liten del av spetsen av embryot svansen och placera den i proteinas K-lösning
- Peta hål i huden runt embryot använder insekts stift (minst 100 per sida).
- Ta bort PBS och långsamt lägga färska 2% paraformaldehyd (PFA),pH 7,4, till brunnen.
- Skaka försiktigt för 2 timmar vid 4 ° C.
- Skölj embryon två gånger i PBS och förvaras i PBS vid 4 ° C fram till färgning.
2. Genotypning
- Fördjupa fostervatten membran eller embryo svansar i proteinas K blandning enligt tillverkarens anvisningar.
- Inkubera vid 56 ° C under 10 min.
- Utdrag DNA med hjälp av en kommersiellt tillgänglig DNA-rening kit.
- Ta 0,5 ul av de totala 200 jil renade genom-DNA-lösning, kombinera den med 0,5 | il av vardera av de genspecifika sense- och antisense-primrar (10 | iM), 2 ^ il dNTP-blandning (2,5 mM av dATP, dCTP, dGTP och dTTP) , 0,2 | il Taq-polymeras (5 U / pl) och 2 pl PCR-buffert (10 x), tillsätt H2O till en total volym av 20 | il.
OBS: Primersekvenser är följande (tabell 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR-fragning Längd: 400 baspar (bp).
Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR fragmentlängder: vildtyp, 304 bp; Bax null, 507 bp.
TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR fragment length: 360 bp. - Kör en PCR med följande program för TrkA: steg 1: 1 minut vid 95 ° C, steg 2: 10 sek vid 95 ° C, steg 3: 20 sek vid 68 ° C, steg 4: 30 sek vid 72 ° C. Upprepa steg 2-4 för 40 cykler.
- För LacZ och Bax, köra en PCR med följande program: steg 1: 1 minut vid 95 ° C, steg 2: 10 sek vid 95 ° C, steg 3: 1 min vid 54 ° C, steg 4: 1 min vid 72 ° C, upprepa steg 2-4 för 35 cykler.
- Kör PCR-prov på en 2% agarosgel vid 100 V i 1 x Tris-Acetat-EDTA-buffert under 20 min med ett körfält av DNA-stege för att bedöma fragmentlängder.
- Analysera embryon för förekomst av vildtyp TrkA, TRKA-tauLacZ och Bax noll-alleler. De genotyper av experimentella embryon är TrkA taulacZ / WT: Bax - / - och TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, beroende på de experimentella frågor. Embryon saknar tauLacZ reportern blir negativ för axonal färgning och kan därför tjäna som negativa kontroller för att kalibrera färgningsprocessen.
3. Embryo Färgning
- Använd ett kommersiellt kit för lacZ färgning med några ändringar som beskrivs nedan i avsnitt 3,2-3,8. Här använder Millipore kit.
- Doppa embryon i Buffert A under minst en timme, lätt skakning vid rumstemperatur.
- Direkt fördjupa embryon i buffert B under minst 15 min, lätt skakning vid rumstemperatur.
- Medan embryon är i Buffert A / B, i förväg varm Tissue baslösning vid 37 ° C. Använd 5 ml Tissue Base lösning per embryo.
- Medan embryon är i buffert A / B, bered nya 5-bromo- 4- klor- 3- indolyl α-D-galaktopyranosid (X-gal) vid en koncentration av 40 mg / ml i 100% dimetylsulfoxid (DMSO).
- Späd X-gal in den förvärmda mjukrålösning vid en koncentration av 1 mg / ml och tillsätt 5 ml X-gal / mjukråblandningen till en glasscintillationsbehållare.
- Överför embryon till en glasscintillationsflaska innehåller X-gal / Tissue Base blandning. Täta lock med Parafilm och inkubera vid 37 ° C över natten, kontroll för närvaron av blånad.
- Postfix embryon med färsk 4% PFA, pH 7,4. Skaka försiktigt under 4 h vid 4 ° C.
- Skölj embryon två gånger i kall PBS.
4. Vävnads Uttorkning och clearing
- Placera embryon i 50% metanol / 50% PBS blandning för 30 min vid rumstemperatur, skaka i glasflaskorna.
- Fortsätt att dehydratisera i 75% metanol / 25% PBS under 30 min vid rumstemperatur, skakning i glasflaskor.
- Fortsätt att torka i 90% metanol / 10% PBS för 30 min vid rumstemperatur, skaka i glasflaskor.
- Fortsätt att dehydratisera i 100% metanol under 30 minuter (2x) vid rumstemperatur, skakning i glasflaskor.
- Medan embryon dehydratisering, bereda en 1: 1 (v: v) blandning av bensoylperoxid alkohol och bensoylbensoat.
OBS: Benzoyl alkohol och bensoylbensoat är giftigt. - Doppa embryon i ett: 1 (volym: volym) blandning av 100% metanol: 100% BABB under 15 min. Använd endast glas eftersom BABB löser plast.
- Fördjupa embryon i 100% BABB att helt klart vävnaden och att visualisera X-gal färgning i rensas embryot.
OBS: Bild som snart som möjligt eftersom X-gal-färgning kommer att blekna med tiden.
5. Hela Mount Imaging
- Stabilisera embryot, nedsänkt i 100% BABB, vid lämpliga vinklar för fotografering med hjälp av metall pincett. Illuminate att använda en kombination av upp-ljus och under-light ljus källor.
- Hämta bilder med en dissekera mikroskoputrustad med en digital kamera. Ta flera ljusa fältexponeringar vid fem på varandra fokalplan 0,5 mm från varandra längs Z-axeln. Exponeringstider och bländarsteg kan variera beroende på belysning och kamera specifikationer och måste optimeras för varje installation.
- Använd standard bildbehandlingsprogram för att bearbeta overlay bilder och generera fotomontage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De genotyper av TrkA WT / taulacZ: Bax - / - och TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - embryon kan entydigt bestämmas genom standard-PCR genotypning (Figur 1). X-gal-färgning visar detaljerad perifera axonala arbors subkutant i konventionellt färgade embryon (figurerna 2, 3a), och genom hela embryot efter vävnads clearing (fig 3b, 4).
Vi har fött TrkA WT / taulacZ: Bax - / - linje med möss som bär den konstitutivt kinas-aktiverade B-RAF (V600E) mutationen (LSL-kaBraf 16) under styrning av den nervcellsspecifika nestin promotor 17, för att erhålla LSL- kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - möss. I dessa embryon, vilket helt saknar TrkA signalering, utvecklat morfologi Nociceptor perifera projektioner ändå nästan normalt (fig 4). Detta visarsa avgörande funktion för B-RAF signalering i perifert axontillväxt, och även visar att överlevnaden och axon-tillväxtbefrämjande funktioner TrkA signalering kan separeras, med Bax - / - genetisk bakgrund ersätter förlusten av TrkA-beroende överlevnad signalering .
Figur 1: Genotypning av de transgena möss Representativa agarosgel bilder.. Prov 1: TrkA WT / taulacZ: Bax WT / -, prov 2: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, prov 3: TrkA WT / taulacZ: Bax - / -.
Figur 2: E18.5 TrkA WT / taulacZ mus färgades med X-gal Axon utsprång från trigeminala ganglia i bål och hea.d visas i en icke avräknade embryo. Skala bar: 1 mm.
Figur 3:. E18.5 TrkA WT / taulacZ musen färgas med X-gal (A) före och (B) efter röjning med Babb Prognoser från DRG i mitten torso visas. Skala bar: 2 mm.
Figur 4: Ett E16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -:. Nestin-Cre musembryo färgades med X-gal och rensas med BABB kaBraf kodar en kinas aktiverade B-RAF-kinas-protein, B-RAF V600E. Expression av Kab-RAF i DRG-neuroner gav fullängds, nära det normala axonet förlängning i frånvaro av TrkA-signalering. Skala bar: 1 mm. För fler bilder, inklusive kontroller, se ref. 15, figur2.
| Primrar som användes för PCR-genotypning | ||
| 1 | TrkA | DNA-fragmentstorlek: 400 bp |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Bax | DNA-fragment Storlek: 304 bp (vildtyp), 507 bp (Bax null) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| NeoR | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | DNA-fragment Storlek: 360 bp |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
Tabell 1: Primers som används för PCR genotypning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovan beskrivna X-gal färgningsprocedur av embryonala TrkA taulacZ möss möjliggör snabb och detaljerad visualisering av långväga axon prognoser i intakta fasta embryot. På grund av Bax null bakgrunden dessa möss möjliggöra sondering av signalering mekanismer som kan bidra till både axontillväxt och neuronal överlevnad. Parning med transgena eller knockout-möss av intresse möjliggör omfattande bedömning av axonal fenotyper och kan tjäna som användbar guide för framtida experiment för att undersöka axontillväxt signalering på ett mer detaljerat sätt. En stor utmaning för in vivo axontillväxt studier är det dags att förbereda vävnad sektioner och utvärdera komplexa fenotyper av växande axoner som kan påverkas på flera sätt av någon genetisk manipulation. Den TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - line möjliggör utvärdering av den fulla effekten av en genav ränta på perifer Nociceptor Axon utveckling.
Tekniken är begränsad till visualisering av Nociceptor axonala banor som normalt skulle uttrycka TrkA under de tidiga utvecklingsstadierna. Förutom de perifera nociceptorer, kan det vara möjligt att visualisera sympatiska och basala framhjärnan kolinerga projektioner; men detta skulle kräva särskilda optimering av färgningsteknik
Vävnads clearing är ett viktigt steg i det protokoll som beskrivs här. Det möjliggör detaljerad bedömning av djupare liggande prognoser i hela monterade preparat och därmed den potentiella identifiera distinkta fenotyper. Fluorescerande reportrar, såsom tdTomato eller GFP reportrar 18,19, kan erbjuda visuell klarhet under vissa förutsättningar, men det är svårt att få hela-mount image eftersom vi har funnit att i motsats till X-gal färgning, fluorescerande signaler blekna kraftigt under vävnaden clearingförfarandet. Dilfärgning används också ofta för Axon märkning 20; dess brister är att det inte selektivt kan märka en viss subtyp av axoner såsom Nociceptor fibrerna här, och det är svårt att helt märka långa banor i periferin.
Sammanfattningsvis erbjuder vi ett protokoll som använder en kombination av två genetiskt modifierade mus linjer för att möjliggöra rutin visualisering av hela hållare av nociceptiva axoner i musen embryot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Louis Reichardt för TrkA taulacZ möss och Dr Annette Markus för insikts diskussion och förslag. Detta arbete stöddes av start medel från Burke Foundation samt Whitehall Foundation forskningsanslag 2010-08-61, ett forskningsanslag från Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), bevilja ZB1-1102-1 från Christopher & Dana Reeve Foundation och bidrag 1R01EY022409 och 3R01EY022409-01S1 från National Eye Institute, till JZ. KJO är en guldsmed karl.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
